裴小娜，黃山

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042)

生姜為姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的根莖，是一種使用歷史悠久的香辛調(diào)味料，也是一種應(yīng)用廣泛的中藥，具有祛寒除濕、祛風(fēng)止痛、溫經(jīng)通絡(luò)功效［1］。生姜的化學(xué)成分較復(fù)雜，現(xiàn)代藥理研究表明，生姜揮發(fā)油具有明顯的抗炎、清除自由基、降血脂、抗胃潰瘍、止嘔和防止血栓形成等作用［2-3］。生姜揮發(fā)油的提取方法較多，除傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法外，一些新技術(shù)也有應(yīng)用，如超高壓提?。?］、超聲波提?。?］、超臨界CO2萃取等［6］，這些新技術(shù)的揮發(fā)油提取率高于單純的水蒸氣蒸餾法，但也存在生產(chǎn)設(shè)備成本高、工藝條件復(fù)雜、推廣有難度等缺點(diǎn)。酶法輔助水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油作為一種新工藝，近年來(lái)已有研究［7-8］，較之傳統(tǒng)方法，酶法輔助提取具有提取時(shí)間短、工藝簡(jiǎn)單、能耗低、有效成分破壞少、經(jīng)濟(jì)安全等優(yōu)點(diǎn)，此外，一般廠家現(xiàn)有設(shè)備就可滿足生產(chǎn)要求，不需要增加新設(shè)備，可有效控制生產(chǎn)成本。因此，本文從方便今后規(guī)?；a(chǎn)的實(shí)際出發(fā)，以生姜揮發(fā)油為實(shí)驗(yàn)體系，采用酶法輔助水蒸氣蒸餾法提取，為了對(duì)本方法的多因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，并能快速有效的確定最優(yōu)條件，擬在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法考察酶法輔助提取對(duì)揮發(fā)油得率的影響，并通過(guò)DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)以及脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)驗(yàn)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

鮮生姜;纖維素酶(5 萬(wàn)U/g);果膠酶(10 萬(wàn)U/g);木瓜蛋白酶(80 萬(wàn)U/g);木聚糖酶(5 萬(wàn)U/g);α-淀粉酶(2 萬(wàn)U/g);β-葡聚糖酶(2 萬(wàn)U/g);DPPH 試劑;其余試劑均為分析純。

RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;FA1004 型電子天平;HH-2 水浴鍋;PXS-270 pH 計(jì);UV8100 型紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 酶法輔助提取生姜揮發(fā)油

1.2.1 生姜的預(yù)處理鮮生姜洗凈、切片，60 ℃干燥至含水量到12%以下，粉碎并過(guò)60 目篩。

1.2.2 酶解稱取姜粉100 g，加入1 L 水，調(diào)節(jié)pH 值5.0。按一定姜粉質(zhì)量比例稱取酶，配成酶溶液，加入到姜粉溶液中，在50 ℃酶解2 h。

1.2.3 水蒸氣蒸餾采用水蒸氣蒸餾法，將酶解液共水蒸餾提取3 h，收集揮發(fā)油，并計(jì)算生姜揮發(fā)油得率。

1.3 生姜揮發(fā)油抗氧化活性研究

1.3.1 生姜揮發(fā)油對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用［9-10］

1.3.2 生姜揮發(fā)油對(duì)DPPH·自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)資料［11-13］，反應(yīng)完全后，以95%乙醇作空白，于517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。平行測(cè)定3 次，取平均值。DPPH·自由基清除率計(jì)算公式如下:

式中 A0——DPPH·溶液4 mL 加無(wú)水乙醇4 mL的吸光度;

A1——DPPH·溶液4 mL 加樣品溶液4 mL的吸光度;

A2——樣品溶液4 mL 加無(wú)水乙醇4 mL 的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶法提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶種類對(duì)提取率的影響稱取姜粉100 g(7 份)，調(diào)節(jié)pH 值4.75，分別加入不同種類酶溶液(各種酶的使用量見表1)，同時(shí)，進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在50 ℃水浴中酶解2 h，水蒸氣蒸餾3 h，提取生姜揮發(fā)油，結(jié)果見表1。

表1 酶種類篩選Table 1 Screening enzyme species

由表1 可知，單獨(dú)采用纖維素酶輔助提取生姜揮發(fā)油，其得率最高，為3.49%，而纖維素酶與其他酶共同使用時(shí)，揮發(fā)油得率均較低。纖維素酶與其他種類的酶合用，有可能限制了纖維素酶的酶解活力。故單用纖維素酶作為提取酶。

2.1.2 酶用量對(duì)生姜揮發(fā)油提取率的影響由圖1 可知，揮發(fā)油的提取率隨著酶用量的增加而提高，在酶用量1.0% ～2.0%時(shí)達(dá)最高，超過(guò)2.0%后，生姜揮發(fā)油提取率隨之下降，所以確定酶用量為2.0%。

圖1 酶用量對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on volatile oil yield

2.1.3 酶解溫度對(duì)生姜揮發(fā)油提取率的影響由圖2 可知，在30 ～50 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，揮發(fā)油得率增加，50 ℃時(shí)達(dá)最高，超過(guò)50 ℃，隨著溫度的升高得率反而下降。因此，確定酶解溫度為50 ℃。

圖2 酶解溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of enzymatic temperature on volatile oil yield

2.1.4 酶解pH 對(duì)生姜揮發(fā)油提取率的影響由圖3 可知，在pH 值4 ～6 范圍內(nèi)，隨著pH 值的升高，揮發(fā)油得率增加，pH=6 時(shí)達(dá)最高;pH ＞6 時(shí)，隨著pH 值的升高得率反而降低。所以，纖維素酶反應(yīng)的pH 值為6.0。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)生姜揮發(fā)油提取率的影響由圖4 可知，揮發(fā)油提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)，≥2 h 時(shí)生姜精油提取率趨于穩(wěn)定，故選取酶解時(shí)間2 h 為宜。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of enzymatic time on volatile oil yield

2.2 酶法提取工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用statistica 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行3 因素5 水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇單因素實(shí)驗(yàn)中影響顯著的3 個(gè)因素酶解pH 值、酶用量、酶解溫度為自變量，生姜揮發(fā)油得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)因素及水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 The table of central composite designing factors and levels

通過(guò)statistica 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表3 數(shù)據(jù)做回歸分析，得回歸方程:Y =－27. 928 4 +2. 168 2X1+8.384 5X2+ 0. 171 5X3－0. 390 1X1X1－0.682 8 X2X2－0.001 3X3X3－0.017 2X1X2－0.010 1X1X3－0.002 6X2X3，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The experimental result

回歸分析表明，模型回歸顯著(P ＜0.05)，決定系數(shù)R2=97.59%，說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)值擬合較好，可用于生姜揮發(fā)油得率的理論預(yù)測(cè)。方差分析結(jié)果表明，影響生姜揮發(fā)油得率的各因素按影響大小排列依次為:X3＞X2＞X1;X2X3的二項(xiàng)式系數(shù)的P ＜0.05，無(wú)顯著性差異，所以二者對(duì)生姜揮發(fā)油得率的影響存在交互作用。因此，各因素對(duì)生姜揮發(fā)油得率的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)面分析根據(jù)回歸方程作出響應(yīng)面和等高線，結(jié)果見圖5 ～圖10?？疾鞌M合響應(yīng)面的形狀，分析酶解溫度、酶解pH、酶用量對(duì)揮發(fā)油提取率的影響。從等高線圖可知，極值條件應(yīng)在圓心處，酶解溫度X3為最顯著因素，表現(xiàn)為等高線更為陡峭;酶解pH 次之，表現(xiàn)為等高線曲線較平滑。酶法提取生姜揮發(fā)油的最優(yōu)提取條件為:酶用量為2.0%，酶解pH 為6.0，酶解溫度為50 ℃時(shí)，揮發(fā)油的得率最高預(yù)測(cè)值為3.90%。根據(jù)確定的最優(yōu)提取工藝，分別取3 份樣品，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平均提取率為3.86%，證明該方法可靠。李曉等［14］采用單純酶法提取生姜揮發(fā)油其提取率為0.39%，周玉東等［15］單純利用水蒸氣蒸餾法提取，提取5 h，最高提取率為2.4%。說(shuō)明此方法能顯著減少水蒸氣蒸餾的時(shí)間、節(jié)約能源，同時(shí)提高了生姜揮發(fā)油的提取率。

圖5 酶用量和酶解pH 對(duì)提取率的效應(yīng)曲面分析Fig.5 Enzyme dosage and pH on volatile oil yield of surface analysis

圖6 酶用量和酶解pH 對(duì)提取率的等高線圖分析Fig.6 Enzyme dosage and pH on volatile oil yield of contour map analysis

圖7 酶解pH 和酶解溫度對(duì)提取率的效應(yīng)曲面分析Fig.7 pH and enzymatic temperature on volatile oil yield of surface analysis

圖8 酶解pH 和酶解溫度對(duì)提取率的等高線圖分析Fig.8 pH and enzymatic temperature on volatile oil yield of contour map analysis

圖9 酶用量和酶解溫度對(duì)提取率的效應(yīng)曲面分析Fig.9 Enzyme dosage and enzymatic temperature on volatile oil yield of surface analysis

圖10 酶用量和酶解溫度對(duì)提取率的等高線圖分析Fig.10 Enzyme dosage and enzymatic temperature on volatile oil yield of contour map analysis

2.3 生姜揮發(fā)油的抗氧化活性研究

2.3.1 生姜揮發(fā)油對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用由圖11 可知，生姜揮發(fā)油對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化具有抑制作用，其活性隨著濃度的提高而增強(qiáng)。其IC50為109.37 g/L。

圖11 生姜揮發(fā)油對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig.11 Inhibitory effect of volatile oil from ginger on lipid peroxidation

2.3.2 生姜揮發(fā)油對(duì)DPPH·自由基的清除由圖12 可知，生姜揮發(fā)油對(duì)DPPH·自由基的清除率隨著其濃度的增加而增加，這表明生姜揮發(fā)油具有一定的清除DPPH·自由基的能力。生姜揮發(fā)油對(duì)DPPH·自由基清除率的IC50為3.73 g/L。

圖12 生姜揮發(fā)油對(duì)DPPH·自由基的清除率Fig.12 DPPH·radical scavenging of volatile oil from ginger

3 結(jié)論

(1)以酶法輔助水蒸氣蒸餾法提取生姜揮發(fā)油的最佳工藝條件為:纖維素酶作為提取酶，酶用量為2.0%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間2 h，酶解pH 6.0，水蒸氣蒸餾時(shí)間3 h，生姜揮發(fā)油的提取率可以達(dá)到3.86%。

(2)生姜揮發(fā)油具有一定的抗氧化活性，說(shuō)明生姜揮發(fā)油是一種較好的天然抗氧化劑，由于生姜產(chǎn)量大、價(jià)格相對(duì)較低，因而具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用前景。

［1］ 胡煒彥，張榮平，唐麗萍，等. 生姜化學(xué)和藥理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2008(9):10-14.

［2］ Bhandari U，Sharma J N，Zafar R.The protective action of ethanolic ginger (Zingiber officinale)extract in cholesterol fed rabbits［J］. J Ethnopharmacol，1998，61(2):167-171.

［3］ Lee H S，Seo E Y，Kang N E，et al.6-Gingerol inhibits metastasis of MDA-MB-231 human breast cancer cells［J］. The Journal of Nutritional Biochemistry，2008，19(5):313-319.

［4］ 縱偉，雷麗. 響應(yīng)面法優(yōu)化生姜精油超高壓提取工藝的研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2008，8(8):55-57.

［5］ 崔大明，孟凡欣，吳麗艷，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取生姜揮發(fā)油工藝的研究［J］. 中國(guó)調(diào)味品，2011，35(5):54-56.

［6］ 徐偉，石海英，徐曉艷，等.超臨界CO2萃取生姜油的模型方程和條件優(yōu)化［J］. 食品研究與開發(fā)，2010，31(4):8-13.

［7］ Zu Y G，Wang Y，F(xiàn)u Y J，et al. Enzyme-assisted extraction of paolitaxel and related taxanes from needles of taxus chinensis［J］.Sep Purif Technol，2009，68(2):238-243.

［8］ Chen S，Xing X H，Huang J J，et al.Enzyme-assisted extraction of flavonoid from ginkgo biloba leaves:Improvement effect of flavonol transglycosylation catalyzed by penicillium decumbens cellulase［J］.Enzyme Microb Technol，2011，48(1):100-105.

［9］ 唐暉慧，金美東. 瓊產(chǎn)艾納香葉精油的抗氧化和抗菌活性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(6):47-52.

［10］余曉紅，尹永祺，顧振新.海蓬子正丁醇萃取物的體外抗氧化性研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(12):118-121，124.

［11］姜愛麗，孟憲軍，胡文忠，等. 不同北高叢藍(lán)莓品種的抗氧化成分及其抗氧化活性［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(9):161-165.

［12］呂爽，田呈瑞，石慧. 不同干燥方法對(duì)薄荷多酚、總黃酮及抗氧化性的影響［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(5):112-116.

［13］梁俊玉，趙保堂，殷振雄，等. 核桃葉多酚的抗氧化活性測(cè)定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(11):171-174.

［14］李曉，劉艷芳.酶法提取生姜精油的研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2009，34(12):67-69.

［15］周玉東.蒸餾法制取姜油工藝參數(shù)的研究［J］.糧油加工，2008(8):49-50.