黃燕飛，廖海星，唐和清

(1.中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074;2.長江大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434020)

半胱氨酸是含硫氨基酸中的一種，也是生物體必需氨基酸中的一種，是多數(shù)蛋白質(zhì)和酶的空間結(jié)構(gòu)和功能組成部件的重要組成成分。由于半胱氨酸容易形成具有二硫鍵結(jié)構(gòu)的胱氨酸，或者是在含有半胱氨酸殘基的多肽中，容易形成二硫鍵，因此，對(duì)于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化并保持一定的功能具有重要的作用［1-3］。此外，它對(duì)于在細(xì)胞中維持氧化還原平衡，影響細(xì)胞生長、分化和增值具有重要作用的谷胱甘肽的產(chǎn)生也是必不可少的［4］，且有助于修復(fù)由甲基化試劑引起的DNA 損傷［5-6］。在生理?xiàng)l件下，巰基很容易去質(zhì)子化，其形成的巰基鹽是大多數(shù)蛋白質(zhì)中活性官能團(tuán)的來源。其中最常見的是巰基和二硫鍵間的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)，這一反應(yīng)涉及了細(xì)胞新陳代謝的許多方面，包括蛋白質(zhì)的折疊、電子的轉(zhuǎn)移，以及許多的調(diào)控機(jī)制［7-8］。

在研究多肽中半胱氨酸巰基的離子化以及S─H 與S─S 鍵間相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)的過程中，Bulaj 等采用反相高效液相色譜分離及UV 吸收檢測的方法，監(jiān)測了16 種典型多肽中半胱氨酸殘余巰基與4 種不同的二硫化物試劑之間的反應(yīng)，得到了巰基與二硫鍵間相互轉(zhuǎn)化的速率常數(shù)，并確定了靜電效應(yīng)是影響巰基與二硫鍵間相互轉(zhuǎn)化的主導(dǎo)因素。然而，此方法需要進(jìn)行大量的前處理工作和后續(xù)繁瑣的數(shù)據(jù)擬合處理，才能得到速率常數(shù)，進(jìn)而判斷S─H 與S─S 之間相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系。Watanabe 等［9］采用電化學(xué)和拉曼結(jié)合的方法，研究了胱氨酸(100 mmol/L 溶液)在銀電極上的氧化還原，發(fā)現(xiàn)當(dāng)電極電位到達(dá)－0.05 V 時(shí)，可觀察到502 cm－1處的S─S 鍵的伸縮振動(dòng)峰;隨著電極電位的降低，此峰強(qiáng)逐漸減弱，到－0.3 V 時(shí)消失;但當(dāng)電極電位逐漸向+0.3 V 正移時(shí)，此拉曼峰恢復(fù)可見并逐漸增強(qiáng)。這表明胱氨酸發(fā)生了準(zhǔn)可逆的二硫化物與硫醇間的電化學(xué)相互轉(zhuǎn)化。但是，在半胱氨酸溶液中并未觀察到上述現(xiàn)象。由于在實(shí)驗(yàn)方法上的困難，有關(guān)L-半胱氨酸與L-胱氨酸間相互轉(zhuǎn)化的直接研究還很少見。

隨著Raman 光譜儀制造技術(shù)的發(fā)展以及納米化表面拉曼增強(qiáng)(SERS)基底材料的開發(fā)，SERS 在監(jiān)控反應(yīng)過程中的應(yīng)用越來越方便。最近我們課題組開發(fā)了專門的高性能SERS 基底材料，并以此為基礎(chǔ)，提出了氨基酸檢測的高靈敏SERS 分析方法［10］。在本工作中，我們將采用石墨烯/納米銀(GO/Ag NPs)復(fù)合物為基底，利用SERS 技術(shù)，以L-半胱氨酸作為巰基試劑，探究了半胱氨酸與胱氨酸之間的巰基與二硫鍵的相互轉(zhuǎn)化，為探究實(shí)際生物體內(nèi)蛋白質(zhì)或多肽鏈間二硫鍵與巰基之間的相互轉(zhuǎn)化，維持生理平衡提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

硝酸銀、石墨、硼氫化鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、濃硫酸、高錳酸鉀、鹽酸羥胺均為分析純;L-半胱氨酸、L-胱氨酸均購于阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(＞18.2 MΩ·cm)。

Tecnai G220 S-TWIN 透射電子顯微鏡;Evolution 201 紫外可見分光光度計(jì);DXR Raman Microscope 激光共焦顯微拉曼;Micropure UV 超純水制備儀。

1.2 基底材料的制備

采用改進(jìn)的Hummers 法制備GO［11］，最終得到4.5 mg/mL 的分散液。在使用之前，先在70%功率的超聲清洗儀下超聲處理30 min。銀納米粒子(Ag NPs)則采用超聲輔助NH2OH·HCl 還原AgNO3的方法制備得到［12］。取適量的Ag NPs 懸濁液，加入一定體積的GO，得到GO 濃度為0. 01 mg/mL 的GO/Ag NPs 懸濁液，攪拌均勻后，靜置過夜。GO/Ag NPs 懸濁液呈堿性。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取100 μL GO/Ag NPs 復(fù)合材料加入到2 mL 不同濃度的半胱氨酸溶液中，攪拌混合均勻，靜置吸附30 min 后，取5 μL 滴在干凈的玻璃片上，環(huán)境條件下自然晾干。采用Thermo Fisher 的DXR Raman 對(duì)半胱氨酸與胱氨酸之間巰基與二硫鍵間的相互轉(zhuǎn)化進(jìn)行監(jiān)測，激光波長532 nm，激光能量10 mW，曝光時(shí)間5 s。文中如無特別說明，拉曼譜圖均是在相同條件下所得。

2 結(jié)果與討論

2.1 GO 和Ag NPs 的UV-Visible 分析

GO、Ag NPs 以及GO/Ag NPs 的紫外可見吸收光譜見圖1。

圖1 GO(a)，Ag NPs(b)及GO/Ag NPs(c)分散液的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-visible absorption spectra of (a)GO，(b)Ag NPs and (c)GO/Ag NPs dispersions

由圖1 可知，GO 在226 nm 處有一最大吸收峰，在約300 nm 有一肩峰，與文獻(xiàn)報(bào)道相符合［13］。銀納米粒子在425 nm 有最大吸收峰，當(dāng)GO 和Ag NPs復(fù)合之后，在437 nm 處出現(xiàn)了新峰。該峰為Ag 納米粒子的表面共振吸收峰［13］，說明GO 與Ag NPs形成了復(fù)合物。GO/Ag NPs 的TEM 見圖2。

圖2 GO/Ag NPs 的TEM 照片F(xiàn)ig.2 TEM image of the GO/Ag NPs composite

由圖2 可知，Ag NPs 較均勻地分布GO 表面，形成了復(fù)合物，與紫外可見吸收光譜的結(jié)果相吻合。

2.2 L-半胱氨酸(L-Cys)的Raman 研究

采用GO/Ag NPs 作為基底材料，在激光波長532 nm，激光能量10 mW，曝光時(shí)間5 s，測得的不同濃度半胱氨酸的拉曼光譜見圖3。

圖3 不同濃度L-半胱氨酸的Raman 譜圖Fig.3 Raman spectra of L-cysteine at different concentrations

由圖3 可知，在較高濃度下，L-半胱氨酸位于2 550 cm－1的特征峰清晰可見，而且強(qiáng)度相當(dāng)高，屬于S─H 的伸縮振動(dòng)［14］。當(dāng)L-半胱氨酸的濃度降低至10－3mol/L 時(shí)，2 550 cm－1處的峰幾乎消失，到10－4mol/L 時(shí)已完全檢測不到，但500 cm－1處卻出現(xiàn)了新的峰，屬于S─S 的伸縮振動(dòng)［14］。上述變化表明，隨著L-半胱氨酸濃度的降低，S─H 鍵趨于消失，而S─S 不斷增多。也就是說，該體系中存在S─H 鍵與S─S 鍵之間的相互轉(zhuǎn)化，半胱氨酸被轉(zhuǎn)化成了胱氨酸。

由于在本工作中，所用的GO/Ag NPs 懸浮液呈堿性(pH≈8.5)，當(dāng)L-半胱氨酸的濃度較高時(shí)，測試體系呈酸性，而當(dāng)L-半胱氨酸的濃度降低時(shí)，測試體系的pH 值將逐漸升高，接近GO/Ag NPs 懸浮液的初始pH 值(pH≈8.5)。例如，當(dāng)半胱氨酸的濃度為10－3mol/L 時(shí)，體系的pH 值已達(dá)到7.2，為弱堿性。考慮到L-半胱氨酸中的巰基(─SH)容易受到pH 的影響，上述觀察到的S─H 向S─S 轉(zhuǎn)化的濃度依存性可能實(shí)際上是pH 依存性。因此，選擇半胱氨酸濃度為10－2mol/L，采用HNO3將體系的pH值調(diào)節(jié)至酸性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖4 拉曼譜圖Fig.4 Raman spectra

圖5 不同pH 條件下L-半胱氨酸(10 －2 mol/L)的拉曼譜圖Fig.5 Raman spectra of L-cysteine (10 －2 mol/L)at different pH values

由圖5 可知，當(dāng)體系的pH 值由7.6 降至3.5時(shí)，S─H 的峰強(qiáng)逐漸增強(qiáng)，而S─S 的峰逐漸消失，與之前的假設(shè)相符，可以確定體系的pH 變化是致使2 550 cm－1和500 cm－1的峰發(fā)生變化的主要原因。并且，變化前2 550 cm－1的峰面積與變化后2 500 cm－1和500 cm－1的兩峰面積的加和具有1 ∶0.9 ～1 ∶1.1 的相關(guān)性?？梢姡?0－3mol/L 時(shí)得到的拉曼譜圖是半胱氨酸和胱氨酸兩混合物的拉曼譜圖。此外，關(guān)于激光誘導(dǎo)產(chǎn)生反應(yīng)的情況也已有報(bào)道［15］，因此，除了體系的pH 值能對(duì)巰基與二硫鍵間的相互轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響之外，檢測過程中使用的激光也可能成為誘導(dǎo)半胱氨酸轉(zhuǎn)化成胱氨酸的原因。為了避免因pH 變化帶來的影響，選擇半胱氨酸的濃度為10－2mol/L 時(shí)和半胱氨酸對(duì)照品作為在不同曝光時(shí)間下探討激光誘導(dǎo)反應(yīng)的體系來證實(shí)激光對(duì)半胱氨酸轉(zhuǎn)化成胱氨酸是否有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6、圖7。

圖6 不同曝光時(shí)間下半胱氨酸(10 －2 mol/L)的拉曼譜圖Fig.6 Raman spectra of L-cysteine (10 －2 mol/L)under different exposure time

圖7 不同曝光時(shí)間下半胱氨酸對(duì)照品的拉曼譜圖Fig.7 Raman spectra of L-cysteine reference substance in solid state under different exposure time

由圖6、圖7 可知，不管是在GO/Ag NPs 基底上10－2mol/L 時(shí)的L-半胱氨酸樣品，還是單純的L-半胱氨酸固體對(duì)照品，在激光曝光時(shí)間大大增加時(shí)，仍然沒有觀察到S─H 與S─S 之間的相互轉(zhuǎn)化，即沒有半胱氨酸與胱氨酸之間的相互轉(zhuǎn)化。由此，可以肯定，僅在激光輻照的條件下是不能夠?qū)Π腚装彼徂D(zhuǎn)化成胱氨酸產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的，體系pH 變化是導(dǎo)致半胱氨酸轉(zhuǎn)化成胱氨酸的主要因素(圖8)。

圖8 半胱氨酸與胱氨酸分子在銀納米粒子表面的吸附及相互轉(zhuǎn)化Fig.8 The adsorption and transformation of L-cysteine and L-cystine molecules on surface Ag nanoparticles

3 結(jié)論

采用GO/Ag NPs 復(fù)合材料作為拉曼光譜基底，監(jiān)測到了半胱氨酸與胱氨酸之間相互轉(zhuǎn)化的過程，并探究了產(chǎn)生這一相互轉(zhuǎn)化的主要原因，確定了在堿性條件下，有利于半胱氨酸與胱氨酸的相互轉(zhuǎn)化，并給出了可能的機(jī)理，為探究實(shí)際生物體系內(nèi)涉及巰基與二硫鍵間相互轉(zhuǎn)化的重要反應(yīng)提供了一定的參考依據(jù)。

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