馬艷艷 肖海雪 劉玉鵬 袁馥梅 李東曉 宋金青 李溪遠(yuǎn) 丁 圓 楊艷玲

1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院（青海西寧 810001）；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科（北京 100034）

兒童胱氨酸尿癥臨床及基因分析

馬艷艷1肖海雪1劉玉鵬2袁馥梅1李東曉2宋金青2李溪遠(yuǎn)2丁 圓2楊艷玲2

1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院（青海西寧 810001）；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科（北京 100034）

目的 探討以腎結(jié)石起病的胱氨酸尿癥患兒的臨床表現(xiàn)和基因突變。方法 回顧3例以腎結(jié)石起病的胱氨酸尿癥患兒的臨床資料，以及通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序測(cè)定的SLC3A1和SLC7A9基因結(jié)果。結(jié)果 3例男性患兒來(lái)自三個(gè)無(wú)關(guān)家系，2例于1歲時(shí)、1例于14歲時(shí)因腎結(jié)石就診。3例患兒的血氨基酸譜無(wú)異常，游離肉堿降低；尿氨基酸譜分析提示胱氨酸、鳥(niǎo)氨酸、精氨酸和蘇氨酸部分增高。基因分析證實(shí)1例為SLC7A9基因c.325G＞A純合突變，父母為c.325G＞A雜合突變的攜帶者；另2例均為SLC3A1基因復(fù)合雜合突變，分別為c.1365delG和c.1113C＞A復(fù)合雜合突變，c.1897_1898insTA和c.1093C＞T復(fù)合雜合突變，其父母均為雜合突變攜帶者。經(jīng)確診胱氨酸尿癥后，予枸櫞酸鉀、左卡尼汀等治療，患兒病情好轉(zhuǎn)。結(jié)論 對(duì)于腎結(jié)石患兒應(yīng)高度重視可能存在的遺傳代謝病，尿液氨基酸分析、基因檢測(cè)是確診胱氨酸尿癥的重要方法。

腎結(jié)石； 胱氨酸尿癥； 氨基酸； 遺傳代謝病

腎結(jié)石是腎臟疾病常見(jiàn)的臨床癥狀之一，胱氨酸結(jié)石是腎結(jié)石的一種，如果結(jié)石阻塞尿道可引起腎功能不全。胱氨酸在酸性和中性尿液中溶解度降低，在尿道中易形成結(jié)晶或結(jié)石。通常情況下腎小球?yàn)V過(guò)液中99%的胱氨酸在近端腎小管刷狀緣細(xì)胞被重吸收，當(dāng)尿中胱氨酸濃度超過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)負(fù)荷濃度的50%～200%或尿pH值降低時(shí)，胱氨酸可形成特有的六方結(jié)晶體[1]。胱氨酸尿癥是一種常染色體隱性遺傳病，因胱氨酸和一些二堿基氨基酸在近端腎小管或胃腸道重吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙導(dǎo)致的代謝障礙。1908年首次報(bào)道本病，隨著生化診斷技術(shù)的提高，有關(guān)胱氨酸尿癥的發(fā)病機(jī)制逐步明確，國(guó)內(nèi)對(duì)成人胱氨酸結(jié)石患者的診斷與排石治療研究較多[2-4]，關(guān)于兒童胱氨酸尿癥的臨床表現(xiàn)及分子遺傳學(xué)報(bào)道較少?，F(xiàn)就3例胱氨酸尿癥患兒的臨床經(jīng)過(guò)、生化和基因突變特點(diǎn)進(jìn)行分析探討。

1 臨床資料

3例患兒來(lái)自不同的家庭，無(wú)親緣關(guān)系，均為男性。例1，1歲時(shí)因腹瀉就診，查尿紅細(xì)胞增多而行腎臟超聲檢查，發(fā)現(xiàn)雙腎結(jié)石，尿液晶體檢查存在典型的六角形胱氨酸結(jié)晶；2歲時(shí)復(fù)查發(fā)現(xiàn)結(jié)石較前增大，于腹腔鏡下取石，此后服用甜菜堿和10%的枸櫞酸鉀維持治療，目前患兒6歲，智力運(yùn)動(dòng)及體格發(fā)育正常，體力好，夜尿不多，無(wú)腹痛、尿痛、血尿等異常。全身皮膚無(wú)黃染、皮疹及出血點(diǎn)，心肺及腹部檢查未見(jiàn)異常。例2，14歲時(shí)無(wú)明顯誘因右側(cè)腰痛2個(gè)月就診，無(wú)尿痛，無(wú)發(fā)熱、咳嗽和腹瀉；腎B超示雙腎髓質(zhì)鈣沉著，右腎充盈，輸尿管、膀胱未見(jiàn)異常，診斷為腎結(jié)石；尿液晶體檢查存在典型的六角形胱氨酸結(jié)晶，尿胱氨酸含量顯著增高，經(jīng)體外碎石治療后好轉(zhuǎn)，給予左卡尼汀1.0 g /d、甜菜堿1g /d、和10%的枸櫞酸鉀口服；6個(gè)月后復(fù)查，未發(fā)現(xiàn)新生結(jié)石，一般狀況良好。例3，1歲時(shí)因排尿時(shí)哭鬧3天就診，夜哭，不愿排尿，無(wú)發(fā)熱、腹瀉和咳嗽，曾有10余小時(shí)不能排尿，并自行排出0.5mm的結(jié)石；經(jīng)超聲檢查診斷為腎結(jié)石、尿道結(jié)石，經(jīng)尿道手術(shù)取石；術(shù)后3個(gè)月復(fù)診，左腎結(jié)石增大1.8 cm×0.2 cm，給予左卡尼汀1.0 g/d，甜菜堿1g/d和10%的枸櫞酸鉀，每日3次，每次10mL口服。患兒目前4歲，發(fā)育正常，腎結(jié)石無(wú)明顯增大（表1）。

采用液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血液氨基酸及酯酰肉堿譜，定量分析采用軟件ChemoView 1.2版本，根據(jù)同位素內(nèi)標(biāo)和各種丁酯化的氨基酸和?；鈮A的離子峰強(qiáng)度計(jì)算標(biāo)本中氨基酸和?；鈮A濃度[5]。收集患兒新鮮尿液5～10mL，先測(cè)定尿肌酐濃度，分取相當(dāng)于含0.2mg肌酐的尿樣，萃取有機(jī)酸，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀進(jìn)行有機(jī)酸測(cè)定[6]。3例患兒的血液總同型半胱氨酸均正常，鳥(niǎo)氨酸均降低，例2和例3的精氨酸降低，例2血蘇氨酸和甲硫氨酸降低。3例患兒的血液游離肉堿均輕度降低，酯酰肉堿譜正常；尿液草酸、甘油酸等有機(jī)酸正常，胱氨酸、鳥(niǎo)氨酸、精氨酸和蘇氨酸部分升高（表2）。

表 1 3例胱氨酸尿癥患兒臨床和生化特點(diǎn)

在知情同意的前提下，留取3例患兒及其父母靜脈血，使用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)DP318-03，離心柱型，200T，0.1～1 mL）提取外周血白細(xì)胞DNA。采用二代基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行胱氨酸尿癥相關(guān)基因分析。異常結(jié)果均經(jīng)一代測(cè)序驗(yàn)證。

3例患兒分別檢出SLC7A9或SLC3A1基因突變。例1為SLC7A9基因第4外顯子c.325G＞A純合突變，突變導(dǎo)致中性的天冬酰胺被酪氨酸替代。其父母為c.325G＞A突變攜帶者。例2和例3均檢出SLC3A1基因復(fù)合雜合突變，例2為SLC3A1基因c.1365delG和c.1113C＞A雜合突變，c.1365delG突變導(dǎo)致蛋白編碼鏈提前終止，c.1113C＞A突變導(dǎo)致第371變?yōu)榻K止密碼；例3為SLC3A1基因c.1897_1898insTA和c.1093C＞T雜合突變，這些突變導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)合成有不同形式改變(表3)。以上5種突變未在100例正常人群中和人類(lèi)千人計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，均為新突變。

表 2 3例胱氨酸尿癥患兒血和尿氨基酸濃度 （μmol/L）

2 討論

胱氨酸尿癥是一種常染色體隱性遺傳病，由于近端腎小管上皮細(xì)胞對(duì)胱氨酸、賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸和精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，使這些氨基酸不能被近端腎小管重吸收，在尿中隨著氨基酸濃度的增高而影響腎功能。胱氨酸尿癥患者具有顯著的基因及表型異質(zhì)性，臨床癥狀復(fù)雜。胱氨酸在酸性和中性尿中溶解度降低，當(dāng)尿液胱氨酸異常增高時(shí)可形成結(jié)晶或結(jié)石，損害腎小管功能。我國(guó)胱氨酸尿癥發(fā)病率不詳，美國(guó)約1∶15 000，瑞士約為1∶100 000[7]。

胱氨酸尿癥患者可出現(xiàn)與腎結(jié)石相關(guān)的癥狀和體征，有時(shí)可表現(xiàn)為無(wú)腎損害的鹿角型結(jié)石[8]。25%的患者在10歲以?xún)?nèi)首次發(fā)病，30%～40%的患者于青少年期發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石[9]。美國(guó)胱氨酸尿癥患兒形成結(jié)石的中位年齡12歲，男性較女性更重[10]。有研究表明，40%的患者在11～20歲首次出現(xiàn)腎結(jié)石表現(xiàn)，14%的女性和28%的男性患者在3歲之前就已經(jīng)有腎結(jié)石的癥狀[11]。本研究中3例患兒均為男童，2例于1歲、1例14歲發(fā)病，首次發(fā)病均為腎結(jié)石表現(xiàn)。

既往，根據(jù)攜帶雜合突變患者尿中胱氨酸的分泌量將胱氨酸尿癥分為3個(gè)亞型，這種表型分類(lèi)很難體現(xiàn)基因信息。目前多采用根據(jù)基因信息分類(lèi)的方法，分為A型和B型。A型是指因SLC3A1基因突變致病的患者，B型是指因SLC7A9基因突變致病的患者。本研究中例1屬于B型，例2和例3屬于A型。

迄今，國(guó)外已報(bào)道SLC3A1基因130種和SLC7A9基因100種致病性突變，基因突變譜較廣，包括無(wú)義、錯(cuò)義、剪切和框移突變[12]。其中在SLC7A9基因外顯子5-9的缺失和重復(fù)突變較多見(jiàn)[13]。本組3例患兒及其父母檢出了5種新突變，分別是SLC7A9基因c.325G＞A突變，SLC3A1基因c.1365delG、c.1113C＞A、c.1897_1898insTA和c.1093C＞T。例1為B型，SLC7A9基因第4外顯子c.325G＞A純合突變，父母均為c.325G＞A雜合突變攜帶者，無(wú)腎結(jié)石，符合常染色體隱性遺傳模式。但是，有研究顯示，SLC7A9基因突變傾向于不完全顯性遺傳，即SLC7A9基因雜合突變攜帶者部分也可表現(xiàn)為腎結(jié)石[1]。SLC3A1基因突變?yōu)槌Ｈ旧w隱性遺傳，本組例2、例3患兒為SLC3A1復(fù)合雜合突變，符合A型，其中一個(gè)為框移突變。例2的SLC3A1外顯子8存在c.1365delG，外顯子6檢出c.1113C＞A無(wú)義突變。例3的SLC3A1基因外顯子10存在c.1897_1898insTA突變，外顯子6存在c.1093C＞T錯(cuò)義突變，提示SLC3A1外顯子5-9的缺失和重復(fù)突變應(yīng)該被列為胱氨酸尿癥的基因篩查種類(lèi)之一，與既往報(bào)道一致。

腎臟結(jié)石是兒科臨床較為常見(jiàn)的疾病之一。尿中各種成分異?；虮壤Ш庖鹉蛞褐芯w形成，在與腎小管上皮細(xì)胞作用形成結(jié)石。引起尿成分異常的原因比較復(fù)雜，尿中草酸、鈣鹽、尿酸、枸櫞酸、胱氨酸異常，均能導(dǎo)致腎結(jié)石。尤其對(duì)于除泌尿系統(tǒng)外還有其他一個(gè)或多個(gè)系統(tǒng)同時(shí)受累的患兒，應(yīng)考慮遺傳代謝病的可能。胱氨酸尿癥是近年來(lái)臨床逐漸被認(rèn)識(shí)的遺傳代謝病。對(duì)于表現(xiàn)為腎結(jié)石的患兒注意排除胱氨酸尿癥。早期診斷和治療可防止或減緩結(jié)石的反復(fù)出現(xiàn)，保護(hù)腎臟功能。

胱氨酸尿癥治療困難，胱氨酸結(jié)石術(shù)后極易復(fù)發(fā)、體外沖擊波碎石術(shù)常不能將其粉碎、經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)后殘余結(jié)石率較高，故胱氨酸結(jié)石的長(zhǎng)期治療是一個(gè)非常棘手的問(wèn)題[14,15]。胱氨酸尿癥治療的主要目標(biāo)是降低尿中胱氨酸濃度，提高胱氨酸在尿中的溶解度，促進(jìn)排泄。主要治療方法為鼓勵(lì)飲水，增加液體攝入，補(bǔ)充堿性藥物，提高尿液pH值，以減少胱氨酸排泄，增加胱氨酸溶解度[16]。由于胱氨酸及其前體物質(zhì)甲硫氨酸的攝入量與尿胱氨酸的分泌呈正相關(guān)，同時(shí)動(dòng)物蛋白是質(zhì)子的重要來(lái)源，蛋白攝入增多降低尿pH值。胱氨酸的溶解度隨著尿pH值的增高而增加，因此，降低飲食中鈉含量和動(dòng)物蛋白的攝入可降低胱氨酸分泌[17,18]。推薦每日鈉攝入量控制在2 g/d，動(dòng)物蛋白攝入量控制在1 g/kg。增加口服液體量使尿量增加也是一個(gè)重要的治療措施。治療目標(biāo)是將尿pH值控制在7.0以上使尿胱氨酸處于超飽和狀態(tài)。本組3例患兒血液游離肉堿降低，精氨酸缺乏，存在繼發(fā)性肉堿缺乏癥及精氨酸缺乏[19]。左卡尼汀為重要的堿性維生素，可與體內(nèi)蓄積的有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)結(jié)合，轉(zhuǎn)化為水溶性的堿性的有機(jī)酸酯從尿中排泄，因此，對(duì)患兒補(bǔ)充了小劑量左卡尼汀。同時(shí)補(bǔ)充精氨酸，改善體質(zhì)，

表 3 患兒及父母基因檢測(cè)結(jié)果

并鼓勵(lì)患兒多飲水，降低動(dòng)物蛋白攝入量。為進(jìn)一步堿化尿液，每日口服10%枸櫞酸鉀。經(jīng)治療后，3例患兒的病情均趨于穩(wěn)定，均未發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石增大或復(fù)發(fā)情況。盡管這些治療措施可以降低胱氨酸分泌增加溶解度，但缺乏長(zhǎng)期治療效果的研究依據(jù)，需要進(jìn)一步研究觀察。

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The clinical and genetic findings of childhood cystinuria

MA Yanyan1, XIAO Haixue1, LIU Yupeng2, YUAN fumei1,LI Dongxiao2, SONG Jinqing2, LI Xiyuan2, DING Yuan2, YANG Yanling2(1. Qinghai University Affiliated Hospital, Xining 810001,Qinghai, China; 2. The First Hospital of Peking University, Beijing 100034, China)

Objective To explore the clinical features and genetic etiology of children with cystinuria with onset of kidney stone. Methods The clinical data of 3 children with cystinuria with onset of kidney stone and the gene analysis results of SLC3A1 and SLC7A9 by PCR sequencing were retrospectively analyzed. Results Three male children were from three unrelated families, kidney stone were presented in 2 cases at 1 year old and 1 case at 14 years old. The blood amino acid spectrum was normal in all 3 cases, while the free carnitine were decreased. The urinary amino acid spectrum indicated that cystine, ornithine,arginine, and threonine increased. Gene analysis conf i rmed that 1 case had homozygous mutations of SLC7A9 gene c.325G＞A,and his parents were carriers of c.325G＞A heterozygous mutation; other 2 cases had heterozygous mutations of SLC3A1 gene,c.1365delG and c.1113C＞A heterozygous mutation in one case, and c.1897_1898insTA and c.1093C＞T heterozygous mutation in one case, and their parents were heterozygous mutation carriers. After treatment with potassium citrate and L-carnitine, the conditions were improved in all cases. Conclusions Inherited metabolic disease should be considered for children with kidney stone. Urine amino acid analysis and gene detection are important methods for the diagnosis of cystinuria.

kidney stone; cystinuria; amino acid; inherited metabolic disease

doi∶10.3969/j.issn.1000-3606.2017.12.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81471097）；國(guó)家自然科學(xué)青年基金（No.30872794）；青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（No.2016-ZJ-730）

楊艷玲 電子信箱：organic.acid@126.com

2017-04-05）

梁 華）