孔元梅 王春林 梁 黎 方燕蘭 朱建芳

浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院兒科（浙江杭州 310003）

配對盒4基因 R192S、R192H多態(tài)性與兒童青少年肥胖的研究

孔元梅 王春林 梁 黎 方燕蘭 朱建芳

浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院兒科（浙江杭州 310003）

目的 研究配對盒4（PAX4）基因 rs3824004（574C＞A；R192S）、rs2233580（575G＞A；R192H）多態(tài)性與兒童青少年肥胖及代謝指標的相關性。方法 隨機選取103例肥胖兒童，平均年齡（10.82±2.57）歲，體質指數(shù)（BMI）（26.82±4.57）kg/m2；同期體檢的100例正常體質量兒童為對照組，年齡（10.60±2.84）歲，BMI（16.79±2.13）kg/m2。測量并比較兩組血壓、體格指標以及血代謝指標。肥胖組兒童行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）和胰島素釋放試驗，計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和總體胰島素敏感指數(shù)（WBISI）。應用聚合酶鏈反應（PCR）檢測PAX4 rs3824004、rs2233580多態(tài)性，分析多態(tài)位點的等位基因頻率和基因型頻率及組間差異，以及不同基因型與代謝指標的相關性。結果 肥胖組的身高、體質量、BMI、收縮壓、舒張壓、腰圍、臀圍、腰圍身高比（WHtR）、空腹血糖（FPG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、三酰甘油（TG）、丙氨酸轉氨酶（ALT）及天冬氨酸轉氨酶（AST）均高于對照組，高密度脂蛋白（HDL）低于對照組；差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。基因分布頻率符合Hard-Weinberg平衡，rs3824004肥胖組和對照組的A等位基因頻率分別為4.9%和5.0%，CA基因型頻率分別為9.7%和10.0%；兩組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。rs2233580肥胖組的GA基因型頻率為25.2%，高于對照組（11.0%）；A等位基因頻率為12.6%，也高于對照組（5.5%），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。rs2233580 GA基因型的BMI及腰圍高于GG基因型，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但logistic回歸分析顯示PAX4 rs2233580基因型與代謝指標并無相關性（P均＞0.05）。肥胖組PAX4 rs2233580不同基因型間HOMA-IR和WBISI差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。結論 PAX4 rs2233580影響B(tài)MI及腰圍，可能參與兒童肥胖的發(fā)生，但不是兒童青少年肥胖發(fā)生的獨立影響因素。

肥胖； 配對盒4基因； 兒童

兒童青少年肥胖日趨世界性流行，已被證明是糖尿病發(fā)病和死亡的風險預測因子[1]。肥胖是由多種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致，家系分析和雙生子研究表明，遺傳因素在肥胖發(fā)生中起著非常重要的作用，但單基因突變導致肥胖僅占肥胖患者的5%～7%，大部分肥胖是多基因病[2]。隨著研究的深入，與肥胖相關的易感基因被不斷發(fā)現(xiàn)。

配對盒4（PAX4）基因是配對同源結構轉錄因子PAX家族中的一員，定位于7q32.1，主要在胰島β細胞中表達，在胰島β細胞的生長、分化中發(fā)揮重要的調控作用[3,4]。PAX4基因突變會削弱其轉錄活性，從而影響胰島β細胞的壽命或增殖。目前對PAX4的研究大多與糖尿病相關[5]，而且該基因上真正的致病或易感位點尚不完全清楚。在746例泰國的2型糖尿病（T2DM）患兒中發(fā)現(xiàn)PAX4 rs2233580基因型和等位基因頻率顯著高于對照組[6]，突變后影響胰島β細胞的分化、增殖和凋亡，降低胰島素活性。在對大樣本的中國T2DM研究中發(fā)現(xiàn)，PAX4 rs2233580在亞洲T2DM中具有種族特異性[7]。本研究以中國肥胖兒童青少年為對象，采用病例-對照研究方法，分析PAX4 rs3824004、rs2233580突變情況以及與代謝指標的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2013年6月至2016年12月入住浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院兒科的103例肥胖兒童青少年為研究對象。入組標準：①年齡≤16歲；②體質指數(shù)（BMI）＞同年齡、同性別第95百分位（P95）[8]；③剔除患有糖尿病及其他內分泌、遺傳代謝、腎臟、內科急慢性疾病及使用調節(jié)血糖、血壓、血脂等各種藥物者。選擇同期接受健康體檢的100例性別、年齡與肥胖組相匹配的漢族兒童青少年為正常對照組， 其BMI處于同年齡、同性別P25～P75之間。

本研究均征得家長知情同意，研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.2 血壓測量 取坐位由專人以臺式血壓計測量右臂肱動脈血壓，間隔2 min，連測2次取平均值。

1.2.3 生化指標檢測 于體格測量前日晚上清淡飲食，空腹10 小時以上，清晨8時抽取靜脈血測空腹血糖（FPG）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）水平。

1.2.4 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）和胰島素釋放試驗 肥胖組兒童測試前空腹10小時，測量當日清晨口服含1.75 g/kg無水葡萄糖的糖水（最大量不超過75 g），從飲第一口糖水開始計時，于30min、60min、90min和120min分別抽靜脈血檢測血糖和胰島素。

1.2.5 穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和總體胰島素敏感指數(shù)（WBISI）計算公式[9]為：HOMAIR=[空腹胰島素（mIU/L）×空腹血糖（mmol/L）]/22.5，WBISI=10 000/｛[空腹胰島素（mIU/L）×空腹血糖（mg/dl）] ×[平均胰島素（mIU/L）×平均血糖（mg/dl）]｝1/2。

1.2.6 基因型檢測 抽取受檢者外周血3 mL，EDTA抗凝，采用全血DNA提取試劑盒抽提外周血白細胞基因組DNA進行聚合酶連反應。PCR擴增上游引物：5’-GCAGAGGCACTGGAGAAAG-3’，下游引物：5’-TACTTTATGCTGCCTGTCACC-3’，產物片段長度為828 bp。擴增體系為20 μL，含10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，基因組DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶（5 u/μL）0.4 μL。擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72℃總延伸5 min。擴增產物經(jīng)電泳檢測后，送至上海華大基因采用ABI3730測序儀進行測序。

1.3 統(tǒng)計學分析

精確掌握貧困地區(qū)基礎設施、政策制度、勞力結構、經(jīng)濟發(fā)展能力等實情，精準填平補齊扶貧供給資源，改變扶貧資源規(guī)模偏小、資源總量偏少、資源質量偏低、資源結構不合理的病態(tài)。通過改革精準扶貧制度、完善扶貧機構、培養(yǎng)貧困人才、提高脫貧能力，構建多維度多層次精準扶貧保障體系，提高貧困地區(qū)供給側效率和質量，保障精準識別、精準幫扶、精準管理扶貧對象，確保精準脫貧，助力精準扶貧。

應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，符合正態(tài)分布并滿足方差齊性數(shù)據(jù)，兩組間比較采用t檢驗；TG、ALT、AST、HOMAIR、WBISI經(jīng)對數(shù)轉換符合正態(tài)分布，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。計數(shù)資料以百分比或率表示，組間比較采用χ2檢驗?；蚍植碱l率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用logistic回歸分析PAX4 rs2233580突變的危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

肥胖組103例，男66例、女37例，平均年齡（10.82±2.57）歲，BMI（26.82±4.57）kg/m2。對照組100例，男67例、女33例，平均年齡（10.60±2.84）歲，BMI（16.79±2.13）kg/m2。兩組間的性別比、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；肥胖組的身高、體質量、BMI、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、腰圍、臀圍、腰圍身高比（WHtR）、FPG、TC、LDL、TG、ALT及AST水平均高于對照組，而HDL低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 基因測序結果

PAX4第5外顯子NCBI參照序列，第192位密碼子為CGT，編碼精氨酸（圖1）。PAX4第5外顯子rs3824004序列，第192位密碼子從CGT→AGT，其所編碼的精氨酸被絲氨酸取代，為錯義點突變（圖2）。PAX4第5外顯子rs2233580序列，第192位密碼子從CGT→CAT，其所編碼的精氨酸被組氨酸取代，為錯義點突變（圖3）。

圖1 PAX4第5外顯子NCBI參照序列

圖2 PAX4第5外顯子rs3824004序列

圖3 PAX4第5外顯子rs2233580序列

2.3 基因分布頻率的平衡性檢驗

rs3824004和rs2233580的基因分布頻率差異均無統(tǒng)計學意義（χ2=0.55、2.04，P均＞0.05），基因期望值與觀察值吻合較好，符合Hardy-Weinberg平衡。

2.4 各組等位基因頻率及基因型頻率比較

rs3824004肥胖組和正常對照組的A等位基因頻率分別為4.9%和5.0%，CA基因型頻率分別為9.7%和10.0%，各組差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。rs2233580肥胖組的GA基因型頻率為25.2%，高于正常對照組（11.0%）；rs2233580肥胖組的A等位基因頻率為12.6%，也高于正常對照組（5.5%），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 肥胖組和對照組一般情況

表1 肥胖組和對照組一般情況

項 目 肥胖組(n=103) 對照組(n=100) 統(tǒng)計量 P男/女(n) 66/37 67/33 χ2=0.19 0.661年齡/歲 10.82±2.57 10.60±2.84 t=0.26 0.564身高/cm 149.52±14.75 137.42±15.87 t=5.63 ＜0.001體質量/kg 61.98±21.37 32.56±10.21 t=12.58 ＜0.001 BMI/kg·m－2 26.82±4.57 16.79±2.13 t=20.15 ＜0.001 SBP/mmHg 117.51±9.75 106.05±7.92 t=9.00 ＜0.001 DBP/mmHg 69.43±8.42 65.31±9.49 t=3.19 0.002腰圍/cm 88.32±11.92 58.60±8.00 t=20.11 ＜0.001臀圍/cm 95.14±11.95 67.85±9.80 t=17.11 ＜0.001 WHtR 0.57±0.10 0.43±0.07 t=13.71 ＜0.001 FPG/mmol·L－1 5.33±0.68 5.11±0.43 t=2.70 0.008 TC/mmol·L－1 4.15±0.72 3.80±0.56 t=3.75 ＜0.001 HDL/mmol·L－1 1.28±0.32 1.45±0.25 t=4.34 ＜0.001 LDL/mmol·L－1 2.37±0.67 1.76±0.40 t=7.54 ＜0.001 TG/mmol·L－1 1.28±0.68 0.70±0.21 t=8.90 ＜0.001 ALT/mmol·L－1 42.77±55.29 10.87±4.22 t=10.23 ＜0.001 AST/mmol·L－1 32.08±29.20 21.64±4.50 t=4.21 ＜0.001

2.5 PAX4不同基因型間代謝指標相關性比較

rs3824004 CC和CA基因型的身高、體質量、BMI、SBP、DBP、腰圍、臀圍、WHtR、FPG、TC、HDL、LDL、TG、ALT及AST差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

rs2233580 GA基因型BMI（24.42 ±7.12) kg/m2顯著高于GG基因型（21.31±5.81) kg/m2，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.82，P=0.005）；GA基因型的腰圍（86.30 ±11.11) cm也顯著高于GG基因型（70.05±17.87) cm（t=6.78，P＜0.001）；GG和GA基因型的身高、體質量、SBP、DBP、臀圍、WHtR、FPG、TC、HDL、LDL、TG、ALT及AST差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

進一步行l(wèi)ogistic回歸分析顯示，rs2233580基因型與代謝指標無相關性（P均＞0.05）。

2.6 肥胖組PAX4 rs2233580不同基因型間胰島素抵抗程度比較

肥胖組rs2233580 GA基因型HOMA-IR（6.29±3.78）和GG基因型HOMA-IR（6.71±4.90）差異無統(tǒng)計學意義（t=0.34，P=0.261）；GA基因型WBISI（2.08±1.33）和GG基因型WBISI（2.48±1.92）差異亦無統(tǒng)計學意義（t=1.73，P=0.073）。

3 討論

隨著經(jīng)濟發(fā)展以及生活水平的提高，我國兒童青少年肥胖癥越來越受到社會和家庭的重視。據(jù)美國健康與營養(yǎng)調查數(shù)據(jù)（The National Health and Nutrition Examination Survey，NHANES) 顯示，2～19 歲兒童青少年的肥胖患病率為16.9%。流行病學調查數(shù)據(jù)表明，我國中小學生肥胖高達8.9%，并有逐年上升趨勢[10,11]。營養(yǎng)攝入與吸收失衡、行為、環(huán)境和基因等因素均可導致肥胖發(fā)生。研究表明，5%左右的肥胖兒童存在復雜的多基因數(shù)量性狀效應[12]。

PAX4是胰腺發(fā)育早期的必須轉錄抑制因子。近年來，越來越多的研究表明PAX4多態(tài)性與糖尿病的發(fā)生相關[13]。我們曾接診1例12歲肥胖兒童，其母親、舅舅及外婆均患有糖尿病，該患兒及其母親、外婆糖尿病相關基因篩查結果顯示，PAX4 5號外顯子rs3824004突變，該位點突變目前國內外尚無與肥胖患者相關的報道。

rs3824004（574C＞A，R192S）與rs2233580（575G＞A，R192H）位于PAX4第5外顯子相鄰位置，編碼同一個氨基酸（精氨酸），突變后分別引起由精氨酸到絲氨酸和組氨酸的突變。本研究發(fā)現(xiàn)rs3824004多態(tài)性頻率在肥胖組和對照組比較無明顯差異，而肥胖組rs2233580多態(tài)性頻率較對照組顯著升高，這與在T2DM患者中rs2233580多態(tài)性頻率顯著高于正常對照組相符[6,7]，也表明兒童青少年肥胖是糖尿病發(fā)病的風險預測因子。并且，GA基因型兒童的BMI及腰圍顯著高于GG基因型（P＜0.05），即575G＞A改變可以導致兒童青少年BMI和腰圍增加，與肥胖的發(fā)生可能有關。但logistic回歸分析顯示，rs2233580基因型與肥胖代謝指標并無相關性，提示575G＞A改變可能參與兒童青少年肥胖的發(fā)生，但不是獨立影響因素。

胰島素抵抗是T2DM、肥胖癥、高血壓、高血脂的共同發(fā)病基礎。本研究顯示肥胖組PAX4 rs2233580不同基因型間HOMA-IR及WBISI無統(tǒng)計學差異，未能證實PAX4 rs2233580多態(tài)性與胰島素抵抗相關。而相關研究顯示，PAX4 rs2233580在T2DM患者對胰島素敏感性降低中起重要作用[6]。本研究肥胖組樣本量比較小（103例），盡管PAX4 rs2233580不同基因型間WBISI差異無統(tǒng)計學意義，但P為0.073，如進一步擴大樣本量，可能差異會有統(tǒng)計學意義，尚需進一步的研究。

總之，本研究初步顯示PAX4 rs2233580多態(tài)性與中國兒童青少年肥胖的發(fā)生有關，但與糖代謝、脂代謝以及胰島素抵抗等是否相關，還有待進一步深入研究。

表2 肥胖組和對照組PAX4基因型頻率及等位基因頻率比較[n(%)]

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Association of PAX4 R192S and R192H polymorphism with obesity in children and adolescents

KONG Yuanmei,WANG Chunlin, LIANG Li, FANG Yanlan, ZHU Jianfang (Department of Pediatrics, The First Aff i liated Hospital of Zhejiang University Hangzhou, 310003, Zhejiang, China)

Objective To investigate association of the paired box 4 (PAX4) gene rs3824004 (574C＞A; R192S) and rs2233580 (575G＞A; R192H) polymorphism with obesity and metabolic markers in children and adolescents. Methods A total of 103 obese children were randomly selected, and an average age was (10.82±2.57) years, and body mass index (BMI)was (26.82±4.57) kg/m2. At the same period, 100 normal weight children were selected as the control group, and an average age of (10.60±2.84) years, and BMI was (16.79±2.13) kg/m2. The blood pressure, physical measurements, and blood metabolic parameters were measured and compared. The oral glucose tolerance test (OGTT) and insulin release test were performed in the obesity group. The homeostasis model insulin resistance index (HOMA-IR) and the overall insulin sensitivity index (WBISI)were calculated. PAX4 rs3824004 and rs2233580 polymorphism were detected by PCR. The differences of allele frequency and genotype frequency of polymorphic loci were analyzed, and the correlation between different genotypes and metabolic indexes was analyzed. Results The height, weight, BMI, systolic blood pressure, diastolic blood pressure, waist circumference,hip circumference, waist to height ratio (WHtR), fasting blood glucose (FPG), total cholesterol (TC), low density lipoprotein(LDL), triacylglycerol (TG), alanine aminotransferase (ALT), and aspartate aminotransferase (AST) in the obesity group were signif i cantly higher than those in the control group, and the high density lipoprotein (HDL) was signif i cantly lower than that in the control group (all P＜0.05). The frequency of gene distribution was in accordance with the Hard-Weinberg balance. Thefrequencies of A allele of rs3824004 in obesity and control groups were 4.9% and 5.0%, respectively, and the frequencies of CA genotype were 9.7% and 10.0%, respectively, and there was no signif i cant difference between two groups (P＞0.05). The frequency of GA allele of rs2233580 in obesity group was 25.2%, which was significantly higher than that in control group(P＜0.05). The BMI and waist in rs2233580 GA genotype were signif i cantly higher than those in GG genotype (all P ＜0.05).However, logistic regression analysis showed that there was no correlation between PAX4 rs2233580 genotype and metabolic markers (all P＞0.05). There were no significantly differences in HOMA-IR and WBISI among different genotypes of PAX4 rs2233580 in obesity group (all P＞0.05). Conclusions PAX4 rs2233580 affects children's BMI and waist circumference and may be involved in the development of childhood obesity, but it is not an independent risk factor for obesity in children and adolescents.

國家自然科學基金面上項目（No.11571309）；國家重點研發(fā)計劃重大慢性非傳染性疾病防控研究（No.2016YFC1305301）

王春林 電子信箱：e-mail：hzwangcl@zju.edu.cn

obesity; PAX4 gene; child

doi∶10.3969/j.issn.1000-3606.2017.12.008

2017-07-14）

梁 華）