許 奕， 徐碧玉， 胡 偉， 王 安 邦， 林 妃， 黃 東 梅， 李 艷 霞，宋 順

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站，海南 ?？?70102;2.海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?70102;3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口571101)

香蕉是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)定位為發(fā)展中國(guó)家僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物［1-4］。香蕉前期植株較小，根系淺生，易受鹽害等脅迫的影響，土壤鹽分過(guò)多使根際土壤溶液滲透勢(shì)降低，促使植物吸收水分困難，香蕉在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段遇上鹽害，會(huì)使香蕉營(yíng)養(yǎng)器官生長(zhǎng)發(fā)育不良，生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)量顯著下降，嚴(yán)重還可能造成死亡。因此，對(duì)香蕉抗逆品種的改良是十分重要而且緊迫的。

水通道蛋白質(zhì)(Aquaporins，AQP)在植物中是定位于特定的細(xì)胞核膜區(qū)域的一類膜蛋白質(zhì)，能夠運(yùn)輸水和其他小分子如甘油、尿素以及一些離子，且其能使植物不斷保持水分，在植物中具有重要的作用［5］。近年來(lái)對(duì)AQP 的研究顯示了，植物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)AQP 活性響應(yīng)各種逆境的脅迫。在非生物脅迫中，主要包括旱害、冷害、鹽害、機(jī)械損傷、滲透脅迫、重金屬脅迫等。

前期試驗(yàn)獲得了一個(gè)香蕉水通道蛋白質(zhì)基因，命名為MaAQP1，對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析［6-7］，并對(duì)香蕉植株進(jìn)行一系列的非生物脅迫，表明該基因能響應(yīng)高鹽脅迫。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了MaAQP1表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，測(cè)定高鹽脅迫下擬南芥幼苗的生長(zhǎng)形態(tài)和生理指標(biāo)，分析轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽能力，以期為利用該基因提高植物對(duì)高鹽脅迫的耐受性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopsis thalianaColumbia)，大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α 菌 株，根 癌 農(nóng) 桿 菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101 菌株，植物表達(dá)載體pCAMBIA1304 質(zhì)粒由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所保存。各種內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶均購(gòu)自TaKaRa 公司;TaqDNA 聚合酶和DNA Marker 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)、利福平(Rif)及潮霉素(Hyg)等抗生素購(gòu)自Sigma 公司;引物和測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1MaAQP1植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將MaAQP1的全長(zhǎng)編碼序列以質(zhì)粒pMD18T-MaAQP1(前期已構(gòu)建)為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物:正向引物5'-TTATCCATGG GGTCGTGCTTGCCTTTAC-3'(下劃線為NcoI 酶切位點(diǎn))，反向引物5'-TCTCACTAGT CCTGCTCTTGAATGGGAT-3'(下劃線為SpeI 酶切位點(diǎn))。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，經(jīng)NcoI 和SpeI 雙酶切構(gòu)建到具有強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S 的pCAMBIA1304 植物表達(dá)載體上。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得 將重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-MaAQP1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 菌株，挑取陽(yáng)性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，接種到含有利福平和卡那霉素的YEB 培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600=1.5 ～2.0 時(shí)，將培養(yǎng)液按1 ∶50 比例轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，在OD600=1.8 ～2.0 時(shí)終止培養(yǎng)。離心收集菌體，用花序浸染液［5%蔗糖溶液，加入0.04%(體積比)吐溫-80］懸浮菌體，使OD600=0.6。利用花序浸泡法浸染擬南芥花序:選取開(kāi)花前10 d 的健壯植株，使整個(gè)花序浸泡于浸染液中60 s，浸染后以較高的濕度暗箱培養(yǎng)24 h 后正常培養(yǎng)。隔3 d 處理1次，3 次后使其正常開(kāi)花結(jié)果，收獲種子(記為T(mén)0代)，將種子撒播在選擇培養(yǎng)基(1/2MS，1.5% 蔗糖，0.7% 瓊脂，25 μg/ml 潮霉素B)上，放置在2 ～4 ℃的黑暗條件下春化處理1 ～3 d，后移至人工氣候箱中的培養(yǎng)房中培養(yǎng)，溫度控制在21 ～23 ℃，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期每日光照時(shí)間為8 h，光照度為2 000 lx，相對(duì)濕度為70% ～90%，篩選至T3 代純合系。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

1.2.3.1 PCR檢測(cè)對(duì)獲得的T3代的純合MaAQP1轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR 檢測(cè)，以MaAQP1轉(zhuǎn)基因植株葉片總DNA 作為模板，設(shè)計(jì)引物:正向引物5'-GCATCACCTTCACCCTCT-3'，反向引物 5'-CCTTGTCCACCTGGCTAC-3'，擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35 個(gè)循環(huán)。以野生型擬南芥基因組DNA為陰性對(duì)照模板，所構(gòu)建的MaAQP1植物表達(dá)載體質(zhì)粒DNA 為陽(yáng)性對(duì)照模板。

1.2.3.2 Southern blot 檢測(cè) 選取PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性的植株，提取全基因組DNA，進(jìn)行Southern blot 檢測(cè)，所設(shè)計(jì)探針為DNA 探針。探針引物:正向引物5'-ATGTGTAATCCCAGCAGC-3'，反 向 引 物 5'-CAAGGAGGACGGAAACAT-3'。

1.2.4 擬南芥幼苗鹽脅迫 將在1/2MS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4 d 的擬南芥幼苗移至分別添加了0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L NaCl 的1/2MS 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15 d，進(jìn)行高鹽脅迫試驗(yàn)。1.2.5 擬南芥中鈉離子( Na+) 、鉀離子( K+) 含量的測(cè)定 將擬南芥幼苗用超純水清洗干凈，置于燒杯中加入少量超純水煮10 min，將材料于80 ℃烘箱中48 h 烘干水分。取50 mg 干物質(zhì)加入6 ml HNO3和21ml H2O2180 ℃處理15 min，用超純水補(bǔ)足至50 ml，用原子吸收光譜分析儀(Analyst 400，Perkin Elmer，USA)測(cè)定材料中Na+、K+含量。

1.2.6 擬南芥中電導(dǎo)率、丙二醛、脯氨酸含量、過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定 電導(dǎo)率的測(cè)定:將擬南芥幼苗放入加有10 ml 超純水的試管中，于25 ℃水浴鍋中孵育8 h，用電導(dǎo)率儀(DDBJ-350)測(cè)定初始電導(dǎo)率(C1)，將材料煮沸10 min，冷卻后測(cè)定電解液中的電導(dǎo)率(C2)。最終電導(dǎo)率的計(jì)算公式為C1/C2×100%。

丙二醛含量(MDA)的測(cè)定:稱取2 g 擬南芥幼苗，加入10%三氯乙酸(TCA)2 ml 及少量石英砂進(jìn)行研磨，進(jìn)一步加入8 ml TCA 充分研磨，將勻漿液以4 000 r/min 離心10 min，其上清液為MDA 提取液。取2 ml MDA 提取液(對(duì)照組取2 ml 蒸餾水)，加入2 ml 0.6% TBA 混勻，在試管上加棉塞，置沸水中加熱15 min，冷卻后以4 000 r/min 離心15 min，于波長(zhǎng)532 nm 和450 nm 下測(cè)定OD值。MDA含量=6.45OD532-0.56OD450。

脯氨酸含量(PRO)的測(cè)定:取擬南芥幼苗材料0.5 g，置于大試管中，加入5 ml 3%磺基水楊酸溶液，管口加棉塞，于沸水浴中浸提10 min。取出試管冷卻至室溫后，吸取上清液2 ml，加2 ml 冰乙酸和3 ml 顯色液，于沸水浴中加熱40 min，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得提取液中脯氨酸濃度，樣品中脯氨酸含量=C·V/(W·a)×100(C為提取液中脯氨酸濃度，V為提取液總體積，a為測(cè)定時(shí)所吸取的體積，W為樣品質(zhì)量)。

過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定:稱取擬南芥幼苗0.5 g 置研缽中，加入2 ～3 ml 4 ℃下預(yù)冷的pH 7.0 磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成漿，轉(zhuǎn)入25 ml 容量瓶中，用緩沖液定容到刻度。置4 ℃冰箱中靜止10 min，取上清液于4 000 r/min 下離心15 min，上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液，4 ℃下保存?zhèn)溆?。?0 ml 試管3 支，其中2 支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，分別加入0.2 ml 酶粗提液，1.5 ml pH7.8 磷酸，1 ml 蒸餾水。25 ℃預(yù)熱后，逐管加入0.3 ml 0.1 mol/L H2O2，每加完一管立即計(jì)時(shí)，并迅速倒入比色杯中，240 nm 下測(cè)定吸光度，每隔1 min讀數(shù)1 次，共測(cè)4 min，待3 支管全部測(cè)完后，計(jì)算酶活力。以1 min 內(nèi)OD240減少0.1 的酶量為1 個(gè)酶活單位(μ)，過(guò)氧化氫酶活力［U/(g·min)，F(xiàn)W］=(ξOD240·VT)/(0.1·V1·t·FW)，ξOD240=ODSO-(ODS1+ODS2)/2，式中ODSO為對(duì)照管吸光值，ODS1、ODS2為樣品吸光值，VT為粗酶提取液總體積，V1 為測(cè)定用粗酶液體積，F(xiàn)W為樣品鮮質(zhì)量，t為加過(guò)氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間。

1.2.7 鹽脅迫下擬南芥幼苗根部生長(zhǎng)狀態(tài)的測(cè)定

將分別添加0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L NaCl 的1/2MS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)15 d 的擬南芥幼苗進(jìn)行根長(zhǎng)及根毛統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理濃度取20 個(gè)樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用NcoI 和SpeI 對(duì)PCR 純化產(chǎn)物和pCAMBIA1304 質(zhì)粒雙酶切，經(jīng)T4 DNA 連接酶構(gòu)建得到pCAMBIA1304-MaAQP1植物表達(dá)載體質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定，得到預(yù)期大小的目的片段，后經(jīng)測(cè)序序列正確，說(shuō)明目的基因MaAQP1成功構(gòu)建到載體pCAMBIA1304 上。

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得和鑒定

利用浸泡法將pCAMBIA1304-MaAQP1導(dǎo)入野生型擬南芥中，T3 代獲得29 株純系后進(jìn)行PCR 鑒定。以所獲得的株純系MaAQP1轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA 為模板，圖1A 所示為其中一部分株系的PCR檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)Southern blot 檢測(cè)選取2 株獨(dú)立表達(dá)的株系進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，分別命名為35S ∶ ∶MaAQP6和35S ∶ ∶MaAQP8(簡(jiǎn)稱L6 和L8)，其中L6 為雙拷貝插入，L8 為單拷貝插入(圖1B)。

圖1 T3 代轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR 檢測(cè)(A)及Southern blot 檢測(cè)(B)Fig.1 PCR identification(A)and Southern blot(B)of T3 transgenic Arabidopsis thaliana plants

2.3 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥生理指標(biāo)的影響

圖2 野生型和轉(zhuǎn)基因株系中的K+、Na+含量Fig.2 K+ and Na+ contents in wild-type plants and MaAQP1-overexpressed transgenic lines

2.3.1 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥中鉀離子( K+)、鈉離子(Na+)含量的影響 在高鹽條件下，植物細(xì)胞中具有較高的K+/Na+比［8］。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性，我們測(cè)定了正常條件以及150 mmol/L 鹽脅迫條件下野生型和轉(zhuǎn)基因株系中K+和Na+的濃度。在未進(jìn)行鹽脅迫(對(duì)照)下，轉(zhuǎn)基因株系的K+濃度低于野生型株型，而Na+濃度在轉(zhuǎn)基因和野生型株系中并無(wú)明顯差異。經(jīng)過(guò)鹽脅迫后，野生型和轉(zhuǎn)基因株系中的K+濃度均低于對(duì)照，而Na+濃度升高，其中轉(zhuǎn)基因株系的K+和Na+濃度均明顯低于野生型株系，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系具有較高的K+/Na+比(圖2)。

2.3.2 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥中電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸含量及過(guò)氧化氫酶活性的影響 在正常條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因株系的電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸含量以及過(guò)氧化氫酶活性差異均不顯著。隨著鹽脅迫濃度的增加，野生型和轉(zhuǎn)基因株系4 種指標(biāo)均逐漸升高，當(dāng)鹽濃度為150 mmol/L 時(shí)，4 種指標(biāo)均達(dá)到高峰(圖3)，其中，轉(zhuǎn)基因植株L6、L8 中電導(dǎo)率含量分別比野生型擬南芥高10%、5%，轉(zhuǎn)基因植株L6、L8 丙二醛含量分別比野生型擬南芥的低6%、19%，轉(zhuǎn)基因植株L6、L8 過(guò)氧化氫酶活性分別比野生型擬南芥高10%、8%，轉(zhuǎn)基因植株L6、L8中脯氨酸含量分別比野生型擬南芥高11%、4%。

圖3 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥株系中電導(dǎo)率、丙二醛、脯氨酸含量和過(guò)氧化氫酶活性的影響Fig.3 Effects of salt stress on ion leakage，malondialdelyde content，proline content and CAT activity of wild-type and MaAQP1-overexpressed transgenic plants

2.4 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)的影響

為了測(cè)試MaAQP1轉(zhuǎn)基因植株是否具有耐鹽能力，我們選取了幼苗階段進(jìn)行高鹽脅迫試驗(yàn)。將在1/2MS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4 d 的野生型以及轉(zhuǎn)基因株系的幼苗轉(zhuǎn)接至含不同NaCl 濃度的1/2MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)生長(zhǎng)15 d，培養(yǎng)基中NaCl 的濃度為50 mmol/L 和100 mmol/L 時(shí)，野生型擬南芥及轉(zhuǎn)基因植株L6 和L8 的生長(zhǎng)均未受到顯著影響。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到150 mmol/L 時(shí)，各株系開(kāi)始表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)狀況，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因植株L6、L8 的根系均變短且子葉變小，L6 和L8 均有4 片子葉，而野生型僅有2 片子葉(圖4)。

圖4 鹽脅迫下擬南芥幼苗根系的生長(zhǎng)Fig.4 Growth of A.thaliana roots under salt stress

經(jīng)過(guò)各濃度的鹽脅迫處理，隨著鹽濃度的增加，野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)均逐漸變短，轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)均長(zhǎng)于野生型株系，當(dāng)鹽濃度達(dá)到150 mmol/L 時(shí)，野生型株系的主根明顯變短。在體視顯微鏡下觀察高鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因株系根毛的發(fā)育情況，隨著鹽濃度的增加，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的根毛數(shù)目均減少，但轉(zhuǎn)基因株系的根毛數(shù)目均比野生型的多，在150 mmol/L 鹽脅迫下，野生型株系平均1 cm 主根中根毛數(shù)目?jī)H有30 左右，而轉(zhuǎn)基因株系仍有70 (5)。

圖5 鹽脅迫下擬南芥主根根長(zhǎng)和根毛Fig.5 Taproot length and root hair of A.thaliana under salt stress

3 討論

水通道蛋白質(zhì)(AQP)是一類位于各種細(xì)胞膜上24×103～34×103的小分子跨膜蛋白質(zhì)［9］，能夠調(diào)節(jié)水分以及其他小分子物質(zhì)運(yùn)輸，如甘油、二氧化碳、氨氣、尿素、硼和過(guò)氧化氫等［5，10-11］，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。在不同的植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多水通道蛋白質(zhì)，其中擬南芥中有35個(gè)［12］，大米中有33 個(gè)［13］，玉米中有36 個(gè)［14］。根據(jù)序列同源性，AQP 被分成4 類，包括液泡膜內(nèi)在蛋白質(zhì)(TIPs)、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白質(zhì)(PIPs)、NOD26-like內(nèi)在蛋白質(zhì)(NIPs)和小的內(nèi)在蛋白質(zhì)(SIP)［9］。本研究中的MaAQP1屬于質(zhì)膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。

目前對(duì)AQP 的研究主要集中在AQP 與植物激素(ABA、乙烯)［15-17］、種子萌發(fā)、果實(shí)成熟和植物抗逆性［16］等方面。關(guān)于AQP 對(duì)植物抵御外界非生物脅迫的研究近年來(lái)成為研究其功能的一個(gè)熱點(diǎn)，許多試驗(yàn)結(jié)果表明，植物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)AQP 的活性響應(yīng)各種逆境的脅迫。這種脅迫主要是非生物脅迫，包括旱害、冷害、鹽害、機(jī)械損傷、滲透脅迫、重金屬脅迫等。在植物中過(guò)量表達(dá)一些AQP 能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)高鹽脅迫的耐受性［11，18-20］。過(guò)量表達(dá)TaAQP8能使鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的根系伸長(zhǎng)［19］。在煙草中轉(zhuǎn)入NtAQP1，能夠提高高鹽脅迫下植物的水分利用率、導(dǎo)水率及產(chǎn)量［11］。

在本研究中，鹽脅迫下，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因株系具有較高的K+/Na+比，并且轉(zhuǎn)基因株系中的電導(dǎo)率、脯氨酸含量及過(guò)氧化氫酶活性均比野生型的高，而丙二醛含量比野生型的低;轉(zhuǎn)基因株系主根受抑制程度較小，其根毛要遠(yuǎn)多于野生型的。MaAQP1在擬南芥中的異源表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高鹽脅迫的耐受性。此結(jié)果與該基因在香蕉中的表達(dá)特性相互印證。

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