周玉梅+祖從從+周建峰

摘 要：真核翻譯起始因子4A （eIF4A）蛋白屬于DEAD-box RNA解旋酶家族，具有RNA依賴的ATP酶活性和ATP依賴的RNA解旋酶活性。脊椎動物中已經(jīng)鑒定出三種eIF4A：eIF4A1、eIF4A2和eIF4A3。除參與翻譯起始，eIF4A家族成員在胚胎發(fā)育等多種生命過程中也發(fā)揮著重要的作用。雖然三種eIF4A在序列上高度相似，但它們的作用不盡相同。eIF4A成員作用的獨特性和多樣化通常由相互作用的結(jié)合蛋白來調(diào)節(jié)。本文將eIF4A家族成員的最新研究進展，特別是eIF4A成員各自獨特的作用作一綜述。

關(guān)鍵詞：eIF4A；翻譯起始；DEAD-box解旋酶；胚胎發(fā)育

中圖分類號：S18：Q753 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0143-05

真核翻譯起始因子4A （eIF4A）屬于DEAD-box RNA解旋酶家族，最先被發(fā)現(xiàn)為翻譯必需因子，后來發(fā)現(xiàn)是eIF4F翻譯起始復(fù)合體的一個組分，在eIF4F復(fù)合體中發(fā)揮RNA解旋酶活性。哺乳動物中存在三種eIF4A：eIF4A1、eIF4A2和eIF4A3。小鼠存在eIF4Al和eIF4A2，兔子只存在一種eIF4A，爪蟾中發(fā)現(xiàn)了全部三種eIF4A，釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了由Tif1和Tif2編碼產(chǎn)生的同一種eIF4A，果蠅中發(fā)現(xiàn)了eIF4A1和eIF4A3。另外，在擬南芥、小麥等生物中也發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的同源基因[1]。

eIF4A家族成員在序列上高度同源。人類eIF4A1和eIF4A2屬于胞質(zhì)蛋白，同源性高達90%，eIF4A3主要定位在核內(nèi)，與eIF4A1的相似度稍低，約為60%。雖然eIF4A3序列與eIF4A1和eIF4A2相似，但功能卻與eIF4A1和eIF4A2截然不同。eIF4A3與eIF4G的結(jié)合很弱，體外不能替代eIF4A1的解旋酶活性，其解旋酶活性也不能被eIF4B和eIF4H激活[1]。相反，eIF4A3與MAGOH-Y14的親和力很高，三者結(jié)合后與MLN51（轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)51）一起組成外顯子連接復(fù)合體（exon junction complex， EJC）[2]。由于eIF4A1和eIF4A2在序列與結(jié)構(gòu)上高度相似，并且體外試驗證明兩者在eIF4F復(fù)合體內(nèi)可以自由交換[3]，因此長久以來兩者的功能被認為是不可區(qū)分的，但是最近的研究表明兩者的功能并不完全相同。有關(guān)eIF4A的綜述國內(nèi)尚未見報道，本文將從eIF4A的結(jié)構(gòu)、蛋白調(diào)節(jié)以及生物學(xué)功能特別是各成員之間不同的作用等方面作一綜述。

1 eIF4A蛋白的結(jié)構(gòu)

eIF4A是DEAD-box蛋白家族的典型成員，是最小的DEAD-box蛋白，含有兩個RecA樣結(jié)構(gòu)域和一個靈活的中間轉(zhuǎn)軸區(qū)域，中間區(qū)域的靈活性保證eIF4A在打開和關(guān)閉兩種構(gòu)象間轉(zhuǎn)換[4]。所有的DEAD-box家族蛋白都包含9個保守的基序：Q、Ⅰ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ（圖1）[5]。eIF4A的基序Ⅰa、Ⅰb、Ⅳ、Ⅴ參與RNA的結(jié)合，基序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ主要參與RNA依賴的ATP酶活性，基序Ⅵ對于RNA結(jié)合和ATP水解都是必需的[6]。酵母eIF4A的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析[7]?？茖W(xué)家們最近也已經(jīng)獲得了eIF4A家族成員與不同的蛋白分子結(jié)合形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)：eIF4A-PDCD4（程序性細胞死亡因子4）、eIF4A-eIF4G、eIF4A-eIF4G-eIF4H和eIF4A3-MLN51-MAGOH（magonashi同系物）-Y14 [6]。

eIF4A存在打開和關(guān)閉兩種構(gòu)象，ATP的結(jié)合與水解導(dǎo)致eIF4A在這兩種構(gòu)象間轉(zhuǎn)換[4]。ATP結(jié)合到eIF4A-eIF4G復(fù)合物上，導(dǎo)致eIF4A關(guān)閉，eIF4A關(guān)閉觸發(fā)ATP水解，ATP水解后eIF4A又恢復(fù)開放構(gòu)象，導(dǎo)致它與RNA的親和力降低，與另一ATP分子的結(jié)合將再次觸發(fā)關(guān)閉的構(gòu)象。這種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)換過程會一直持續(xù)到mRNA 5′UTR的二級結(jié)構(gòu)打開[6]。需要指出的是，在DEAD-box RNA解旋酶打開mRNA二級結(jié)構(gòu)的過程中是否需要ATP水解還有爭議。

2 eIF4A蛋白的調(diào)節(jié)

在哺乳動物細胞中，絕大多數(shù)的eIF4A以自由形式存在，其余的eIF4A與帽結(jié)合蛋白eIF4E、腳手架蛋白eIF4G一起組成eIF4F復(fù)合體。盡管單獨存在時，eIF4A的三個成員都可以在一定程度上解開dsRNA，但是它們的解旋酶活性很低。當(dāng)eIF4A以eIF4F復(fù)合體的形式存在時，其RNA解旋酶活性能夠被翻譯起始因子eIF4B、eIF4H、eIF4E、eIF4G激活[5]。例如，當(dāng)與eIF4G和eIF4B綁定時，RNA解旋酶和ATP酶的活性增加超過100倍[8]。eIF4A解旋酶活性的調(diào)節(jié)可能是為了保證解旋酶活性只有在eIF4A招募到特定的mRNA上之后才能被激活，有效防止沒有被結(jié)合伴侶靶定的RNA的二級結(jié)構(gòu)被打開[6]?；跓o配體狀態(tài)下eIF4A的結(jié)構(gòu)特點，研究者們提出了一種理論：相互作用因子可能通過促進eIF4A關(guān)閉構(gòu)象的形成與穩(wěn)定來激活eIF4A的活性[7]。

除翻譯起始因子外，腫瘤抑制蛋白PDCD4可以通過其C末端的兩個MA3結(jié)構(gòu)域與兩分子eIF4A結(jié)合，阻止eIF4A與eIF4G結(jié)合，抑制eIF4A的活性和帽依賴性的翻譯起始[9]。Patemine A是一種具有抗增殖和促凋亡活性的小分子，它可以通過其內(nèi)部結(jié)構(gòu)域連接區(qū)與eIF4A結(jié)合，增強eIF4A的ATP酶活性，同時抑制eIF4A與eIF4G結(jié)合[10]。此外，15d-PGJ2（15-脫氧-8 12，14-前列腺素 J2）也可以抑制eIF4A的活性[11]。

3 eIF4A的生物學(xué)功能

3.1 eIF4A1與eIF4A2結(jié)構(gòu)類似但功能不同

脊椎動物eIF4A1和eIF4A2的序列與結(jié)構(gòu)高度相似，長久以來兩者的功能被認為是不可區(qū)分的。但是，隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明兩者的作用不盡相同。在小鼠中兩者的表達部位不同，eIF4A1在所有組織中表達，eIF4A2主要在具有低增殖活性的器官中表達。不同細胞狀態(tài)下，兩者的表達不同，eIF4A1在生長活躍的細胞中高表達，而eIF4A2在生長停滯的細胞中高表達[6]。感染口蹄疫病毒的哺乳動物細胞中eIF4A1會被切割，而eIF4A2不被切割[12]。甲基鳥苷帽子類似物的瓊脂糖珠下拉試驗中，eIF4A1比eIF4A2更多的被拉下來，這表明eIF4A1可能更優(yōu)先結(jié)合到eIF4F復(fù)合體內(nèi)[13]。與siRNA干擾eIF4A1不同，siRNA干擾eIF4A2不會減少甲硫氨酸進入以及改變多核蛋白體圖譜中總體mRNA的分布。雖然eIF4A1敲降會引起eIF4A2大幅增加，甚至超過敲降前eIF4A1和eIF4A2的摩爾總和，但是eIF4A2的這種上調(diào)并不能彌補eIF4A1敲降引起的甲硫氨酸進入的減少，也不會改變多核蛋白體的圖譜[13]。敲降eIF4A1抑制細胞生長，然而敲降eIF4A2不會有這種影響[13]。以上證據(jù)表明，在體內(nèi)eIF4A1和eIF4A2的作用不是重疊的。endprint

最近研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源的eIF4A1和eIF4A2具有不同的結(jié)合蛋白[14]。eIF4A2與CCR4-NOT復(fù)合體的一個成員—cNOT7結(jié)合后在miRNA的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。缺失eIF4A2能夠減弱miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制，并且這種減弱效應(yīng)不能被eIF4A1營救，表明miRNA抑制不是由eIF4A的總量減少引起的[14]。所有這些證據(jù)都說明eIF4A1和eIF4A2的作用不盡相同。

3.2 eIF4A3作用獨特

雖然eIF4A3序列與eIF4A1和eIF4A2相似，但功能卻與eIF4A1和eIF4A2截然不同。在細胞核內(nèi)，eIF4A3與MAGOH-Y14結(jié)合后，與MLN51一起組成EJC復(fù)合體[2]。在哺乳動物細胞中EJC與剪接一起形成，在剪接連接點上游20～24個核苷酸處與新產(chǎn)生的mRNA緊密結(jié)合。緊密結(jié)合在mRNA上的EJC在各種后剪接事件，如mRNA出核、亞細胞定位、質(zhì)量監(jiān)測以及翻譯等過程中發(fā)揮重要作用[2，15]。eIF4A3作為EJC的一個核心組分，可以直接與RNA結(jié)合。eIF4A3與MAGOH-Y14結(jié)合后抑制ATP水解，將eIF4A3鎖定在一個關(guān)閉的構(gòu)象，使得eIF4A3與單鏈RNA緊緊結(jié)合在一起。將MAGOH-Y14從eIF4A3上解離下來后，ATP迅速水解，eIF4A3恢復(fù)開放構(gòu)象，釋放RNA[16]。eIF4A3作為EJC的核心組分發(fā)揮作用的方式打破了DEAD-box RNA解旋酶的作用取決于其ATP酶和解旋酶活性的共識。事實上，正是因為eIF4A3的解旋酶活性很低，使得它能夠作為RNA分子夾，參與EJC在mRNA上的定位[6]。除發(fā)揮EJC介導(dǎo)的各種生命過程外，研究者們還發(fā)現(xiàn)eIF4A3在哺乳動物硒蛋白合成、脊椎動物胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。

3.2.1 eIF4A3在NMD中的作用 任何錯誤剪接、移碼、插入等遺傳失誤都可能引入含有提前終止密碼子（premature termination codons， PTC）的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，如不及時清除將導(dǎo)致翻譯提前終止，產(chǎn)生無功能甚至有毒害性的截短蛋白（truncated proteins）。真核生物能夠通過無義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay， NMD）將含有PTC的異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物快速清除，防止截短蛋白的產(chǎn)生，是一種重要的mRNA監(jiān)視機制[17]。

NMD的啟動與多種調(diào)控元件有關(guān)。Ferraiuolo等研究發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾eIF4A3會抑制NMD，但是干擾eIF4A1和eIF4A2不會抑制NMD；并且eIF4A3與mRNA的結(jié)合是剪接依賴性的[18]，揭示eIF4A3參與NMD途徑，并且不能被eIF4A1和eIF4A2替代。Shibuya等進一步研究發(fā)現(xiàn)，eIF4A3能夠與EJC的另外兩個核心蛋白Y14和MAGOH相互作用，共同調(diào)節(jié)NMD途徑[19]。Gehring等研究發(fā)現(xiàn)，eIF4A3、Y14、MAGOH以UPF2非依賴的方式激活NMD途徑[20]。刪除eIF4A3的N端嚴重削弱了NMD活性，而僅保留N端區(qū)域的eIF4A3突變體沒有NMD活性，說明eIF4A3的N端區(qū)域?qū)τ贜MD途徑的激活是必要但不充分的。這是因為N末端對于eIF4A3與Y14-MAGOH異源二聚體的結(jié)合是必需的，刪除N端破壞了eIF4A3與Y14-MAGOH的結(jié)合。而且，eIF4A3與Y14-MAGOH、BTZ同時結(jié)合能夠穩(wěn)定eIF4A3與BTZ的相互作用，刪除eIF4A3的N端區(qū)域?qū)е耬IF4A3-Y14-MAGOH-UPF3b-BTZ復(fù)合物無法形成，進而抑制NMD活性[20]。

3.2.2 eIF4A3在硒蛋白合成調(diào)節(jié)中的作用 硒是一種對于人和動物體非常重要的微量元素，主要以硒蛋白的形式發(fā)揮作用。硒蛋白的合成需要mRNA 3′UTR區(qū)域的硒代半胱氨酸插入序列（selenocysteine insertion sequence， SECIS）的幫助。硒蛋白的SECIS分為兩類：Ⅰ型SECIS和Ⅱ型SECIS。Ⅰ型SECIS含有相對大的頂端環(huán)，Ⅱ型SECIS含一個小的頂端突起。GPx1、MsrB1、Dio1、SelN屬于Ⅰ型SECIS，GPX4、SelW、SelT、TrxR1屬于Ⅱ型SECIS。哺乳動物硒蛋白的合成受硒含量的調(diào)控，硒缺乏時，必需硒蛋白的合成不受影響，而非必需硒蛋白的合成減少[21]。

Budiman等研究發(fā)現(xiàn)，eIF4A3參與哺乳動物硒蛋白的調(diào)節(jié)，在缺硒條件下，eIF4A3能夠與非必需硒蛋白的SEICS結(jié)合，造成空間位阻，阻礙SECIS與SECIS結(jié)合蛋白-2（SBP2）的結(jié)合，從而阻止蛋白翻譯[22]。在缺硒細胞（ -SE）中用siRNA干擾eIF4A3可以使GPx1的蛋白表達量增加，在富硒細胞（ +SE）中過表達eIF4A3可以使GPx1的蛋白表達量減少，兩種情況下GPx1 mRNA水平不受影響，說明調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平[22]。作為EJC的核心組分與mRNA結(jié)合時，eIF4A3是非序列依賴性的。與之相反，eIF4A3在硒蛋白的合成調(diào)節(jié)中是SEICS選擇性的，能夠與非必需硒蛋白（GPx1、MsrB1、Dio1、SelN）的SECIS結(jié)合，但是不能與持家硒蛋白（GPX4、SelW、SelT、TrxR1）的SECIS結(jié)合[22，23]。SECIS的內(nèi)部莖環(huán)結(jié)構(gòu)對于eIF4A3與SECIS的結(jié)合是必需的，但是單獨的內(nèi)部莖環(huán)并不能實現(xiàn)兩者的高親和力，SECIS核心區(qū)對于兩者的結(jié)合則是非必需的[22]，而內(nèi)部莖環(huán)結(jié)構(gòu)和核心區(qū)對于SBP2與SECIS的結(jié)合都是必需的[24]，說明缺硒條件下eIF4A3與SBP2競爭性的結(jié)合SECIS，兩者的結(jié)合位點有重疊，但是不完全相同。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，SECIS的內(nèi)部莖環(huán)、頂端莖環(huán)以及核心區(qū)3′上游尿苷對于eIF4A3-SECIS復(fù)合體的形成是必需的[23]。動力學(xué)研究表明，內(nèi)部莖環(huán)幫助eIF4A3識別SECIS，頂端莖環(huán)和核心區(qū)的尿苷對于維持eIF4A3-SECIS復(fù)合體的穩(wěn)定性至關(guān)重要[23]。基于以上試驗，研究者們提出了一個兩點結(jié)合模型：與其他DEAD-box蛋白家庭成員類似，eIF4A3由兩端的兩個結(jié)構(gòu)域和中間的連接子構(gòu)成啞鈴形，兩端的兩個結(jié)構(gòu)域分別與SECIS的內(nèi)部莖環(huán)和頂端莖環(huán)結(jié)合[23]。endprint

3.2.3 eIF4A3在脊椎動物發(fā)育中的作用 脊椎動物的胚胎發(fā)育是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程。eIF4A3作為多蛋白復(fù)合體EJC的組分，參與了很多RNA水平上的調(diào)節(jié)過程[25]。Haremaki等研究發(fā)現(xiàn)，EJC對于脊椎動物早期胚胎發(fā)生是必不可少的，敲降eIF4A3會導(dǎo)致非洲爪蟾全身癱瘓，伴隨感覺神經(jīng)元、色素細胞和心臟發(fā)育缺陷；敲降EJC其他核心組分也會出現(xiàn)相似的表型，表明EJC在早期胚胎發(fā)育中至關(guān)重要[26]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，過表達eIF4A3會激活BMP信號通路[28]，但是敲降eIF4A3并未出現(xiàn)與BMP信號削弱相關(guān)的表型，暗示eIF4A3可能只在其表達區(qū)域調(diào)節(jié)BMP信號，這些區(qū)域包括神經(jīng)板/神經(jīng)管邊界[26]。癱瘓可以由一系列原因引起，其中包括骨骼肌和/或者神經(jīng)發(fā)育缺陷。敲降eIF4A3表現(xiàn)出感覺神經(jīng)元缺陷，這可能是胚胎無法對觸摸刺激作出響應(yīng)的基礎(chǔ)，但不太可能導(dǎo)致胚胎全身癱瘓[26]。對敲降eIF4A3導(dǎo)致非洲爪蟾全身癱瘓機制的進一步研究發(fā)現(xiàn)，eIF4A3可以通過調(diào)節(jié)Ryr的正確剪接來調(diào)節(jié)肌肉細胞的收縮[27]。鈣離子誘導(dǎo)的肌漿網(wǎng)中鈣離子的釋放對于肌肉細胞的收縮十分重要，鈣離子釋放受阻會減弱對電刺激的反應(yīng)。Ryr1是肌肉細胞中鈣離子釋放的重要調(diào)節(jié)因子，Ryr1作用受損會嚴重影響鈣離子的釋放。敲降eIF4A3會導(dǎo)致Ryr錯誤剪接，使Ryr無法發(fā)揮正常功能，影響鈣離子從肌漿網(wǎng)中釋放，導(dǎo)致肌肉纖維發(fā)育缺陷，在一定程度上導(dǎo)致了全身癱瘓[27]。敲降eIF4A3會抑制胚胎色素生成以及心臟受損[26]，但是敲降Ryr不會影響色素生成或者造成心臟缺陷，表明eIF4A3對胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)不僅僅是通過Ryr來實現(xiàn)的，可能還有多種蛋白或者信號通路參與其中[27]。

4 前景與展望

eIF4A在翻譯起始和胚胎發(fā)育等多種生命過程中發(fā)揮復(fù)雜而又重要的功能，雖然前人的研究使我們對eIF4A有了一定的認識，但是仍有很多問題需要解決：①eIF4A的解旋酶活性很大程度上取決于它們的結(jié)合蛋白，與eIF4F復(fù)合物結(jié)合能夠激活翻譯起始，而與CCRT-NOT復(fù)合物結(jié)合能夠抑制翻譯。在生物體內(nèi)這兩種作用如何巧妙協(xié)調(diào)，以及在低等生物中eIF4A是否發(fā)揮雙重作用需要進一步研究。②癌細胞中的翻譯起始經(jīng)常失控，在轉(zhuǎn)化細胞和癌細胞中，包括eIF4A1在內(nèi)的很多翻譯起始因子的基因表達水平發(fā)生改變[29]，提示我們eIF4A1可能參與了腫瘤和癌癥的發(fā)生，是抗癌治療的潛在靶點。③研究eIF4A1和eIF4A2的不同功能是最近eIF4A研究的一個焦點?？紤]到它們高達90%的相似度，闡述這兩種蛋白被招募到不同蛋白復(fù)合物上的分子機制很關(guān)鍵。④最近研究發(fā)現(xiàn)，CWC22通過其MIF4G結(jié)構(gòu)域與eIF4A3直接結(jié)合，參與剪接依賴性的EJC組裝[30]，這個新發(fā)現(xiàn)為EJC附著與前體mRNA剪接之間的緊密耦合提供了一種新的理論，其具體分子機制還不清楚。⑤前人的研究發(fā)現(xiàn)eIF4A參與Dpp/BMP信號通路的調(diào)控[31]，并且eIF4A3對于爪蟾的發(fā)育十分重要，研究eIF4A在脊椎動物發(fā)育中的分子機制對于全面揭示eIF4A的生物學(xué)功能意義重大。

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