莫曉山，馮旭，楊樂

［1.湖南省計(jì)量檢測(cè)研究院，長(zhǎng)沙 410004；2.島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司北京分公司，北京 100020］

近年來(lái)生物制藥市場(chǎng)發(fā)展迅速，2015年全世界生物藥品銷售預(yù)計(jì)將達(dá)到2 100億美元，生物制藥已經(jīng)成為很多制藥企業(yè)的發(fā)展戰(zhàn)略方向。目前世界5個(gè)頂尖制藥企業(yè)中4個(gè)是生物制藥企業(yè)。除了新藥研發(fā)公司外，生物仿制藥行業(yè)發(fā)展也非常迅速。隨著生物制藥的迅速發(fā)展，各種生物藥品團(tuán)聚顆粒濃度測(cè)試方法不斷涌現(xiàn)。北京化工大學(xué)的李甜等［1］研究了利用暗場(chǎng)散射探針法測(cè)試金納米顆粒濃度的方法；陸曉蘭等［2］用圖像分析儀測(cè)定癌癥組織中核仁組成區(qū)嗜銀蛋白顆粒計(jì)數(shù)，并研究了其對(duì)癌癥患者預(yù)后的意義；Kouri等［3］介紹了ISLH推薦的相差顯微鏡法對(duì)尿液中細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法；謝敏等［4］研究了用透光率脈動(dòng)檢測(cè)儀(PDA)測(cè)量水中微米級(jí)別微生物等懸浮顆粒濃度的方法；張軍霞等［5］采用分子排阻色譜法考察了雙黃連注射液中高分子聚合雜質(zhì)；顧立素等［6］采用凝膠色譜法研究了利用凝膠色譜法測(cè)定安美汀藥物中高分子聚雜質(zhì)。

根據(jù)粒徑大小，生物藥品團(tuán)聚物可大致分為3類：小于100 nm，100 nm～10 μm，大于10 μm。生物制藥行業(yè)最關(guān)心的是100 nm～10 μm范圍粒子濃度的測(cè)試。在生物制藥生產(chǎn)研發(fā)的每個(gè)階段，都需要對(duì)此范圍內(nèi)的團(tuán)聚物進(jìn)行評(píng)估，這3類團(tuán)聚物濃度常用測(cè)試方法：小于100 nm的樣品采用體積排阻色譜法(SEC)；大于10 μm的樣品采用液體顆粒計(jì)數(shù)儀；100 nm～10 μm范圍內(nèi)的粒子被稱為亞可見粒子(SVP)。目前市場(chǎng)上能有效進(jìn)行測(cè)量SVP團(tuán)聚物濃度的方法較少。筆者以下介紹納米激光粒度法在測(cè)定生物藥品團(tuán)聚物濃度方面的應(yīng)用。

1 生物藥品團(tuán)聚過(guò)程

將西藥以藥物分子大小細(xì)分，大體可以分為化學(xué)藥物和生物藥物兩類，二者在生產(chǎn)方法、使用方式及功效等方面有所不同。化學(xué)藥物的相對(duì)分子質(zhì)量較低，多采用化學(xué)合成方式生產(chǎn)，產(chǎn)品以口服藥、注射藥等為主；生物藥品的相對(duì)分子質(zhì)量較大，采用基于基因科技的生物細(xì)胞法生產(chǎn)。

生物藥品又分為有抗體、蛋白質(zhì)和核酸藥物，主要類型是抗體藥物?？贵w藥物直接消滅細(xì)胞、病毒及其它致病的抗原載體或抵消其毒性。

生物制藥行業(yè)的基本任務(wù)是為患者制造和儲(chǔ)存藥物單體形式的生物藥品，而團(tuán)聚物是藥物單體的團(tuán)聚體，如圖1所示。

圖1 生物藥品單體的團(tuán)聚過(guò)程

生物藥品單體的團(tuán)聚現(xiàn)象比較普遍，如個(gè)別蛋白質(zhì)特殊物理特性可能導(dǎo)致生物藥品團(tuán)聚，運(yùn)輸或儲(chǔ)存過(guò)程中的振蕩、外界污染，甚至用藥過(guò)程中的一些因素等也會(huì)造成藥品單體的團(tuán)聚［7］。隨著藥物團(tuán)聚物越來(lái)越大，其藥效會(huì)隨之減小，而且可能會(huì)產(chǎn)生危險(xiǎn)的副作用，比如人體免疫反應(yīng)導(dǎo)致的休克，甚至死亡［8］。所以對(duì)于生物制藥生產(chǎn)商而言，抑制有害的團(tuán)聚物形成，及時(shí)檢測(cè)團(tuán)聚物粒徑范圍及濃度變得異常重要。生物制藥生產(chǎn)過(guò)程中藥物團(tuán)聚抑制研究、藥物儲(chǔ)存方法開發(fā)和質(zhì)量控制都需要對(duì)藥品的團(tuán)聚物進(jìn)行檢測(cè)。

2 團(tuán)聚物濃度測(cè)試原理

目前有些粒子測(cè)定儀，如島津推出的SALD-7500 nano型粒子測(cè)定儀可以檢測(cè)7 nm～800 μm范圍粒子的粒徑，并且可定量檢測(cè)100 nm～10 μm范圍內(nèi)生物制藥團(tuán)聚物的濃度，團(tuán)聚物形成過(guò)程及濃度變化［9］。例如樣品A和B為不同濃度的同種顆粒樣品，用傳統(tǒng)的激光粒度測(cè)定時(shí)，可以得到散射光強(qiáng)度分布（如圖2所示）。

圖2 樣品A和樣品B的光強(qiáng)度分布圖

雖然各檢測(cè)器元件之間的相對(duì)強(qiáng)度關(guān)系是相同的，單一元件所測(cè)的光強(qiáng)度與顆粒的濃度成正比，但傳統(tǒng)激光粒度儀只能得到相同的粒度分布數(shù)據(jù)，而不能發(fā)現(xiàn)濃度的不同（如圖3所示）。SALD-7500nano系統(tǒng)能夠進(jìn)一步分析與顆粒濃度成正比的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并通過(guò)聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)顆粒溶液進(jìn)行校準(zhǔn)，獲得以質(zhì)量濃度(μg／mL)形式給出的粒度分布數(shù)據(jù)，即濃度分布（如圖4所示）。

圖3 相對(duì)粒度分布圖

圖4 顆粒的濃度分布圖

3 生物藥品團(tuán)聚物濃度測(cè)量應(yīng)用實(shí)例

在監(jiān)控生物藥品團(tuán)聚物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，若峰高增大，表示團(tuán)聚物數(shù)量增加；若峰向大粒子方向移動(dòng)，則表示團(tuán)聚物粒徑增大（如圖5所示）。

在生物醫(yī)藥中，為防止藥品發(fā)生團(tuán)聚，通常加入藥物穩(wěn)定劑來(lái)阻止藥物團(tuán)聚的形成，而藥物穩(wěn)定劑的效果評(píng)估則需要監(jiān)測(cè)團(tuán)聚物濃度。在圖6、圖7所示的例子中，L-精氨酸被當(dāng)作穩(wěn)定劑添加到牛血清蛋白（BSA）分散液（pH5的三羥甲基氨基甲烷緩沖液）中。在人為機(jī)械攪拌刺激下，團(tuán)聚物很快形成，而穩(wěn)定劑抑制團(tuán)聚的效果可以定量評(píng)估。從圖6結(jié)果顯示，加入L-精氨酸的牛血清蛋白分散液中，團(tuán)聚物顆粒數(shù)量明顯減少，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。圖7為加入L-精氨酸與不加L-精氨酸攪拌處理后牛血清蛋白團(tuán)聚物濃度的測(cè)量結(jié)果。

圖5 SALD-7500nano 測(cè)定聚合物濃度結(jié)果圖

圖6 不同攪拌時(shí)間下加入L-精氨酸前后團(tuán)聚物濃度

圖7 BSA團(tuán)聚測(cè)定結(jié)果

表1 牛血清蛋白加入L-精氨酸前后團(tuán)聚物濃度 μg/mL

4 結(jié)語(yǔ)

探討了生物制藥蛋白質(zhì)團(tuán)聚物濃度測(cè)量的重要性，并通過(guò)測(cè)定實(shí)例，介紹了一種采用納米激光粒度法測(cè)定生物藥品團(tuán)聚物濃度的方法。此方法既可以測(cè)量納米級(jí)顆粒樣品的粒度范圍，又可以對(duì)生物藥品中藥物單體團(tuán)聚物濃度進(jìn)行測(cè)試監(jiān)控，以對(duì)藥品藥效、安全性能等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。

［1］李甜，許瀟，徐重行，等.金納米顆粒暗場(chǎng)散射成像計(jì)數(shù)檢測(cè)凝血酶［C］//中國(guó)化學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì).北京，2014.

［2］陸曉蘭，易為民，王蘭芬.細(xì)胞核DNA含量測(cè)定和AgNOR顆粒計(jì)數(shù)對(duì)預(yù)測(cè)卵巢囊腺癌患者預(yù)后的意義［J］.癌癥，2003，22(1): 62–65.

［3］Kouri T，Gyory A，Rowan R M. ISLH recommended reference procedure for the enumeration of particles in urine ［J］. Lab Hematol，2003(9): 58-63.

［4］謝敏，劉小波.透光率脈動(dòng)檢測(cè)儀PDA在水中顆粒計(jì)數(shù)中的應(yīng)用［J］.凈水技術(shù)，2009，28(4): 71-73.

［5］張軍霞，仲平.分子排阻色譜法檢測(cè)雙黃連注射液中的高分子雜質(zhì)［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，31(6): 468-471.

［6］顧立素，胡昌勤，金少鴻.安美汀中高分子雜質(zhì)的分離分析與質(zhì)量控制［J］.藥物分析雜志，2001，21(1): 13-15.

［7］袁雯瑋.高分子聚合物研究與中國(guó)藥典2005年版β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物修訂情況及操作要點(diǎn)［J］.中國(guó)抗生素雜質(zhì)，2005，30(12): 727-730.

［8］王秀玲，張?jiān)拦?，張靜. IgA-纖維連接蛋白聚合物的影響［J］.醫(yī)藥與保健，2014，22(1): 2-4.

［9］日本島津公司. SALD–7500nano納米激光粒度儀［J］.傳感器世界，2013(10): 52-52.