梁 圖， 傅 青， 辛華夏， 李芳冰， 金 郁， 梁鑫淼，2*

（1. 華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海200237；2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116023）

糖類化合物是能量的主要來源，除了提供能量，研究發(fā)現(xiàn)糖類化合物在人生命過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，對人體生理活動產(chǎn)生各種影響。因此，以糖類化合物為基礎(chǔ)的糖類藥物成了制藥公司和生物技術(shù)公司長期關(guān)注的焦點(diǎn)。多糖是糖類化合物的一種，在過去的幾十年中，植物性多糖特別是來自中藥的水溶性多糖，由于其具有廣譜治療和低毒性特點(diǎn)，引起了廣泛關(guān)注。從人參、三七、黃芪、冬蟲夏草、當(dāng)歸、靈芝等中藥中提取的多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎等生物活性，使之成為天然藥物及保健品研發(fā)中的重要組成部分。雖然有不少的中藥多糖已應(yīng)用于臨床，但由于其化學(xué)組成不明確，質(zhì)量很難控制，造成藥效重復(fù)性較差，不符合國際規(guī)范，因而也難以在醫(yī)藥領(lǐng)域占主要地位。為了使國際社會更加廣泛地接受多糖藥物在“自然療法”方面的價值，需要發(fā)展簡單而可靠的分析方法用于中藥多糖的表征。然而，多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜且相對分子質(zhì)量巨大，其表征是一個大的挑戰(zhàn)。

由于多糖的活性與多糖的相對分子質(zhì)量、單糖組成、構(gòu)型、糖苷鍵位置及三級結(jié)構(gòu)相關(guān)，所以可使用色譜及光譜學(xué)方法檢測中藥多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對其進(jìn)行表征［1］。雖然獲取結(jié)構(gòu)信息是明確表征多糖的有效手段，但這個過程需要耗費(fèi)大量精力，同時需要數(shù)量較多的多糖純品，過程復(fù)雜、困難和耗時。在多糖分析中常使用蒽酮-硫酸法或苯酚-硫酸法等測定多糖含量，也可作為多糖表征的方法之一，多糖含量的變化可反映出不同產(chǎn)地、不同采收時期、不同栽培環(huán)境等方面的差異［2-4］。但該方法的選擇性較差，不能有效鑒別出多糖制品中的一些摻假品［5］；同時，該方法也無法直觀反映出多糖中糖單元組成、個數(shù)和比例分布等方面的信息。因此有必要發(fā)展新的方法用于中藥多糖的表征。

受蛋白質(zhì)組學(xué)研究啟發(fā)，可采用“自下而上”法完成對中藥多糖的表征。先將中藥多糖降解為特征性的寡糖片段，然后使用色譜以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法完成對特征性寡糖片段的分離和表征研究。酸水解是多糖降解中常用的方法之一，方法簡單，易操作［6，7］。和酶解法相比，酸水解更加高效和快速［8］。由于酸水解過程一般與底物的結(jié)構(gòu)無關(guān)，水解產(chǎn)物的聚合度僅與酸濃度和反應(yīng)時間相關(guān)，因此具有普適性的特點(diǎn)，已被廣泛用于多種多糖的降解，如殼聚糖［9］、木聚糖［10］和南瓜多糖［11］等。酸水解的目的是要獲得充足數(shù)量的多糖降解碎片，因此要對部分酸水解的過程進(jìn)行深入研究，考察酸水解的影響因素（包括酸濃度、水解溫度和時間等），嚴(yán)格控制水解程度，保證重復(fù)、穩(wěn)定地得到特征性的寡糖片段。

對于得到的多個特征性寡糖片段，需要采用合適的方法對其進(jìn)行分離分析。而糖類化合物的分離和檢測，也是糖學(xué)研究的難點(diǎn)問題之一。糖類化合物結(jié)構(gòu)中包含大量的羥基，極性大，在傳統(tǒng)的反相液相色譜固定相上很難保留，往往在死時間就被洗脫下來，難以得到有效分離。所以大多數(shù)的反相液相色譜法都需要使用衍生試劑對糖類化合物進(jìn)行衍生，以增加其在反相色譜柱上的保留和提高檢測靈敏度［12］。衍生步驟無疑增加了實(shí)驗(yàn)時間和方法的復(fù)雜程度。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法適用于糖類化合物的直接分析［13］。但該方法使用高濃度、高pH 的非揮發(fā)性鈉鹽，對系統(tǒng)要求較高，并且不能直接與質(zhì)譜聯(lián)用。此外，研究發(fā)現(xiàn)親水作用色譜（HILIC）適合用于糖類化合物的分離［14-16］。HILIC 使用極性分離材料為固定相，水溶性有機(jī)溶劑為流動相，克服了傳統(tǒng)反相色譜對糖類化合物保留不足的弱點(diǎn)。同時，HILIC 方法使用高比例的有機(jī)溶劑和揮發(fā)性的緩沖鹽，與質(zhì)譜有好的兼容性，解決了離子交換色譜不能與質(zhì)譜直接聯(lián)用的問題。

本文選擇中藥黃芪為研究對象，發(fā)展基于部分酸水解-親水作用色譜的黃芪多糖表征方法。首先對影響黃芪多糖部分酸水解的各種因素進(jìn)行優(yōu)化，建立黃芪多糖部分酸水解方法，得到特征性的寡糖片段；然后使用親水作用色譜方法與質(zhì)譜方法聯(lián)用對黃芪特征寡糖片段進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)表征，獲取黃芪多糖組成、連接等結(jié)構(gòu)信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

黃芪飲片購自上海雷允上藥業(yè)有限公司，三氟乙酸（TFA，純度≥99%）購自百靈威（中國）公司，無水乙醇、丙酮和石油醚購自國藥化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水來自Milli-Q 水純化系統(tǒng)（Billerica，USA），乙腈（色譜純）購自Fisher（Fair Lawn，USA），甲酸（色譜純）購自Merck（Darmstadt，德國）。

色譜:Waters 高效液相色譜系統(tǒng)，包括Waters 2695 HPLC 泵、Waters 2420 蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），數(shù)據(jù)記錄使用Empower 工作站軟件。

質(zhì)譜:Thermo Scientific LCQ Fleet 質(zhì)譜儀（Thermo，美國），配有電噴霧離子源（ESI），工作站為Xcalibur 2.1（Thermo，美國）。

1.2 多糖提取

如圖1 所示，取20 g 黃芪飲片，粉碎后加水熱浸提，濾液濃縮、醇沉、過濾，濾餅洗滌后得到黃芪多糖，干燥，備用。

1.3 多糖部分酸水解條件

稱取10 mg 黃芪多糖，放入封管中，分別考察水解溫度、時間及酸濃度的影響。

水解時間:三氟乙酸濃度為1.5 mol／L，水解溫度為80 ℃，水解時間分別為2、3、4 和5 h，水解后氮?dú)獯蹈?，? mL 乙腈／水（50∶50，v／v）溶解，HILICELSD 分析。

酸濃度:水解溫度為80 ℃，水解時間為4 h，三氟乙酸濃度分別為0.5、1.0、1.5 和2.0 mol／L，水解后氮?dú)獯蹈?，? mL 乙腈／水（50 ∶50，v／v）溶解，HILIC-ELSD 分析。

水解溫度:三氟乙酸濃度為1.5 mol／L，水解時間為4 h，水解溫度分別為40、60、80 和100 ℃，水解后氮?dú)獯蹈?，? mL 乙腈／水（50∶50，v／v）溶解，HILIC-ELSD 分析。

最終，黃芪多糖部分酸水解的適宜條件是水解溫度80 ℃，三氟乙酸濃度1.5 mol／L，水解時間4 h。

1.4 分析條件

色譜柱:Click XIon （150 mm × 4.6 mm，5 μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司）。

酸水解產(chǎn)物分析條件:流動相A 為H2O，B 為乙腈；洗脫梯度:0 ～40 min，85% B ～50% B；流速:1.0 mL／min。ELSD 檢測參數(shù):氮?dú)鈮毫?.07 ×105Pa，漂移管溫度50 ℃，增益值100。

HILIC-MS 聯(lián)用條件:流動相A 為H2O，B 為乙腈。洗脫梯度:0 ～40 min，85% B ～65% B；40 ～60 min，65% B。流速:1.0 mL／min，柱后分流比為1∶4。ESI 離子源接口，正離子模式一級全掃描，質(zhì)量掃描范圍為m／z 150 ～2 000。脫溶劑氣為氮?dú)?，離子傳輸毛細(xì)管溫度為300 ℃，鞘氣流速為35 arb，輔助氣流速為6 arb，噴霧電壓為5.00 kV，毛細(xì)管電壓為30 V。MSn 條件下分析時，毛細(xì)管傳輸能量為15～25 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芪多糖部分酸水解方法的建立

使用“水提醇沉”法對黃芪飲片進(jìn)行處理，得到黃芪多糖，具體處理步驟如圖1 所示。為了得到特征性的寡糖片段，對影響水解過程的各種因素進(jìn)行了研究，具體包括水解溫度、時間和酸濃度。

首先考察水解時間對黃芪多糖降解程度的影響。水解后的多糖采用親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HILIC-ELSD）方法對其進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。HILIC 模式下，黃芪寡糖在Click XIon 色譜柱上得到了較好的分離，按照極性由小到大的順序依次被洗脫，最后的“大包峰”是未水解的黃芪多糖。當(dāng)水解時間為2 ～3 h 時，黃芪多糖水解不夠充分，大部分以多糖形式存在，寡糖含量較低；當(dāng)水解時間增加至4 h 時，大部分的多糖開始水解，寡糖含量明顯增加；水解時間進(jìn)一步增加至5 h 時，譜圖沒有明顯變化，由此推測，水解時間超過4 h 后再繼續(xù)增加水解時間，對黃芪多糖的水解程度不再產(chǎn)生大的影響。所以4 h 為黃芪多糖水解的適宜時間。

接下來考察酸濃度對黃芪多糖降解程度的影響，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)三氟乙酸濃度為0.5 mol／L 時，水解不明顯，大部分以多糖的形式存在；三氟乙酸濃度為1.0 mol／L 時，多糖水解速度加快，寡糖含量明顯增加；當(dāng)酸濃度增加至1.5 mol／L 時，大部分的黃芪多糖水解為寡糖；繼續(xù)增加三氟乙酸濃度，譜圖不再有明顯變化。因此，確定黃芪多糖水解的適宜酸濃度為1.5 mol／L。

圖1 黃芪多糖提取流程Fig.1 Process for polysaccharides preparation

圖2 水解時間對黃芪多糖部分酸水解的影響Fig.2 Effect of time on the partial acid hydrolysis of Astragalus polysaccharide

最后，考察水解溫度對黃芪多糖降解程度的影響，結(jié)果如圖4 所示。溫度的變化對黃芪多糖水解程度的影響非常明顯，40 ℃和60 ℃時，由于溫度過低，黃芪多糖幾乎不發(fā)生水解；當(dāng)溫度升高到80 ℃時，黃芪多糖迅速水解為寡糖，寡糖含量大幅度增加；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時，黃芪多糖水解程度加劇，幾乎全部水解為單糖和聚合度較小的寡糖。由此可見，多糖水解程度對溫度的變化非常敏感，溫度調(diào)節(jié)對控制多糖水解程度非常重要。所以，80 ℃為黃芪多糖水解的適宜溫度，該溫度下黃芪多糖水解程度適中，可產(chǎn)生大量特征性的寡糖片段。

2.2 黃芪多糖HILIC-MS 表征方法的建立

圖3 TFA 濃度對黃芪多糖部分酸水解的影響Fig.3 Effect of TFA concentration on the partial acid hydrolysis of Astragalus polysaccharide

圖4 溫度對黃芪多糖部分酸水解的影響Fig.4 Effect of temperature on the partial acid hydrolysis of Astragalus polysaccharide

圖5 黃芪多糖在正離子模式下的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of Astragalus polysaccharides in positive mode

表1 圖5 中色譜峰1 ～8 的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 Data for the MS spectra of peaks 1 -8 in Fig.5

黃芪多糖經(jīng)過酸水解后得到大量的寡糖片段，采用HILIC-MS 方法在正離子模式下對特征性寡糖片段進(jìn)行分析，總離子流圖如圖5 所示。對圖5 中色譜峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，29 min 前為雜質(zhì)峰，包括單糖、二糖以及黃芪提取物中的非糖雜質(zhì)成分。如表1所示，對29 min 后的主要色譜峰1 ～8 做進(jìn)一步分析。其一級質(zhì)譜中糖類化合物在正離子模式下易產(chǎn)生［M ＋Na］＋和［M ＋H］＋離子，色譜峰1 ～8 對應(yīng)的相對分子質(zhì)量依次為666、828、990、1 152、1 314、1 476、1 638 和1 800。結(jié)合文獻(xiàn)［17，18］報道判斷，色譜峰1 ～8為聚合度（DP）4 ～11的中性葡寡糖。即本文提取得到的黃芪多糖主要為葡聚糖，被水解為DP 4 ～11 的葡寡糖。

對色譜峰1 ～8 做二級質(zhì)譜表征，判斷葡寡糖的連接方式。以［M ＋Na］＋為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖6 所示。

色譜峰1 ～8 的二級譜圖以［M ＋Na］＋為母離子，母離子易丟失一分子的水，形成［M ＋Na -H2O］＋碎片；丟失葡萄糖，形成一系列B 型碎片，m／z 1 643 （B10）、1 481 （B9）、1 319 （B8）、1 157（B7）、995（B6）、833（B5）、671（B4）、509（B3）和347（B2）；丟失葡萄糖殘基，形成一系列C 型碎片，m／z 1 661（C10）、1 499（C9）、1 337（C8）、1 175（C7）、1 013（C6）、851（C5）、689（C4）、527（C3）和365（C2）。完整的C 型和B 型碎片證明寡糖結(jié)構(gòu)為線性。同時，［M ＋Na］＋發(fā)生開環(huán)斷裂，丟失60 Da，形成0.2Ai型碎片，m／z 1 763（0.2A11）、1 601（0.2A10）、1 439（0.2A9）、1 277 （0.2A8）、1 115 （0.2A7）、953（0.2A6）、791（0.2A5）、629（0.2A4）、467（0.2A3）和305（0.2A2），或者丟失120 Da，形成2.4Ai碎片，m／z 1 703（2.4A11）、1 541（2.4A10）、1 379（2.4A9）、1 217（2.4A8）、1 055（2.4A7）、893（2.4A6）、731（2.4A5）、569（2.4A4）、407（2.4A3）和245（2.4A2）。丟失60 和120 Da，為1→4連接的特征碎片。根據(jù)正離子模式下一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)可知，本文中提取得到的黃芪多糖主要為1→4連接線性葡聚糖，該部分酸水解后產(chǎn)生DP 4 ～11 的葡寡糖。

圖6 圖5 中色譜峰1 ～8 的二級質(zhì)譜圖Fig.6 Spectra of MS／MS fragmentation of peaks 1 -8 in Fig.5

圖6 （續(xù)）Fig.6 （Continued）

3 結(jié)論

本文借鑒蛋白質(zhì)組學(xué)“自下而上”法，完成對黃芪多糖的表征。結(jié)果表明，提取得到的黃芪多糖主要為1→4 連接線性葡聚糖，水解后得到DP 4 ～11的葡寡糖。該研究對其他中藥多糖的表征具有一定的示范作用。進(jìn)一步的工作將包括中藥多糖水解產(chǎn)物中微量成分的分離和結(jié)構(gòu)表征，以及中藥多糖親水指紋圖譜的繪制，研究結(jié)果將有助于中藥多糖的質(zhì)量控制。

［1］ Zhang B，Lin R C，F(xiàn)eng F. Chinese Pharmaceutical Affairs（張彬，林瑞超，馮芳. 中國藥事），2004，18（9）:566

［2］ Deng G Q，Su Z N，Zhang J R，et al. Medical Information（鄧桂球，蘇振寧，張健潤，等. 醫(yī)學(xué)信息），2014，27（7）:48

［3］ Zeng L N，Yuan Y H，Huang S Y，et al. Fujian Forestry （曾麗娜，袁玉虹，黃淑燕，等. 福建林業(yè)），2014（2）:25

［4］ Xue M，Yang J Y，Dan S Y，et al. Journal of Mountain Agriculture and Biology （薛敏，楊繼勇，但仕勇，等. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報），2014，33（2）:14

［5］ Hu M H，Ma F L，Science and Technology Innovation Herald （胡明華，馬方勵. 科技創(chuàng)新導(dǎo)報），2010（30）:10

［6］ Reis A，Domingues M R M，F(xiàn)errer-Correia A J，et al. Carbohydr Polym，2003，53（1）:101

［7］ Daniel R，Chevolot L，Carrascal M，et al. Carbohydr Res，2007，342（6）:826

［8］ Akpinar O，Erdogan K，Bakir U，et al. LWT-Food Sci Technol，2010，43（1）:119

［9］ Yan X，Evenocheck H M. Carbohydr Polym，2012，87（2）:1774

［10］ Akpinar O，Erdogan K，Bostanci S. Carbohydr Res，2009，344（5）:660

［11］ Du B J，Song Y，Hu X S，et al. Int J Food Sci Technol，2011，46（5）:982

［12］ Wang H H，Dai J，Chen S W，et al. Food and Fermentation Industries （王浩豪，戴軍，陳尚衛(wèi)，等. 食品與發(fā)酵工業(yè)），2011，37（12）:133

［13］ Gangola M P，Jaiswal S，Khedikar Y P，et al. Food Chem，2014，154:127

［14］ Alpert A J. J Chromatogr，1990，499:177

［15］ Hemstrom P，Irgum K. J Sep Sci，2006，29（12）:1784

［16］ Liang X M. Chinese Journal of Chromatography （梁鑫淼.色譜），2011，29（3）:191

［17］ Ai L Z，Wu Y，Guo B H，et al. Shandong Food Fermentation （艾連中，吳艷，郭本恒，等. 山東食品發(fā)酵），2008（1）:39

［18］ He Y T，Pan X M. Food Science （何余堂，潘孝明. 食品科學(xué)），2010，31（17）:493