李忠琴， 李秋云， 江興龍， 張 坤， 關(guān)瑞章

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門361021）

訶子為使君子科植物訶子（Terminalia chebula Retz.）的干燥成熟果實(shí)，化學(xué)成分主要為鞣質(zhì)及多元酚類、三萜類、黃酮類、脂肪類化合物及氨基酸等，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、強(qiáng)心等作用。訶子主要活性成分鞣質(zhì)具有收斂性，有沉淀蛋白或凝集蛋白的作用，因而具有抑菌作用［1，2］。其所含的活性成分沒食子酸與訶子的生理作用密切相關(guān)［3］。沒食子酸具有抗腫瘤、抑菌、抗病毒、保肝等［4］藥理作用，在水產(chǎn)病害防治［5］上也具有一定的發(fā)展前景。

高速逆流色譜（high speed counter-current chromatography，HSCCC）最早的研究、應(yīng)用者是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院的Ito 博士［6］。這是一種較新型的液液分配色譜技術(shù)，無須任何固體支撐體，可避免固定相對(duì)樣品的不可逆吸附作用而造成的樣品損失，無論是一次制備的量，還是制備純度均得到極大的提高［7］，被廣泛應(yīng)用于植物天然活性成分的分離制備［8-12］，但尚未見其用于分離純化訶子中沒食子酸。本研究應(yīng)用高速逆流色譜建立了分離制備中藥訶子中沒食子酸（見圖1）的方法，該法操作簡(jiǎn)單，分離時(shí)間短，產(chǎn)物純度高，對(duì)沒食子酸功能活性的進(jìn)一步研究具有重要意義。

圖1 沒食子酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of gallic acid

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高速逆流色譜儀（TBE-20A，TBE-300B，上海同田生化技術(shù)有限公司）；高效液相色譜儀（Angilent 1100，美國(guó)安捷倫公司）；冷凍超微粉碎機(jī)（SQW-601，山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司）；超聲破碎儀（XODL-1000N，南京先歐儀器制造有限公司）；多樣品平行蒸發(fā)儀（Multivapor P-6，瑞士BüCHI 公司）；超純水機(jī)（Millipore 公司）。

中藥訶子購(gòu)于福建銘遠(yuǎn)制藥有限公司；HSCCC分離中所用的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、醋酸、無水乙醇等試劑均為分析純（西隴化工股份有限公司）；HPLC 分析中所用甲醇為色譜純（美國(guó)TEDIA 公司），磷酸為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。沒食子酸對(duì)照品（純度≥98%，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 訶子粗提物的制備

將中藥訶子用超微冷凍粉碎機(jī)粉碎至80 目左右，收集超微藥粉備用。稱取訶子超微粉7.5 g，加入60% （v／v）乙醇水溶液150 mL，料液比為1∶20，50 ℃下超聲50 min，過濾藥渣，將藥液置于多樣品平行蒸發(fā)儀中減壓濃縮，得到乙醇粗提浸膏，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高速逆流色譜溶劑體系的確定

根據(jù)分離物質(zhì)的性質(zhì)及溶劑極性的大小，采用分析型HSCCC（TBE-20A）確定選用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1∶5∶1∶5，v／v／v／v）體系。上相為固定相，下相為流動(dòng)相，超聲脫氣20 min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.2.3 高速逆流色譜分離制備

采用制備型HSCCC（TBE-300B）進(jìn)行分離制備。將固定相以30 mL／min 的流速迅速泵入HSCCC螺旋管柱中，待固定相流出約30 mL 后停泵，主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速調(diào)至850 r／min，再以2 mL／min的流速泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相流出且兩相溶劑達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)將制備好的20 mL 樣品注入HSCCC 儀中，開啟色譜工作站開始采集數(shù)據(jù)。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫25 ℃。根據(jù)色譜圖收集各組分，真空冷凍干燥。

1.2.4 純度分析及結(jié)構(gòu)鑒定方法

采用HPLC 對(duì)HSCCC 分離的各組分進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)面積歸一法判斷其純度。流動(dòng)相組成:A（甲醇）-B（0.1% 磷酸水溶液）（5∶95，v／v），流速1 mL／min，柱溫25 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。組分Ⅲ質(zhì)量濃度為0.015 mg／mL，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.020 mg／mL，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)合電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）負(fù)離子模式分析，推斷其質(zhì)量數(shù)，并與標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 譜圖對(duì)比，鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSCCC 分離體系的篩選

采用分析型HSCCC 考察了5 個(gè)分離體系（見表1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1∶5∶1∶5，v／v／v／v）的分離效果最好（見圖2），得到4個(gè)峰（組分Ⅰ／Ⅱ／Ⅲ／Ⅳ），分離時(shí)間為50 min，固定相保留率為45%，達(dá)到逆流色譜分離要求。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)降低流速、提高轉(zhuǎn)速可提高保留率，但流速太小時(shí)分離時(shí)間過長(zhǎng)，轉(zhuǎn)速過大時(shí)體系易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。進(jìn)樣量也影響各峰的分離度，進(jìn)樣量太大會(huì)導(dǎo)致峰間距變窄，峰形變寬，分離度降低。因此，最終確定分析型HSCCC 的流速為1 mL／min，轉(zhuǎn)速為1 800 r／min，進(jìn)樣量為2 mg。

2.2 HSCCC 分離制備結(jié)果

以分析型HSCCC 優(yōu)化的溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1∶5∶1∶5，v／v／v／v）為參考，經(jīng)微調(diào)流速和轉(zhuǎn)速后可直接用于制備型HSCCC 進(jìn)行放大制備，重復(fù)2 次進(jìn)樣，分離圖譜見圖3。該體系放大應(yīng)用于制備型HSCCC，重現(xiàn)性好，也可分離出4個(gè)組分峰，各組分的保留時(shí)間、分離度及峰形與分析型色譜的結(jié)果基本一致，且第一次進(jìn)樣和第二次進(jìn)樣分離的峰形也一致，表明該溶劑體系穩(wěn)定性好，線性放大方法具有可行性及高效性。在確定溶劑體系后，通過綜合各參數(shù)的影響，確定制備型HSCCC 的流動(dòng)相流速為2 mL／min，轉(zhuǎn)速為850 r／min。進(jìn)樣量對(duì)各峰的分離度影響最大，當(dāng)制備型HSCCC 進(jìn)樣量達(dá)到100 mg 以上時(shí)，前3 個(gè)峰的分離度大大降低。因此每次最大進(jìn)樣量為100 mg，并采用多次連續(xù)進(jìn)樣，這樣可以省去平衡時(shí)間，節(jié)約溶劑，提高產(chǎn)

物得率。各分離組分的含量見表2。在該條件下，體系的固定相保留率為63%，較分析型的有所增加，分離得到8.6 mg 沒食子酸。與制備型HSCCC相比，分析型HSCCC 的靈敏度高、分離時(shí)間短，樣品的進(jìn)樣量、流動(dòng)相的流速、轉(zhuǎn)速對(duì)分離效果的影響更大。但由于分析型HSCCC 主要用于篩選分離溶劑體系，本研究中未對(duì)分析型HSCCC 的分離條件進(jìn)行再優(yōu)化，而只優(yōu)化了制備型HSCCC 的分離條件。故從圖譜上可以明顯看出制備型的分離效果好于分析型。

表1 訶子主要成分分離的HSCCC 溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化Table 1 Optimization of the solvent systems of HSCCC for the separation of main constituents from Terminalia chebula Retz.

圖2 分析型高速逆流色譜分離訶子醇提物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of crude extract from Terminalia chebula Retz. by analytical HSCCC

圖3 制備型HSCCC 分離訶子沒食子酸色譜圖Fig.3 Chromatograms of gallic acid extracted from Terminalia chebula Retz. by preparative HSCCC

表2 制備型高速逆流色譜分離訶子的各主要組分的分析結(jié)果（n ＝3）Table 2 Analysis results of the main constituents from Terminalia chebula Retz. by preparative HSCCC （n ＝3）

2.3 純度分析及結(jié)構(gòu)鑒定

采用1.2.4 節(jié)中的色譜條件對(duì)收集的各組分進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果見表2，按照峰面積歸一法計(jì)算，得到組分Ⅲ的純度為96.4%，HPLC 譜圖見圖4a。將該組分與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（見圖4b）進(jìn)行HPLC 對(duì)比分析，結(jié)果表明兩者的峰形及保留時(shí)間完全一致。對(duì)組分Ⅲ進(jìn)行電噴霧電離質(zhì)譜分析（見圖5），結(jié)果顯示［M-H］-（m／z 169）、［M -H -CO2］-（m／z 125）與文獻(xiàn)［13］中報(bào)道的沒食子酸質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，即沒食子酸的相對(duì)分子質(zhì)量為170，在負(fù)離子模式下脫去一個(gè)H 后為169，脫去一個(gè)CO2后為125。另外，計(jì)算分子離子峰的同位素相對(duì)豐度比，并與Iso-Pro 3.0 軟件計(jì)算得到的沒食子酸同位素相對(duì)豐度比相比較，發(fā)現(xiàn)兩者的比值一致。因此，可以確定組分Ⅲ為沒食子酸，且純度達(dá)到96.4%。與已報(bào)道文獻(xiàn)中的研究結(jié)果比較，如Lu 等［14］采用逆流色譜并結(jié)合制備液相色譜法從石榴皮中純化沒食子酸，采用乙酸乙酯-甲醇-水（50∶1∶50，v／v）體系，分離得到的沒食子酸純度為26.7%，再經(jīng)制備液相色譜純化后沒食子酸的純度達(dá)到96%，而本文方法可以一步純化得到高純度的沒食子酸。

圖4 （a）組分Ⅲ和（b）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of （a）fraction Ⅲand（b）gallic acid standard substance

圖5 組分Ⅲ的質(zhì)譜圖Fig.5 MS spectrum of fraction Ⅲ

3 結(jié)論

本研究通過分析型HSCCC 獲得了分離訶子中沒食子酸的溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1∶5∶1∶5，v／v／v／v），并成功放大于制備型HSCCC，通過一步純化從100 mg 訶子醇提物中獲得8.6 mg 沒食子酸，純度達(dá)到96.4%，分離時(shí)間為2 h，證明了線性放大的可行性及高效性。本文方法可以一步純化得到高純度的沒食子酸，更省時(shí)、簡(jiǎn)便，可為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備及擴(kuò)大生產(chǎn)提供參考，并為其藥理作用的進(jìn)一步研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

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