孫偉博，鄧大霞，楊立恒，諸葛強(qiáng)

(南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210037)

鹽脅迫是全球范圍內(nèi)影響作物產(chǎn)量最大的非生物脅迫之一，鹽脅迫能通過滲透脅迫、離子毒害和離子失衡來抑制植物生長［1］.楊樹是營造生態(tài)公益林和短周期工業(yè)原料林的重要樹種，采用基因工程手段培育多抗性的速生、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)楊樹新品種，比常規(guī)育種更快更容易選育出具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的楊樹新品種，是近年來林木遺傳改良的重要研究領(lǐng)域［2－4］.然而土地鹽堿化嚴(yán)重制約了楊樹速生林的可持續(xù)發(fā)展.加強(qiáng)楊樹的抗鹽機(jī)理研究，對加速林業(yè)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展、進(jìn)一步改善鹽漬土地環(huán)境以及對其綜合開發(fā)利用有重大意義.

土壤中包含很多離子，如Cl－、Na+、K+、Ca2+、、Mg2+和SO2－4等，這些離子在通常情況下作為土壤供給植物的營養(yǎng)成分，而當(dāng)這些離子的濃度升高到對植物生長產(chǎn)生不良影響時(shí)，便會造成離子脅迫而發(fā)生鹽害［5］.在鹽漬條件下，對鹽脅迫敏感的植物所吸收的多余鹽離子主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，影響一些酶的活性，因而外界鹽度過高就會抑制其生長;而耐鹽植物會把吸收的Na+離子通過區(qū)域化作用將其貯存在液泡內(nèi)，從而不受離子的毒害作用［6］.GmNHX1基因編碼大豆細(xì)胞中液泡膜Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠有效地將Na+區(qū)隔化至液泡中，減輕Na+造成的毒害［7］.本研究采用GmNHX1基因轉(zhuǎn)化南林895楊樹，以期了解GmNHX1基因的表達(dá)對轉(zhuǎn)基因楊樹耐鹽性的影響.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 遺傳轉(zhuǎn)化受體材料為南林895楊樹(Populus deltoides×P.euramericana cv.‘Nanlin895’)葉片再生植株，培養(yǎng)于光照培養(yǎng)室，溫度 25 ℃，光強(qiáng)30－45 μmol·m－2·s－1，光周期16 h·d－1.

1.1.2 菌株與載體 試驗(yàn)中所使用的大腸桿菌為DH5α(本實(shí)驗(yàn)室保存)和One Shot? ccdB SurvivalTM2T1R Competent Cells(購自Invitrogen公司)，農(nóng)桿菌菌株為EHA105(本實(shí)驗(yàn)室保存).

植物表達(dá)載體為pGWB402Ω，由島根大學(xué)Tsuyoshi Nakagawa教授惠贈，由Gateway系統(tǒng)的表達(dá)載體pGWBs連接2x35s-Ω啟動(dòng)子制備獲得.載體圖譜如圖1所示.

圖1 植物表達(dá)載體pGWB402Ω圖譜Fig.1 Binary vector pGWB402Ω

1.2 方法

1.2.1 載體的構(gòu)建 利用Invitrogen公司的Gateway技術(shù)將耐鹽相關(guān)基因GmNHX1構(gòu)建到植物表達(dá)載體pGWB402Ω.

1.2.2 GmNHX1基因的遺傳轉(zhuǎn)化 采用農(nóng)桿菌侵染葉盤法介導(dǎo)轉(zhuǎn)化南林895楊樹，農(nóng)桿菌菌株為EHA105.遺傳轉(zhuǎn)化條件為:預(yù)培養(yǎng)時(shí)間3 d，菌液D600nm為0.8，侵染時(shí)間15 min，共培養(yǎng)時(shí)間4 d.頭孢霉素含量在分化期為100 mg·L－1，在生根階段適度降低，從而保證轉(zhuǎn)化植株的快速生長.卡那霉素在分化階段的篩選含量為20 mg·L－1，在生根階段的篩選含量為10 mg·L－1.

1.2.3 轉(zhuǎn)GmNHX1基因的分子檢測 選擇經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR和Southern雜交分子檢測.PCR檢測:根據(jù)轉(zhuǎn)基因植株GmNHX1的片段特異性設(shè)計(jì)引物(F:3'-ATGGTTTTTGAAATCAGTACTGTTG-5'.R:3'-TCAACGCCATTGATGGCC-5').采用 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ(Roche公司提供)進(jìn)行探針的制備及后期的Southern雜交.

1.2.4 轉(zhuǎn)GmNHX1楊樹耐鹽性分析 試驗(yàn)共獲得6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，其中N1、N17和N21株系植株樣本量充足.選取生長健壯、大小基本一致的未轉(zhuǎn)基因南林895楊樹和轉(zhuǎn)GmNHX1基因楊樹植株，置于NaCl濃度分別為50、100、150、200和300 mmol·L－1的無菌營養(yǎng)液中，于第15天測定各組楊樹葉片的葉綠素相對含量、可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量以及保護(hù)酶活性等生理指標(biāo).采用便攜式葉綠素計(jì)(SPAD-502)對標(biāo)記葉片的相對葉綠素含量進(jìn)行測定，6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測定30次，取其平均值作為該葉片的相對葉綠素含量.采摘植株上部成熟葉片進(jìn)行可溶性蛋白(Pr)、MDA含量和保護(hù)酶活性的測定.可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定［8］.MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)方法測定［9］.按改進(jìn)的陳建勛等方法［10］進(jìn)行POD活性的測定.SOD活性采用改良的NBT法進(jìn)行測定［11］.

2 結(jié)果與分析

2.1 GmNHX1基因表達(dá)載體的構(gòu)建

LR反應(yīng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行檢測，在13 kb處有特異性條帶，質(zhì)粒大小符合預(yù)測結(jié)果(圖2).表明經(jīng)過LR反應(yīng)，GmNHX1基因已經(jīng)從入門載體轉(zhuǎn)移到最終的植物表達(dá)載體上.為防止假陽性結(jié)果對后續(xù)試驗(yàn)的干擾，對pGWB402Ω-GmNHX1質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步檢測.

對重組的含有GmNHX1基因的表達(dá)載體進(jìn)行菌液PCR檢測，在1.6 kb處顯示有特異性條帶，表明GmNHX1基因已連接入最終的植物表達(dá)載體中(圖3).PCR擴(kuò)增檢測為陽性的重組子經(jīng)進(jìn)一步測序驗(yàn)證，結(jié)果表明所有測序樣品均為陽性.采用Gateway技術(shù)快速構(gòu)建GmNHX1基因的植物表達(dá)載體，對南林895楊樹進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化.

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

對經(jīng)抗生素篩選為陽性的轉(zhuǎn)pGWB402Ω-GmNHX1南林895楊樹植株進(jìn)行PCR分子檢測.從圖4可見:在正對照質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因楊樹6個(gè)不同株系中擴(kuò)增得到了目的片段，即 1、2、11、17、21、22 號，而陰性對照沒有特異性擴(kuò)增條帶，說明GmNHX1已經(jīng)成功整合到南林895楊樹基因的基因組中.

2.3 PCR陽性植株的Southern檢測

實(shí)驗(yàn)室克隆質(zhì)粒的污染及轉(zhuǎn)基因嵌合體的存在，都會造成PCR檢測的假陽性結(jié)果.因此，對PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株和對照南林895植株在鹽脅迫后采用Southern雜交進(jìn)行檢驗(yàn)比對，PCR 檢測為陽性的 6 個(gè)株系 1、2、11、17、21、22 均表現(xiàn)為陽性(圖5)，表明GmNHX1基因已轉(zhuǎn)入并整合到南林895楊樹基因組中.

圖2 LR反應(yīng)構(gòu)建表達(dá)載體pGWB402Ω-GmNHX1質(zhì)粒檢測Fig.2 Detection of expression vector pGWB402Ω-GmNHX1 derived from LR reaction

2.4 轉(zhuǎn)GmNHX1南林895楊樹耐鹽性分析

2.4.1 鹽脅迫濃度對轉(zhuǎn)GmNHX1基因楊樹植株葉片葉綠素相對含量的影響 葉綠素含量的高低在某種程度上與光合作用有關(guān).由圖6可知，隨著鹽濃度的提高，對照組和轉(zhuǎn)GmNHX1基因組楊樹葉片的葉綠素相對含量都逐漸降低，但對照組的降幅比3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的大.隨著鹽脅迫濃度從最低值上升到最高值，CK、N1、N17 和 N21 株系葉綠素相對含量降幅分別為 625.81%、102.72%、87.75%和97.50%，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，3個(gè)轉(zhuǎn)基因組株系與對照組差異顯著.300 mmol·L－1鹽脅迫下，對照組的葉綠素相對含量僅為轉(zhuǎn)基因植株N1、N17和N21株系的25.94%、25.59%、25.86%，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，該濃度下轉(zhuǎn)基因植株與對照組差異顯著.

圖3 LR重組子的PCR檢測Fig.3 PCR detection for clones derived from LR reaction

圖4 轉(zhuǎn)基因植株GmNHX1基因PCR檢測Fig.4 PCR detection of GmNHX1 in transgenic plants

2.4.2 鹽脅迫濃度對轉(zhuǎn)GmNHX1基因楊樹植株葉片可溶性蛋白含量的影響 在鹽脅迫過程中，隨著鹽脅迫濃度的提高，對照組轉(zhuǎn)基因N1和N21株系楊樹葉片的可溶性蛋白含量逐漸降低.可溶性蛋白含量的降低可能與鹽脅迫下蛋白質(zhì)合成受阻有關(guān).而N17葉片可溶性蛋白含量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢.總體上看，對照組葉片可溶性蛋白含量的降幅均大于3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(圖6).除300 mmol·L－1NaCl處理外，其余不同濃度鹽脅迫下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的可溶性蛋白含量均與CK差異顯著.

圖5 轉(zhuǎn)基因植株Southern雜交檢測Fig.5 Southern blot analysis of transgenic plants

2.4.3 不同鹽濃度對轉(zhuǎn)GmNHX1基因楊樹植株葉片MDA含量、SOD活性和POD活性的影響 從圖6可以看出，隨著鹽脅迫濃度的提高，對照和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系楊樹葉片的MDA含量逐漸提高，其總體變化趨勢與葉綠素相對含量的變化趨勢相反.3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量的增幅比對照組小.150和200 mmol·L－1NaCl鹽脅迫下，N1、N17和N21三個(gè)株系的MDA 含量分別為 CK 組的 66.27%、69.69%、73.01% 和 70.75%、70.28%、77.20%.統(tǒng)計(jì)分析表明，3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量均與CK差異顯著.3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量變幅差異不大，300 mmol·L－1NaCl鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系N1與其他2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系差異顯著.

鹽脅迫15 d后各株系的SOD活性均隨著鹽脅迫濃度的升高而逐漸降低，表現(xiàn)為一定的濃度效應(yīng).但隨著鹽脅迫濃度的升高，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系SOD活性的降幅比對照組小(圖6).鹽脅迫濃度從50 mmol·L－1升高到300 mmol·L－1，對照組植株的SOD活性降幅高達(dá)442.41%，而轉(zhuǎn)基因N1、N17和N21株系的降幅僅為114.62%、106.79%和118.64%，表明轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性降幅均與對照有顯著差異.3個(gè)轉(zhuǎn)基因組株系的SOD活性變幅差異不大.

圖6 不同濃度NaCl處理對轉(zhuǎn)抗鹽基因楊樹植株葉片葉綠素相對含量、可溶性蛋白含量、MDA含量、SOD活性和POD活性的影響Fig.6 Effects of different concentrations of salt stress on the chlorophyll relative content，soluble protein content，MDA content，SOD activity and POD activity

對照組和轉(zhuǎn)基因植株的POD活性隨著脅迫濃度的升高均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢，均以100 mmol·L－1鹽脅迫處理的活性最高.對照組的峰值較3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系低，峰型平緩;而轉(zhuǎn)基因植株峰型較陡.與對照組株系相比，在高濃度鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株P(guān)OD活性降幅減小(圖6).50 mmol·L－1鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系與對照差異不顯著，其余各種濃度鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系葉片的POD活性均與對照組差異顯著.測得的耐鹽性各項(xiàng)生理數(shù)據(jù)表明，與對照組植株相比，轉(zhuǎn)抗鹽基因楊樹幼苗在鹽脅迫下GmNHX1基因得到表達(dá)，在一定程度上減輕了鹽脅迫對楊樹幼苗的毒害作用.

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明:隨著鹽脅迫濃度的提高和脅迫時(shí)間的延長，對照植株葉綠素相對含量降幅、可溶性蛋白含量降幅以及MDA含量增幅均低于對照植株;在100－300 mmol·L－1濃度下，轉(zhuǎn)基因植株的POD活性變化與對照植株有顯著差異.本研究結(jié)果還表明:轉(zhuǎn)抗鹽基因楊樹植株在鹽脅迫下誘導(dǎo)GmNHX1的表達(dá)，同樣能夠提高楊樹植株的抗鹽能力;而轉(zhuǎn)基因植株個(gè)體間耐鹽性的表達(dá)水平有差異，可能與外源基因的插入位點(diǎn)及調(diào)控方式不同有關(guān).

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