何麗梅，鄭德勇，葉乃興，3，葉小輝，趙 峰，楊江帆，3

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院;3.福建農(nóng)林大學(xué)茶葉科技與經(jīng)濟(jì)研究所;4.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

白茶是我國特有的茶葉品類，含有豐富的兒茶素類、黃酮類和黃酮醇類等有益于人體健康的物質(zhì).茶葉中的黃酮醇類物質(zhì)具有抗氧化、保護(hù)肝臟及清除自由基等功效［1－3］，對(duì)茶葉的色澤和滋味等品質(zhì)因子有一定的影響［4］，特別是楊梅素、槲皮素和山奈酚等是茶葉色澤的主要呈色物質(zhì).茶葉中黃酮醇類物質(zhì)多以糖苷的形態(tài)存在，黃酮醇苷存在形式的多樣性增加了其定性和定量研究的難度［5－6］，一般須經(jīng)水解成苷元后才能采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定.由于不同種類茶葉含有的黃酮醇苷的糖基可能不同，相對(duì)應(yīng)的適合其水解的條件也可能存在差異［7－8］.關(guān)于銀杏葉黃酮醇類物質(zhì)水解條件的研究較多，如前人［9－14］對(duì)銀杏葉中黃酮醇苷的水解條件進(jìn)行了優(yōu)化分析研究，優(yōu)化了黃酮醇類物質(zhì)水解及檢測的工藝.

為了探究茶葉中黃酮醇類物質(zhì)含量及其變化規(guī)律等，一些學(xué)者對(duì)茶葉中黃酮醇苷水解條件的影響因子進(jìn)行了相關(guān)研究.如盧邦俊等［15］、朱博等［16］采用HPLC方法對(duì)綠茶、紅茶、黃茶、普洱茶和烏龍茶中的黃酮醇類物質(zhì)進(jìn)行了分離檢測，獲得了最優(yōu)的黃酮醇類物質(zhì)水解條件，并建立了黃酮醇類物質(zhì)的檢測方法.本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化樣品制備中的水解條件，并對(duì)HPLC檢測法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和加標(biāo)回收率等進(jìn)行分析，首次建立白茶中黃酮醇類物質(zhì)的優(yōu)化檢測方法.

1 材料與方法

1.1 材料

白茶(白毫銀針)由福建品品香茶業(yè)有限公司提供.茶葉采用粉碎機(jī)粉碎，取過40目篩的粉末為試樣.

標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁(95%)、楊梅素(≥98%)、槲皮素(98.13%)和山奈酚(98.84%)購自四川成都曼斯特科技有限公司.乙腈和甲醇為HPLC級(jí)溶劑，其他試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為純水.

1.2 白茶浸提液的制備

稱取0.2 g(精確到0.0001 g)茶葉試樣于10 mL離心管中，加入5 mL經(jīng)預(yù)熱(70℃)的70%甲醇溶液(含2 g·L－1抗壞血酸)，充分拌勻潤濕后置于70℃水浴鍋中浸提10 min(每隔5 min攪拌一次)，浸提后冷卻至室溫，置于TGL-16高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛世爾科技公司)中離心10 min(7000 r·min－1，4℃)，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中;殘?jiān)偌尤? mL經(jīng)預(yù)熱(70℃)的70%甲醇溶液(含2 g·L－1抗壞血酸)提取一次.重復(fù)如上操作，合并提取液后用蒸餾水定容至10 mL，搖勻后備用.

1.3 白茶黃酮醇類物質(zhì)的HPLC測定

1.3.1 HPLC檢測條件 采用HPLC法測定白茶中黃酮醇類物質(zhì)的含量.供試Agilent1200高效液相色譜儀帶二極陣列管檢測器，Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm).流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的配制參照 GB/T 8313－2008［17］的方法，梯度洗脫程序:0－10 min，100%A、0%B;10－25 min，68%A、32%B;25－35 min，68%A、32%B;35－45 min，100%A、0%B.流動(dòng)相流速為1 mL·min－1，柱溫為 35℃，檢測波長為354(蘆丁)和372 nm(楊梅素、槲皮素和山奈酚)，進(jìn)樣量為10 μL，采用保留時(shí)間定性和外標(biāo)法定量.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 楊梅素、槲皮素和山奈酚用甲醇溶解并定容，蘆丁用70%甲醇溶解并定容，配制黃酮醇類物質(zhì)的儲(chǔ)備液和工作標(biāo)準(zhǔn)溶液.根據(jù)預(yù)先測定的白茶中各檢測對(duì)象的含量，各取一定體積的上述4種工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，用分析純甲醇定容至一定體積配制成系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后經(jīng)0.22 μmL膜過濾，采用HPLC法建立標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.3 HPLC檢測方法精密度和加標(biāo)回收率的測定 采用HPLC法測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中楊梅素、槲皮素、山奈酚和蘆丁的色譜圖峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組分含量，連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算HPLC檢測方法的精密度.將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到已知黃酮醇類物質(zhì)含量的白茶浸提液中，采用HPLC法測定樣品中各組分含量，連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算HPLC檢測方法的加標(biāo)回收率.

1.4 白茶黃酮醇苷的水解

1.4.1 黃酮醇苷的水解過程 移取5 mL白茶浸提液到10 mL定量試管中，加入5 mL鹽酸后在指定溫度下進(jìn)行水解操作，水解結(jié)束后立即將試管放入冰水浴中冷卻至25℃，再用70%甲醇溶液(含2 g·L－1抗壞血酸)定容至10 mL.取上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾后備用.

1.4.2 黃酮醇苷水解方法的優(yōu)化設(shè)計(jì) 前期研究表明，鹽酸濃度、水解溫度和水解時(shí)間是影響樣品制備精密度和加標(biāo)回收率的主要因素，采用正交試驗(yàn)方案L9(34)設(shè)置水解工藝條件(表1)，并以楊梅素、槲皮素和山奈酚的含量及其總和為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn).

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.4.3 水解方法精密度和加標(biāo)回收率的測定 移取5 mL白茶浸提液，加入0.1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行水解操作，采用HPLC法測定各組分含量;另取5 mL白茶浸提液，直接在優(yōu)化工藝條件下水解，而后用70%甲醇溶液(含2 g·L－1抗壞血酸)定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm膜過濾，采用HPLC法測定水解液中各組分含量，作為對(duì)照組;根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算水解方法的精密度和加標(biāo)回收率［16］;計(jì)算蘆丁的水解轉(zhuǎn)化率，蘆丁的水解轉(zhuǎn)化率/%=(槲皮素增加量/槲皮素分子質(zhì)量)/(蘆丁添加量/蘆丁分子質(zhì)量)×100.

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003和DPS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法建立測定黃酮醇類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用HPLC法測定楊梅素、槲皮素、山奈酚和蘆丁的單標(biāo)溶液和系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖峰面積，采用保留時(shí)間法定性，并以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為自變量，被測溶液含量為因變量，經(jīng)線性規(guī)劃得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(表2).

表2 蘆丁和3種黃酮醇類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 2 Standard curve of rutin and three flavonols

由表2可知，HPLC法所測定的4種物質(zhì)保留時(shí)間間隔較大，分離度好.建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均接近1，表明方程擬合度高，可在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析.

2.2 黃酮醇類物質(zhì)HPLC檢測方法的精密度和加標(biāo)回收率

測定并計(jì)算黃酮醇類物質(zhì)HPLC檢測方法的精密度和加標(biāo)回收率(表3、4).

表3 HPLC法測定蘆丁和3種黃酮醇類物質(zhì)的精密度Table 3 Determination precision of three flavonols and rutin by HPLC

表4 HPLC法測定蘆丁和3種黃酮醇類物質(zhì)的加標(biāo)回收率Table 4 The standard addition recovery rate of three flavonols and rutin by HPLC

由表3可知，蘆丁、楊梅素、槲皮素和山奈酚的精密度分別為3.48%、5.45%、0.54%和0.29%，表明HPLC檢測方法的精密度相對(duì)較高.

由表4可知，蘆丁、楊梅素、槲皮素和山奈酚的加標(biāo)回收率分別為94.04%、99.76%、92.27%和94.34%，表明HPLC檢測方法的加標(biāo)回收率均相對(duì)較高，均達(dá)到90%以上.

從HPLC檢測方法的精密度、加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性相關(guān)系數(shù)，且方法的精密度較高，加標(biāo)回收率也較高，可認(rèn)為該方法能對(duì)蘆丁、楊梅素、槲皮素和山奈酚進(jìn)行較好的定性、定量分析.

2.3 黃酮醇類物質(zhì)及其苷類的水解方法

采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以水解后白茶提取液中黃酮醇類物質(zhì)的含量為分析指標(biāo)，研究黃酮醇苷水解的主要影響因素，結(jié)果如表5所示.

表5 白茶水解工藝優(yōu)化方案與試驗(yàn)結(jié)果1)Table 5 The plan and results of white tea hydrolysis process optimization

由表5可知:若以楊梅素、槲皮素和山奈酚及3種黃酮醇類物質(zhì)總量為指標(biāo)，則8號(hào)處理有利于楊梅素苷和槲皮素苷的水解，5號(hào)處理有利于山奈酚苷的水解;A3B2C1(8號(hào)處理)是有利于3種黃酮醇苷總量水解的最優(yōu)條件.若以極差為指標(biāo)，楊梅素苷水解的影響因子從大到小依次為水解溫度、水解時(shí)間和鹽酸濃度;槲皮素苷和山奈酚苷水解的影響因子從大到小依次為水解溫度、鹽酸濃度和水解時(shí)間;3種黃酮醇苷總量水解的最優(yōu)條件為A2B2C3，即鹽酸濃度2 mol·L－1，水解溫度80℃，水解時(shí)間90 min.

2.4 水解方法驗(yàn)證試驗(yàn)的精密度和加標(biāo)回收率及最優(yōu)水解方法的確定

因參考不同指標(biāo)所得的較優(yōu)水解條件不同，因此對(duì)上述兩種水解方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn).精密度和加標(biāo)回收率是評(píng)價(jià)水解方法可行性的重要指標(biāo)，對(duì)上述兩種水解方法的精密度和加標(biāo)回收率進(jìn)行測定，結(jié)果如表6、7 所示.

表6 HPLC法測定3種黃酮醇類物質(zhì)的精密度Table 6 Determination precision of three flavonols by HPLC

表7 HPLC法測定3種黃酮醇類物質(zhì)的加標(biāo)回收率Table 7 The standard addition recovery rate of three flavonols by HPLC

由表6可知，水解方法A3B2C1中楊梅素、槲皮素和山奈酚的精密度均較高，分別為2.01%、0.87%和0.51%，而水解方法A2B2C3中楊梅素、槲皮素和山奈酚的精密度則較A3B2C1低，表明水解方法A3B2C1的精密度較高，有利于黃酮醇苷的水解.

由表7可知，水解方法A3B2C1中楊梅素、槲皮素和山奈酚的加標(biāo)回收率分別為79.30%、98.67%和103.43%，而水解方法 A2B2C3中楊梅素、槲皮素和山奈酚的加標(biāo)回收率分別為30.79%、63.82%和100.86%.且從加標(biāo)回收率可知，在水解過程中山奈酚最穩(wěn)定，楊梅素易被分解，水解時(shí)間越長則楊梅素越容易被分解.水解方法A3B2C1中蘆丁的水解轉(zhuǎn)化率為94.32%，水解方法A2B2C3中蘆丁的水解轉(zhuǎn)化率為79.33%.從黃酮醇類物質(zhì)的穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率的高低等可以看出，水解方法A3B2C1更有利于白茶中黃酮醇類物質(zhì)的檢測.

綜合上述分析可以得出:A3B2C1(8號(hào)處理)為白茶黃酮醇類物質(zhì)的最佳水解條件，即鹽酸濃度3 mol·L－1，水解溫度80℃，水解時(shí)間30 min，可使白茶提取液中黃酮醇苷總量的水解趨于最大化，且該水解方法用于測定白茶中黃酮醇類物質(zhì)的含量是可行的.

3 討論

本研究首次對(duì)白茶黃酮醇類物質(zhì)的測定方法進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果表明，白茶中槲皮素苷水解的影響因子從大到小依次為水解溫度、鹽酸濃度和水解時(shí)間;而綠茶中槲皮素苷水解的影響因子從大到小依次為水解溫度、水解時(shí)間和鹽酸濃度［16］.在最佳水解條件，即鹽酸濃度3 mol·L－1、水解溫度80℃和水解時(shí)間30 min下，白茶黃酮醇苷類物質(zhì)的水解可以實(shí)現(xiàn)最大化;而綠茶水解時(shí)間為2.0－2.5 h，黃茶水解時(shí)間為2.5 h，紅茶、普洱茶和烏龍茶的水解時(shí)間為1.5 h［16－17］.白茶黃酮醇類物質(zhì)的水解時(shí)間相對(duì)較短，適合于日常分析，且在實(shí)際操作中可提高測定效率.白茶黃酮醇類物質(zhì)最優(yōu)測定方法的精密度和加標(biāo)回收率相對(duì)較高，蘆丁的水解轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.32%，大于綠茶的蘆丁水解轉(zhuǎn)化率(82.74%)［16］.白茶最優(yōu)水解方法測定的楊梅素含量占總黃酮醇類物質(zhì)的22.27%，而盧邦俊等［15］研究表明，紅茶、黃茶、黑茶、綠茶和武夷巖茶中楊梅素含量占總黃酮醇類物質(zhì)的百分比均不超過20%，甚至在一些紅茶中未檢測出楊梅素.從白茶的楊梅素加標(biāo)回收率(79.30%)和綠茶的楊梅素加標(biāo)回收率(70.41%)［16］可知，白茶和綠茶的楊梅素在水解過程中均相對(duì)不穩(wěn)定，而白茶的水解時(shí)間較綠茶短，且白茶浸提液用含2 g·L－1抗壞血酸的70%甲醇溶液提取，可在一定程度上提高黃酮醇類物質(zhì)的抗氧化性，使白茶中楊梅素被水解的程度較綠茶低，但如何在水解過程中提高楊梅素的穩(wěn)定性還有待于進(jìn)一步研究.

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