宋予娟

【摘要】 目的 探討熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （FQ-PCR）法痰結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)及其臨床應(yīng)用。方法 分別以FQ-PCR， 集菌培養(yǎng)和染色鏡檢檢測(cè)入選患者的痰標(biāo)本， 比較各方法在結(jié)核病診斷中的作用。結(jié)果 三種檢測(cè)方法的敏感性為71.8%， 39.0%， 26.5%， 顯示FQ-PCR法敏感度最高。結(jié)論 FQ-PCR法具有簡(jiǎn)便、快捷、敏感、特異性高的特點(diǎn)， 可以快速及時(shí)準(zhǔn)確的為臨床提供診斷依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 痰；結(jié)核桿菌；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病， 曾一度得到控制， 但目前其仍是全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是結(jié)核病診斷和治療轉(zhuǎn)歸的重要依據(jù)。傳統(tǒng)結(jié)核桿菌檢測(cè)痰涂片抗酸染色鏡檢陽(yáng)性率低， 集菌培養(yǎng)周期太長(zhǎng)而熒光定量FQ-PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種重要的基因診斷技術(shù)[1]， 顯示出了其靈敏度高， 特異性強(qiáng)， 快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)， 得到了廣泛的應(yīng)用[2]。本研究采用Taqman熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年4月～2012年1月到本院診斷與治療患者的痰液標(biāo)本112份， 其中男74份， 女38份， 年齡17～65歲。病例入選根據(jù)臨床癥狀體征及胸部X線表現(xiàn)臨床診斷為結(jié)核病患者64例（肺結(jié)核組）， 非結(jié)核病患者48例（非結(jié)核組）。

1. 2 痰標(biāo)本收集 使用帶蓋無(wú)菌樣本盒， 交由患者自行留取痰標(biāo)本。要求患者晨起后漱口， 深咳出1～2口痰入樣本盒， 加蓋送檢。

1. 3 試劑和儀器 4%NaOH， FQ-PCR試劑盒由深圳凱杰生物工程有限公司提供， 儀器由上海宏石生產(chǎn)的熒光定量分析儀分析。

1. 4 抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法 操作參考《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[3]進(jìn)行。

1. 5 痰液DNA的提取 按試劑盒說(shuō)明書(shū)取0.9 ml痰標(biāo)本加入2倍樣本體積40%NaOH液化后13000 r/min離心10 min去上清液向沉淀中加入1 ml滅菌水， 充分震蕩混勻， 13000 r/min離心10 min去上清液重復(fù)洗滌3次。沉淀中加入30 μl DNA提取液充分震蕩混勻100℃水域10 min待冷卻至室溫13000 r/min離心10 min去上清液備用。

1. 6 FQ-RCR法 按試劑操作說(shuō)明書(shū)對(duì)上述DNA模版加入PCR反應(yīng)管， 按規(guī)定循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值（循環(huán)閾值）所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定出樣品的DNA拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

64例結(jié)核病例， 48例非結(jié)核病患者痰標(biāo)本染色鏡檢， 集菌培養(yǎng)， FQ-PCR， 其陽(yáng)性率分別為26.5%， 39.0%， 71.8%。而48例非結(jié)核組FQ-PCR檢測(cè)為0， 符合率100.0%。結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

結(jié)核桿菌有人型、牛型、鳥(niǎo)型、鼠型和冷血?jiǎng)游镄偷龋?對(duì)人類主要是人型， 結(jié)核桿菌主要感染途徑為呼吸道， 也可以通過(guò)破損黏膜和消化道等多種途徑進(jìn)入人體， 侵犯各部位組織， 引起相應(yīng)的結(jié)核病， 以肺結(jié)核多見(jiàn)， 此結(jié)核為乙類傳染病， 危害大， 肺結(jié)核早診斷并進(jìn)行正規(guī)治療對(duì)預(yù)后治療有明顯的影響。病原學(xué)檢查確認(rèn)結(jié)核桿菌感染是肺結(jié)核診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

由此可見(jiàn)， 直接涂片法雖具有簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)廉等特點(diǎn)， 但無(wú)法辨別出死菌和活菌且受實(shí)驗(yàn)室條件、人員環(huán)境、技術(shù)水品的影響較大， 靈敏度低， 特異性差， 各種抗酸桿菌均可著色， 有些耐藥菌對(duì)抗酸染色不敏感， 難以查到出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。集菌培養(yǎng)法， 時(shí)間長(zhǎng)且靈敏度低， 特異性差， 檢驗(yàn)結(jié)果滯后[1]。而FQ-PCR法簡(jiǎn)便快捷靈敏度高， 重復(fù)性好并且極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間， 適合應(yīng)用于結(jié)核病的臨床快速診斷。FQ-PCR方法檢測(cè)的是病原體核酸， 不管結(jié)核桿菌是否為活的細(xì)菌， FQ-PCR均能檢出， 因此， 在經(jīng)抗生素治療1個(gè)療程后， 必須兩周后才能做FQ-PCR檢測(cè)， 以避免臨床假陽(yáng)性。但目前試劑性能和結(jié)果檢測(cè)的方法各異， 在結(jié)核桿菌感染的診斷上， 抗酸染色和FQ-PCR同時(shí)陽(yáng)性即可確診。如FQ-PCR陽(yáng)性， 抗酸染色陰性， 應(yīng)重復(fù)檢測(cè)標(biāo)本， 直到FQ-PCR或抗酸染色陽(yáng)性才可確診；如抗酸染色陽(yáng)性， FQ-PCR法陰性， 應(yīng)重復(fù)檢測(cè)， 并排除非結(jié)核分歧桿菌感染的可能。并且FQ-PCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌變化情況， 觀察抗結(jié)核藥物的治療進(jìn)展為臨床醫(yī)生及時(shí)掌握患者的病情和開(kāi)展后續(xù)督導(dǎo)治療提供了動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)， 在實(shí)踐中起到了積極作用， 效果明顯， 有重要的臨床意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄔艷. 熒光定量PCR檢測(cè)痰結(jié)核桿菌特異性DNA序列及其臨床應(yīng)用. 中外醫(yī)學(xué)研究， 2012， 10（16）：65-67.

[2] 謝漢彬， 鄭崇輝， 黃國(guó)盛 . 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在檢測(cè)血漿結(jié)核桿菌DNA的應(yīng)用. 河北醫(yī)學(xué)， 2012， 18（5）：698-699.

[3] 金建東. 熒光定量PCR檢測(cè)痰結(jié)核桿菌DNA及其臨床應(yīng)用. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010， 31（22）：3565.

[收稿日期：2014-08-27]

【摘要】 目的 探討熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （FQ-PCR）法痰結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)及其臨床應(yīng)用。方法 分別以FQ-PCR， 集菌培養(yǎng)和染色鏡檢檢測(cè)入選患者的痰標(biāo)本， 比較各方法在結(jié)核病診斷中的作用。結(jié)果 三種檢測(cè)方法的敏感性為71.8%， 39.0%， 26.5%， 顯示FQ-PCR法敏感度最高。結(jié)論 FQ-PCR法具有簡(jiǎn)便、快捷、敏感、特異性高的特點(diǎn)， 可以快速及時(shí)準(zhǔn)確的為臨床提供診斷依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 痰；結(jié)核桿菌；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病， 曾一度得到控制， 但目前其仍是全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是結(jié)核病診斷和治療轉(zhuǎn)歸的重要依據(jù)。傳統(tǒng)結(jié)核桿菌檢測(cè)痰涂片抗酸染色鏡檢陽(yáng)性率低， 集菌培養(yǎng)周期太長(zhǎng)而熒光定量FQ-PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種重要的基因診斷技術(shù)[1]， 顯示出了其靈敏度高， 特異性強(qiáng)， 快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)， 得到了廣泛的應(yīng)用[2]。本研究采用Taqman熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年4月～2012年1月到本院診斷與治療患者的痰液標(biāo)本112份， 其中男74份， 女38份， 年齡17～65歲。病例入選根據(jù)臨床癥狀體征及胸部X線表現(xiàn)臨床診斷為結(jié)核病患者64例（肺結(jié)核組）， 非結(jié)核病患者48例（非結(jié)核組）。

1. 2 痰標(biāo)本收集 使用帶蓋無(wú)菌樣本盒， 交由患者自行留取痰標(biāo)本。要求患者晨起后漱口， 深咳出1～2口痰入樣本盒， 加蓋送檢。

1. 3 試劑和儀器 4%NaOH， FQ-PCR試劑盒由深圳凱杰生物工程有限公司提供， 儀器由上海宏石生產(chǎn)的熒光定量分析儀分析。

1. 4 抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法 操作參考《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[3]進(jìn)行。

1. 5 痰液DNA的提取 按試劑盒說(shuō)明書(shū)取0.9 ml痰標(biāo)本加入2倍樣本體積40%NaOH液化后13000 r/min離心10 min去上清液向沉淀中加入1 ml滅菌水， 充分震蕩混勻， 13000 r/min離心10 min去上清液重復(fù)洗滌3次。沉淀中加入30 μl DNA提取液充分震蕩混勻100℃水域10 min待冷卻至室溫13000 r/min離心10 min去上清液備用。

1. 6 FQ-RCR法 按試劑操作說(shuō)明書(shū)對(duì)上述DNA模版加入PCR反應(yīng)管， 按規(guī)定循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值（循環(huán)閾值）所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定出樣品的DNA拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

64例結(jié)核病例， 48例非結(jié)核病患者痰標(biāo)本染色鏡檢， 集菌培養(yǎng)， FQ-PCR， 其陽(yáng)性率分別為26.5%， 39.0%， 71.8%。而48例非結(jié)核組FQ-PCR檢測(cè)為0， 符合率100.0%。結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

結(jié)核桿菌有人型、牛型、鳥(niǎo)型、鼠型和冷血?jiǎng)游镄偷龋?對(duì)人類主要是人型， 結(jié)核桿菌主要感染途徑為呼吸道， 也可以通過(guò)破損黏膜和消化道等多種途徑進(jìn)入人體， 侵犯各部位組織， 引起相應(yīng)的結(jié)核病， 以肺結(jié)核多見(jiàn)， 此結(jié)核為乙類傳染病， 危害大， 肺結(jié)核早診斷并進(jìn)行正規(guī)治療對(duì)預(yù)后治療有明顯的影響。病原學(xué)檢查確認(rèn)結(jié)核桿菌感染是肺結(jié)核診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

由此可見(jiàn)， 直接涂片法雖具有簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)廉等特點(diǎn)， 但無(wú)法辨別出死菌和活菌且受實(shí)驗(yàn)室條件、人員環(huán)境、技術(shù)水品的影響較大， 靈敏度低， 特異性差， 各種抗酸桿菌均可著色， 有些耐藥菌對(duì)抗酸染色不敏感， 難以查到出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。集菌培養(yǎng)法， 時(shí)間長(zhǎng)且靈敏度低， 特異性差， 檢驗(yàn)結(jié)果滯后[1]。而FQ-PCR法簡(jiǎn)便快捷靈敏度高， 重復(fù)性好并且極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間， 適合應(yīng)用于結(jié)核病的臨床快速診斷。FQ-PCR方法檢測(cè)的是病原體核酸， 不管結(jié)核桿菌是否為活的細(xì)菌， FQ-PCR均能檢出， 因此， 在經(jīng)抗生素治療1個(gè)療程后， 必須兩周后才能做FQ-PCR檢測(cè)， 以避免臨床假陽(yáng)性。但目前試劑性能和結(jié)果檢測(cè)的方法各異， 在結(jié)核桿菌感染的診斷上， 抗酸染色和FQ-PCR同時(shí)陽(yáng)性即可確診。如FQ-PCR陽(yáng)性， 抗酸染色陰性， 應(yīng)重復(fù)檢測(cè)標(biāo)本， 直到FQ-PCR或抗酸染色陽(yáng)性才可確診；如抗酸染色陽(yáng)性， FQ-PCR法陰性， 應(yīng)重復(fù)檢測(cè)， 并排除非結(jié)核分歧桿菌感染的可能。并且FQ-PCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌變化情況， 觀察抗結(jié)核藥物的治療進(jìn)展為臨床醫(yī)生及時(shí)掌握患者的病情和開(kāi)展后續(xù)督導(dǎo)治療提供了動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)， 在實(shí)踐中起到了積極作用， 效果明顯， 有重要的臨床意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄔艷. 熒光定量PCR檢測(cè)痰結(jié)核桿菌特異性DNA序列及其臨床應(yīng)用. 中外醫(yī)學(xué)研究， 2012， 10（16）：65-67.

[2] 謝漢彬， 鄭崇輝， 黃國(guó)盛 . 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在檢測(cè)血漿結(jié)核桿菌DNA的應(yīng)用. 河北醫(yī)學(xué)， 2012， 18（5）：698-699.

[3] 金建東. 熒光定量PCR檢測(cè)痰結(jié)核桿菌DNA及其臨床應(yīng)用. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010， 31（22）：3565.

[收稿日期：2014-08-27]

【摘要】 目的 探討熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （FQ-PCR）法痰結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)及其臨床應(yīng)用。方法 分別以FQ-PCR， 集菌培養(yǎng)和染色鏡檢檢測(cè)入選患者的痰標(biāo)本， 比較各方法在結(jié)核病診斷中的作用。結(jié)果 三種檢測(cè)方法的敏感性為71.8%， 39.0%， 26.5%， 顯示FQ-PCR法敏感度最高。結(jié)論 FQ-PCR法具有簡(jiǎn)便、快捷、敏感、特異性高的特點(diǎn)， 可以快速及時(shí)準(zhǔn)確的為臨床提供診斷依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 痰；結(jié)核桿菌；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病， 曾一度得到控制， 但目前其仍是全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是結(jié)核病診斷和治療轉(zhuǎn)歸的重要依據(jù)。傳統(tǒng)結(jié)核桿菌檢測(cè)痰涂片抗酸染色鏡檢陽(yáng)性率低， 集菌培養(yǎng)周期太長(zhǎng)而熒光定量FQ-PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種重要的基因診斷技術(shù)[1]， 顯示出了其靈敏度高， 特異性強(qiáng)， 快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)， 得到了廣泛的應(yīng)用[2]。本研究采用Taqman熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年4月～2012年1月到本院診斷與治療患者的痰液標(biāo)本112份， 其中男74份， 女38份， 年齡17～65歲。病例入選根據(jù)臨床癥狀體征及胸部X線表現(xiàn)臨床診斷為結(jié)核病患者64例（肺結(jié)核組）， 非結(jié)核病患者48例（非結(jié)核組）。

1. 2 痰標(biāo)本收集 使用帶蓋無(wú)菌樣本盒， 交由患者自行留取痰標(biāo)本。要求患者晨起后漱口， 深咳出1～2口痰入樣本盒， 加蓋送檢。

1. 3 試劑和儀器 4%NaOH， FQ-PCR試劑盒由深圳凱杰生物工程有限公司提供， 儀器由上海宏石生產(chǎn)的熒光定量分析儀分析。

1. 4 抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法 操作參考《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[3]進(jìn)行。

1. 5 痰液DNA的提取 按試劑盒說(shuō)明書(shū)取0.9 ml痰標(biāo)本加入2倍樣本體積40%NaOH液化后13000 r/min離心10 min去上清液向沉淀中加入1 ml滅菌水， 充分震蕩混勻， 13000 r/min離心10 min去上清液重復(fù)洗滌3次。沉淀中加入30 μl DNA提取液充分震蕩混勻100℃水域10 min待冷卻至室溫13000 r/min離心10 min去上清液備用。

1. 6 FQ-RCR法 按試劑操作說(shuō)明書(shū)對(duì)上述DNA模版加入PCR反應(yīng)管， 按規(guī)定循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值（循環(huán)閾值）所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定出樣品的DNA拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

64例結(jié)核病例， 48例非結(jié)核病患者痰標(biāo)本染色鏡檢， 集菌培養(yǎng)， FQ-PCR， 其陽(yáng)性率分別為26.5%， 39.0%， 71.8%。而48例非結(jié)核組FQ-PCR檢測(cè)為0， 符合率100.0%。結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

結(jié)核桿菌有人型、牛型、鳥(niǎo)型、鼠型和冷血?jiǎng)游镄偷龋?對(duì)人類主要是人型， 結(jié)核桿菌主要感染途徑為呼吸道， 也可以通過(guò)破損黏膜和消化道等多種途徑進(jìn)入人體， 侵犯各部位組織， 引起相應(yīng)的結(jié)核病， 以肺結(jié)核多見(jiàn)， 此結(jié)核為乙類傳染病， 危害大， 肺結(jié)核早診斷并進(jìn)行正規(guī)治療對(duì)預(yù)后治療有明顯的影響。病原學(xué)檢查確認(rèn)結(jié)核桿菌感染是肺結(jié)核診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

由此可見(jiàn)， 直接涂片法雖具有簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)廉等特點(diǎn)， 但無(wú)法辨別出死菌和活菌且受實(shí)驗(yàn)室條件、人員環(huán)境、技術(shù)水品的影響較大， 靈敏度低， 特異性差， 各種抗酸桿菌均可著色， 有些耐藥菌對(duì)抗酸染色不敏感， 難以查到出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。集菌培養(yǎng)法， 時(shí)間長(zhǎng)且靈敏度低， 特異性差， 檢驗(yàn)結(jié)果滯后[1]。而FQ-PCR法簡(jiǎn)便快捷靈敏度高， 重復(fù)性好并且極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間， 適合應(yīng)用于結(jié)核病的臨床快速診斷。FQ-PCR方法檢測(cè)的是病原體核酸， 不管結(jié)核桿菌是否為活的細(xì)菌， FQ-PCR均能檢出， 因此， 在經(jīng)抗生素治療1個(gè)療程后， 必須兩周后才能做FQ-PCR檢測(cè)， 以避免臨床假陽(yáng)性。但目前試劑性能和結(jié)果檢測(cè)的方法各異， 在結(jié)核桿菌感染的診斷上， 抗酸染色和FQ-PCR同時(shí)陽(yáng)性即可確診。如FQ-PCR陽(yáng)性， 抗酸染色陰性， 應(yīng)重復(fù)檢測(cè)標(biāo)本， 直到FQ-PCR或抗酸染色陽(yáng)性才可確診；如抗酸染色陽(yáng)性， FQ-PCR法陰性， 應(yīng)重復(fù)檢測(cè)， 并排除非結(jié)核分歧桿菌感染的可能。并且FQ-PCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌變化情況， 觀察抗結(jié)核藥物的治療進(jìn)展為臨床醫(yī)生及時(shí)掌握患者的病情和開(kāi)展后續(xù)督導(dǎo)治療提供了動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)， 在實(shí)踐中起到了積極作用， 效果明顯， 有重要的臨床意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄔艷. 熒光定量PCR檢測(cè)痰結(jié)核桿菌特異性DNA序列及其臨床應(yīng)用. 中外醫(yī)學(xué)研究， 2012， 10（16）：65-67.

[2] 謝漢彬， 鄭崇輝， 黃國(guó)盛 . 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在檢測(cè)血漿結(jié)核桿菌DNA的應(yīng)用. 河北醫(yī)學(xué)， 2012， 18（5）：698-699.

[3] 金建東. 熒光定量PCR檢測(cè)痰結(jié)核桿菌DNA及其臨床應(yīng)用. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010， 31（22）：3565.

[收稿日期：2014-08-27]