張輝 袁治國 邵建軍

（甘肅省第二人民醫(yī)院骨科 蘭州730000）

斷肢（指）再植是指失去血液供應(yīng)的離斷肢體，通過手外科與顯微外科手術(shù)重建其血液循環(huán)使肢（指）體獲得再生的手術(shù)[1]。斷肢再植術(shù)后?？梢鹬w缺血-再灌注損傷[2]，如何減輕肢體缺血再灌注的損傷，降低肢體缺血再灌注后的致殘率和死亡率逐漸成為研究的熱點(diǎn)，而中藥對肢體缺血-再灌注損傷保護(hù)作用的研究也愈來愈受到重視。本研究以名方補(bǔ)陽還五湯為基礎(chǔ)，建立大鼠下肢斷肢再植術(shù)后缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injure，IRI）動(dòng)物模型，再灌注即刻給予補(bǔ)陽還五湯灌胃，初步探討補(bǔ)陽還五湯對大鼠下肢缺血-再灌注損傷中的影響，評估其對缺血組織的保護(hù)作用及機(jī)制，為進(jìn)一步開展臨床上應(yīng)用補(bǔ)陽還五湯防治肢體缺血-再灌注損傷奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康清潔級SD大鼠，雄性，體重250～320 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK2012-0106-0001418。

1.2 藥品與試劑 補(bǔ)陽還五湯（甘肅省第二人民醫(yī)院藥劑科配置）；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、一氧化氮試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20070605、20070606、20071228）；戊巴比妥鈉粉劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20060401）；M-MLv 逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司提供）；Trizol試劑、耐熱 DNA聚合酶及DNAMaker（天根生化科技〈北京〉有限公司提供）；PCR引物（武漢博士德生物工程有限公司提供）。

1.3 主要儀器 SpectraMax190酶標(biāo)儀，Molecular Devices，美國；TDZ4-WS低速臺式離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；756MC紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；FA1004天平（上海精科天平廠）；原子吸收分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司，型號：UV-9100）；低溫高速離心機(jī)（eppendorf公司，5415R型）；光學(xué)顯微鏡、攝像頭（Olympus BX41，SPOT-CCD，diagnostic公司）；透射電鏡（荷蘭菲利浦，TECNAL-10）；PCR擴(kuò)增儀（eppendorf公司出品）；Versa Doc 5000Mp成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司出品）。

2 方法

2.1 肢體缺血-再灌注損傷動(dòng)物模型的建立 健康Wistar大鼠術(shù)前常規(guī)禁食12 h，自由飲水。3%戊巴比妥鈉（事先用蒸餾水和戊巴比妥鈉粉劑配制）30 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥固定于操作臺上，在后肢股三角處剪毛，于腹股溝處沿血管走行縱行切開皮膚、皮下組織，鈍性分離縫匠肌后部，游離股動(dòng)脈、股靜脈和股神經(jīng)，迅速切斷動(dòng)、靜脈，在股動(dòng)、靜脈近端分別用動(dòng)、靜脈夾夾閉，并用張力帶于股鞘下環(huán)綁扎肢體阻斷側(cè)支循環(huán)。4|h后行血管吻合，斷肢再植，恢復(fù)血流灌注4 h，后肢顏色恢復(fù)紅潤，制成缺血-再灌注模型。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 健康Wistar大鼠120只，隨機(jī)分為四組，每組30只：（1）正常對照組（A組），僅麻醉及生理鹽水灌胃；（2）補(bǔ)陽還五湯組（B組），缺血4 h后行血管吻合，斷肢再植，補(bǔ)陽還五湯灌胃；（3）依達(dá)拉奉組（C組），缺血4 h后行血管吻合，斷肢再植，血栓通注射液灌胃；（4）空白對照組（D組），缺血4 h后行血管吻合，斷肢再植，生理鹽水灌胃。

2.3 指標(biāo)的測定 （1）血液標(biāo)本的采集：每組選10只造模成功的大鼠，分別于再灌注4 h后處死，做中下腹正中切口，暴露下腔靜脈用皮試針頭穿刺，自下腔靜脈取靜脈血約2～3 mL，分離血清，測定血清中MPO、LDH、tNOS、iNOS、cNOS、SOD 的 活 性 和MDA、NO及Ca2+的含量。（2）腓腸肌標(biāo)本的采集：每組大鼠分別取后肢腓腸肌組織后取約200 mg入凍存管低溫保存，測Ca2+負(fù)載；約200 mg胖腸肌組織用冰生理鹽水沖洗后低溫保存經(jīng)后續(xù)處理，測SOD活性及MDA濃度；50～100 mg入經(jīng)DEPC水處理并滅菌的凍存管放入液氮中保存，做RT-PCR。每只大鼠順肌纖維方向切下大小約為0.1 cm×0.1 cm×0.3 cm的肌肉標(biāo)本2～3塊，用牙簽小心移入裝有預(yù)冷2.5%戊二醛的標(biāo)本瓶內(nèi)，4℃冷藏，經(jīng)后續(xù)處理后透射電鏡觀察。余下部分用10%中性多聚甲醛固定，經(jīng)后續(xù)處理后普通光鏡觀察。（3）腓腸肌組織提取總RNA，采用RT-PCR半定量分析Bcl-2 mRNA和Bax-mRNA轉(zhuǎn)錄水平。（4）通過石蠟切片及HE染色、電鏡觀察腓腸肌組織形態(tài)學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以（±S）表示，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肢體成活情況 再灌注1周后，觀察再植術(shù)后肢體成活情況。補(bǔ)陽還五湯組20只大鼠，肢體全部成活，成活率100%；空白對照組20只大鼠，術(shù)后有6只大鼠逐漸出現(xiàn)肢體壞死，成活14只，成活率70%；提示補(bǔ)陽還五湯組肢體成活率明顯增高（P＜0.01）。依達(dá)拉奉組成活18只，成活率90%，與補(bǔ)陽還五湯組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.2 血清 MPO、LDH 和 NOS（tNOS、iNOS、cNOS）指標(biāo)變化 再灌注4 h后，與正常組比較，補(bǔ)陽還五湯組、依達(dá)拉奉組血清中MPO、LDH、tNOS、iNOS的活性均增高（P＜0.01），空白對照組中血清中cNOS活性降低（P＜0.05），補(bǔ)陽還五湯組血清中cNOS活性增高（P＜0.05）。與空白對照組相比較，補(bǔ)陽還五湯組血清中 MPO、LDH、iNOS活性均降低（P＜0.05），tNOS、cNOS 活性增高（P＜0.05）。見表1。

表1 血清MPO、LDH和 NOS（tNOS、iNOS、cNOS）指標(biāo)變化比較 （±S） （U/L）

表1 血清MPO、LDH和 NOS（tNOS、iNOS、cNOS）指標(biāo)變化比較 （±S） （U/L）

注：與 A 組比較，*P＜0.01，△P＜0.05；與 D 組比較，#P＜0.05。

組別 MPO LDH tNOS iNOS cNOS A組B組C組D組47.56±4.24 70.13±7.28*#113.23±6.12*213.59±5.18 3 548.87±239.16 4 602.18±342.13*#5 261.87±142.24*6 128.71±428.13 21.18±5.32 30.12±4.28*#29.32±6.15*23.49±4.58 7.26±2.01 8.96±1.12*#10.21±3.21*13.17±1.30 13.73±2.87 19.41±2.94△#20.17±3.21△#10.32±4.82△

3.3 各組SOD、NO、MDA、Ca2+濃度測定 下肢再植術(shù)后4 h，與空白對照組相比，其余三組血清中SOD活性、NO、MDA含量均明顯降低（P＜0.01），鈣負(fù)載水平較低（P＜0.01）。與C組相比，補(bǔ)陽還五湯組能有效降低血清中SOD、NO、Ca2+含量，MDA含量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組SOD、NO、MDA、Ca2+濃度比較 （±S）

表2 各組SOD、NO、MDA、Ca2+濃度比較 （±S）

注：與D組比較，*P＜0.01；與C組比較，#P＜0.05。

組別SOD（U/mg）NO（μmol/L）MDA（nmol/g）Ca2+（mg/kg）A組B組C組D組1.08±0.1*1.60±0.2*#1.65±0.4*1.96±0.8 21.04±5.4*68.92±16.3*#76.51±11.2*108.84±14.1 23.33±6.2*53.22±9.4*53.19±6.8*97.31±19.6 8.26±1.6*158.46±18.2 164.19±13.2 211.33±53.4*#*

3.4 RT-PCR結(jié)果 肢體缺血可導(dǎo)致骨骼肌Bcl-2基因表達(dá)、Bcl-2/Bax的比值降低，Bax基因表達(dá)增高；再灌注后Bcl-2基因表達(dá)、Bcl-2/Bax的比值進(jìn)一步降低，Bax基因表達(dá)進(jìn)一步增高；應(yīng)用補(bǔ)陽還五湯后，Bcl-2基因表達(dá)、Bcl-2/Bax的比值與對照組比明顯增加，Bax基因表達(dá)與對照組比則明顯下降。見表3。

表3 Bcl-2、Bax、β-actin基因RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶光強(qiáng)度值比值比較 （±S）

表3 Bcl-2、Bax、β-actin基因RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶光強(qiáng)度值比值比較 （±S）

項(xiàng)目 A組 B組 C組 D組Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Bcl-2/Bax 1.8171±0.0638 1.2143±0.0451 1.4964±0.0312 1.6536±0.0102 1.6788±0.1004 0.9850±0.0120 1.7453±0.0115 1.6963±0.0378 1.0289±0.0415 0.8918±0.1102 2.8358±0.2172 0.3145±0.0072

3.5 大鼠下肢缺血再灌注4 h后骨骼肌HE染色光鏡下結(jié)構(gòu)的變化 正常的骨骼肌肌纖維粗細(xì)均勻，排列整齊；缺血后肌纖維水腫，排列不整齊，部分溶解，并可見有少量白細(xì)胞與紅細(xì)胞滲出；再灌注后肌纖維出現(xiàn)水腫變性、斷裂甚至溶解，肌細(xì)胞嚴(yán)重破壞，斷裂肌纖維間有大量白細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤；給藥后缺血再灌注組骨骼肌水腫明顯減輕，肌纖維變性較對照組為輕，炎性細(xì)胞浸潤不明顯。

4 討論

各種原因造成的肢體缺血是血管外科和創(chuàng)傷外科常見的病理生理過程，恢復(fù)缺血肢體的血液供應(yīng)是肢體得以存活和保持功能的關(guān)鍵，但缺血組織再灌注又可導(dǎo)致缺血組織的進(jìn)一步損傷，稱為缺血-再灌注損傷[3～4]。組織損傷可進(jìn)一步引發(fā)遠(yuǎn)隔器官的損傷，進(jìn)一步發(fā)展可演變成全身炎性反應(yīng)綜合征，甚至多器官功能衰竭，危及生命。缺血-再灌注損傷的概念最早由Mccord[5]于1985提出，到目前為止，學(xué)者們已經(jīng)在多種組織、器官中發(fā)現(xiàn)再灌注損傷的存在[6～7]。如何能消除再灌注損傷，進(jìn)一步減少組織損傷、保護(hù)細(xì)胞功能和避免缺血壞死區(qū)擴(kuò)大已經(jīng)越來越引起學(xué)者們的關(guān)注。

補(bǔ)陽還五湯始載于《醫(yī)林改錯(cuò)》，由王清任所創(chuàng)，大補(bǔ)元?dú)饧嬉曰钛?，使虧損之五成元?dú)饣謴?fù)，是謂“還五”，而陽氣重新周行全身回復(fù)“十全”，故王氏稱此方為“補(bǔ)陽還五湯”[8]。方由黃芪、當(dāng)歸、芍藥、川芎、桃仁、紅花、地龍7味組成，本方各藥合用，使氣足以推動(dòng)血行，瘀去絡(luò)通，則筋肉得養(yǎng)，痿廢可愈。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明[9]，本方功能廣泛，可抑制血小板聚集、抗血栓形成或溶血栓；擴(kuò)張血管、增加血流量；改善血液流變性和微循環(huán)；增加心肌營養(yǎng)性并有強(qiáng)心作用；對急性缺血損傷有預(yù)防作用；對神經(jīng)損傷有修復(fù)作用；可降血脂和抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成；耐缺氧和抗疲勞、抗炎并可提高免疫功能。

氧自由基主要是指超氧陰離子（O2-）和羥自由基（OH-）。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為氧自由基是造成缺血-再灌注損傷的重要因素，認(rèn)為氧自由基是缺血再灌注損傷的重要發(fā)病環(huán)節(jié)[10]。氧自由基對細(xì)胞的主要損害是造成脂質(zhì)過氧化，其代謝產(chǎn)物為MDA，通過測定MDA的含量，能夠反映氧自由基的代謝及脂質(zhì)過氧化對機(jī)體的損傷程度。NO本身就是一種自由基性質(zhì)的物質(zhì)，在再灌注損傷中，由于細(xì)胞內(nèi)鈣超載，可激活一氧化氮合酶（NOS），使NO增加，NO與O2反應(yīng)生成NO2，可使SOD的酪氨酸硝基化，從而使缺血后細(xì)胞潰變[11]。缺血時(shí)ATP生成減少，細(xì)胞Na+-Ca2+交換增加，再灌后恢復(fù)了能量供應(yīng)和ATP值，促進(jìn)Na+-Ca2+交換，使細(xì)胞外鈣大量內(nèi)流，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，Ca2+濃度升高可激活多種磷脂酶，促進(jìn)蛋白質(zhì)分解酶合成增加、血小板活化因子合成增加；激活磷脂酶促進(jìn)膜磷脂的分解，破壞細(xì)胞和線粒體膜及促進(jìn)氧自由基形成，造成細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷[12]。當(dāng)肢體缺血達(dá)到一定程度，骨胳肌細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞水腫，細(xì)胞膜通透性增高，細(xì)胞內(nèi)含有的大量LDH入血，因而血中LDH活性變化可作為缺血后骨骼肌損傷的指標(biāo)[13]。Bcl-2和Bax對細(xì)胞凋亡的調(diào)控，不僅取決于自身表達(dá)水平的高低，還與Bcl-2/Bax的比值有關(guān)，比值增加，細(xì)胞趨于存活，反之則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。依達(dá)拉奉是一種作用機(jī)理明確的新型的自由基清除劑[15]，主要通過提供電子直接清除羥自由基（OH-），抑制自由基的生成及細(xì)胞膜過氧化連鎖反應(yīng)，有效地抑制氧自由基對機(jī)體造成的損傷，抑制細(xì)胞凋亡。依達(dá)拉奉在缺血再灌注早期通過清除過多的羥自由基，有效地提高SOD的活性，降低MDA、MPO。抑制血管內(nèi)細(xì)胞遭受氧自由基的損傷，減輕血管通透性，減少間質(zhì)水腫、間質(zhì)血管擴(kuò)張以及炎性細(xì)胞因子的釋放，從而保護(hù)肌組織灌注正常和軟骨組織未發(fā)生退行性改變[16]。

本課題以依達(dá)拉奉作為對照組，研究結(jié)果表明：補(bǔ)陽還五湯能有效降低肢體缺血-再灌注后氧自由基產(chǎn)生，增強(qiáng)SOD活性，減輕有鈣超載所導(dǎo)致肢體缺血-再灌注損傷；能夠減少血漿NO的生成；改善微循環(huán)，擴(kuò)張血管，抗血小板聚集，抗血栓形成；降低鈣超載，減輕內(nèi)皮細(xì)胞損害。顯著改善大鼠缺血再灌注后肢體修復(fù)狀況，并明顯提高斷肢再植成活率，抑制大鼠血清LDH活性的升高，減少血清MDA水平。通過增強(qiáng)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)和減弱促凋亡基因Bax表達(dá)來抑制肢體缺血再灌注后骨骼肌細(xì)胞的凋亡，減輕肢體缺血-再灌注損傷。光鏡下觀察肢體缺血再灌注后骨骼肌HE圖像，可以看到骨骼肌組織在缺血后出現(xiàn)肌纖維水腫，炎性細(xì)胞浸潤；再灌注后組織水腫加重，大量的炎性細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)肌纖維斷裂、變性、溶解；而經(jīng)補(bǔ)陽還五湯處理后的骨骼肌圖像肌纖維水腫、變性、炎性細(xì)胞浸潤都相對缺血組和再灌注組減輕。透射電鏡結(jié)果可見，肢體在缺血和再灌注后，肌纖維細(xì)胞凋亡程度逐漸加重，而給藥后肌纖維細(xì)胞凋亡均較對照組為輕，這也支持Bcl-2、Bax基因RT-PCR的結(jié)果，說明補(bǔ)陽還五湯能夠改善肢體缺血再灌注后骨骼肌損傷程度。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯對大鼠斷肢再植術(shù)后肢體缺血-再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，通過抗氧化、清除自由基、抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡來達(dá)到對缺血再灌注后損傷骨骼肌的改善保護(hù)作用。本課題的不足在于目前尚無療效確切的單味西藥作為臨床對照；沒有對再植術(shù)后成活肢體的功能進(jìn)行評定，補(bǔ)陽還五湯在術(shù)后肢體功能重建中的保護(hù)、修復(fù)作用尚需進(jìn)一步研究。

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