李京京 ， 方 芳 ， 張繼冉 ， 劉 龍 *，3， 堵國成 ，3，4， 陳 堅(jiān) ，4

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；4.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是發(fā)酵食品[1-2]和發(fā)酵酒[3-4]生產(chǎn)過程中自然產(chǎn)生的副產(chǎn)物，對(duì)人體具有潛在的致癌性和遺傳毒性[5-6]，能夠引起肺腫瘤、肝癌、皮膚癌等。2007年，世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將氨基甲酸乙酯由2B類致癌物提升為2A類[7]級(jí)別。因此，EC在發(fā)酵食品中的存在可能會(huì)影響人體健康，必須采取有效措施控制EC在發(fā)酵食品中的含量。

研究人員采取一些措施控制氨基甲酸乙酯的生成。如通過選育低產(chǎn)尿素酵母菌[8]、向發(fā)酵食品中添加脲酶[9]、控制發(fā)酵條件[10-11]等方法來減少葡萄酒和韓國傳統(tǒng)米酒中氨基甲酸乙酯的生成量，但是由于氨基甲酸乙酯生成途徑多樣[12]，上述方法不能解決其他途徑生成氨基甲酸乙酯的問題。并且氨基甲酸乙酯性質(zhì)穩(wěn)定，一旦形成不容易去除。20世紀(jì)90年代，國外學(xué)者分別從小鼠糞便和小鼠腸道中篩選得到了檸檬酸桿菌和地衣芽孢桿菌等氨基甲酸乙酯降解菌株[13-14]，但由于其產(chǎn)酶能力低下，難以滿足食品工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用，并且降解菌株的食品安全性問題也是影響其應(yīng)用的原因之一。近幾年，國內(nèi)研究者也篩選到能夠降解氨基甲酸乙酯的菌株[15-16]，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究。但各種微生物的降解特性不同，且發(fā)酵食品的成分復(fù)雜，限制了降解菌株的實(shí)際應(yīng)用。因此，篩選更多能夠降解氨基甲酸乙酯的食品級(jí)安全菌株，研究其降解特性，并實(shí)現(xiàn)氨基甲酸乙酯降解酶的外源表達(dá)，對(duì)食品中氨基甲酸乙酯的去除尤為重要。

作者從小鼠腸道內(nèi)篩選得到一株能夠降解氨基甲酸乙酯的賴氨酸芽孢桿菌，并考察了氨基甲酸乙酯水解酶純酶的酶學(xué)特性，為今后酶的定向分子改造和修飾、提高催化效率、奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 氨基甲酸甲酯（Methyl carbamate）、氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate）、氨基甲酸丁酯（n-Butyl carbamate）、乙酰胺（Acetamide）、谷氨酰胺（L-glutamine）、苯甲酰胺（Benzamide），均購自Sigma-Aldrich公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，購自碧云天公司；酵母粉、蛋白胨，購自O(shè)xoid公司；其他常用試劑均為市售分析純。

1.1.2 儀 器 HiTrap Q XL、Phenyl HP、Mono Q、Superdex-200 prep grade純化柱，KTA FPLC蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，購自GE公司；Mini-PROTEAN?蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)，購自美國伯樂公司。

1.1.3 菌種 賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus fusiformis SCO2由作者所在研究室分離自小鼠腸道內(nèi)，并保藏于中國典型微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2012414。

1.1.4 培養(yǎng)基

1）種子培養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L，氯化鈉 10 g/L；pH 7.0。

2）活化培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基）：在LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉20 g/L。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g/L，牛肉膏 3 g/L，氯化鈉 5 g/L；pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 酶活力測(cè)定 根據(jù)Berthelot反應(yīng)[17]顯色法，在波長(zhǎng)625 nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算酶活。具體步驟如下：取兩支10 mL的比色管，分別加入1 mL酶液和超純水。然后在兩管中分別加入1 mL含3 g/dL氨基甲酸乙酯的20 mmol/L磷酸緩沖液，振蕩混勻，在37℃恒溫水浴箱中反應(yīng)15 min后，在兩管中各加入1 mL終止劑 （體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸），混勻后加入顯色劑，強(qiáng)烈震蕩混勻，繼續(xù)在37℃恒溫水浴箱中保溫20 min后取出，用超純水定容到10 mL，625 nm處比色，并計(jì)算酶活。在此實(shí)驗(yàn)條件下，定義每分鐘分解底物產(chǎn)生1 μmol NH4+所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 以牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bradford法[18]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析 根據(jù)《工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》中方法[19]，對(duì)純化后的氨基甲酸乙酯水解酶蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE。上層濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，下層分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。首先采用電壓80 V，聚集蛋白質(zhì)，至蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠后，電壓改為100 V，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)染料電泳至凝膠底部時(shí)，結(jié)束電泳。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色1 h，甲醇-冰醋酸脫色液脫色2 h，觀察凝膠，確定酶蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.4 賴氨酸芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化

1）粗酶液的制備：將保存于-80℃冰箱的菌種，在含有3 g/dL氨基甲酸乙酯的平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，30℃培養(yǎng)24 h。4℃下10 000 r/min離心20 min，棄上清液收集菌體。用20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次后重懸菌體。將待破樣品放于冰水浴上，超聲功率25 W，破1 s停1 s超聲破碎至溶液清亮。將破碎液于4℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液即為所需粗酶液。

2）硫酸銨分級(jí)沉淀：將固體硫酸銨研磨至細(xì)粉狀，在70℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量。將固體硫酸銨緩慢加入到粗酶液中并不斷攪拌，至30%飽和度，4℃靜置4 h，10 000 r/min離心20 min，棄沉淀取上清液。向上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80%飽和度，如上述條件下進(jìn)行沉淀，后離心棄上清液取沉淀。將蛋白質(zhì)沉淀溶解于適量20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，用10 kDa透析袋在相同的緩沖溶液中對(duì)蛋白質(zhì)樣品透析脫鹽至無NH4+存在。

3）離子交換層析：起始緩沖液A為20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。采用HiTrap Q XL 1 mL的陰離子交換柱，先用起始緩沖液平衡交換柱，上樣后用洗脫緩沖液梯度洗脫蛋白質(zhì)，采用梯度體積分?jǐn)?shù)20%B，40%B，60%B，80%B，100%B液洗脫，體積流量為1 mL/min，收集2 mL/管，測(cè)定各管酶活，合并有活性管并透析除鹽。

4）疏水層析：起始緩沖液C為20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液D為含1 mol/L（NH4）2SO4的 20 mmol/L pH 7.0 的磷酸鹽緩沖溶液。向蛋白質(zhì)樣品中緩慢加入固體硫酸銨至終濃度為1 mol/L，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，上樣于提前經(jīng)D液平衡的Phenyl HP 1 mL的疏水柱，采用梯度體積分?jǐn)?shù) 100%D，80%D，60%D，40%D，20%D 液洗脫，體積流量為1 mL/min，收集2 mL/管，分別測(cè)定收集各管酶活性，合并活性管并透析除鹽。

5）離子交換層析：起始緩沖液E為20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液F為含1 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。將上步純化的蛋白質(zhì)上樣至Mono Q 5/50GL離子柱，采用線性洗脫方式，體積流量為1 mL/min，收集2 mL/管，測(cè)定各管收集液酶活，合并有活性各管。

6）凝膠過濾層析：Superdex-200 prep grade凝膠柱，進(jìn)樣量為0.5 mL，柱體積120 mL，緩沖液為20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，體積流量0.5 mL/min。收集出峰處酶液，測(cè)定不同出峰處酶活，合并有酶活各管，SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.5 氨基甲酸乙酯水解酶的酶學(xué)性質(zhì)

1）酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性：將純化得到的酶液與底物分別在 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃不同的溫度下反應(yīng)，測(cè)定相應(yīng)條件下的酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液在上述不同的溫度條件下保溫1 h后，調(diào)整酶液至最適反應(yīng)溫度，并在最適溫度下測(cè)定殘余酶活力，確定酶的熱穩(wěn)定性。

2）酶的最適反應(yīng)pH：酶促反應(yīng)分別在檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.0～6.0）、磷酸鹽緩沖液（pH 7.0～7.5）、硼酸鹽緩沖液（pH 8.0）的緩沖體系中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束測(cè)定不同pH條件下的酶活，確定最適反應(yīng)pH。

3）酶對(duì)NaCl和乙醇的耐受性檢測(cè)：將純化得到的氨基甲酸乙酯水解酶在不同NaCl的緩沖液中保溫1 h（對(duì)照組添加相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl），測(cè)定酶活，計(jì)算各NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下相對(duì)酶活，確定NaCl對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響。將純化得到的氨基甲酸乙酯水解酶在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇緩沖液中保溫1 h（對(duì)照組添加相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)乙醇），測(cè)定酶活，計(jì)算各乙醇條件下相對(duì)酶活，確定乙醇對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響。

4）金屬離子、EDTA對(duì)酶活力的影響：將酶液與終濃度為1 mmol/L的金屬離子或EDTA的緩沖液混合，在37℃條件下保溫5 min，測(cè)定酶活力。以未添加金屬離子測(cè)得酶活為100%，確定金屬離子對(duì)酶活力的影響。

5）酶的底物特異性檢測(cè)：在最適溫度和最適pH條件下，將純酶液分別與質(zhì)量濃度為3 g/dL氨基甲酸乙酯、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、L-谷氨酰胺、苯甲酰胺反應(yīng)，測(cè)定相應(yīng)酶活，以酶對(duì)氨基甲酸乙酯的酶活為100%，換算得到酶對(duì)其他底物的降解活性。

6）動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定：分別測(cè)定氨基甲酸乙酯水解酶在1～30 mmol/L氨基甲酸乙酯體系中的反應(yīng)速度，根據(jù)底物濃度與反應(yīng)初速度之間的關(guān)系，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km與Kcat。

2 結(jié)果與分析

2.1 賴氨酸芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化

將細(xì)胞破碎后獲得的粗酶液依次經(jīng)過硫酸銨沉淀、離子層析、疏水層析和凝膠層析多步純化，得到氨基甲酸乙酯水解酶的純酶。SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)（圖1）顯示，純化結(jié)果為單一條帶，達(dá)到電泳純，亞基分子量大小約為50 kDa。經(jīng)過純化（表1），氨基甲酸乙酯水解酶的純度提高了279倍，回收率為7%，酶的比活力達(dá)81.7 U/mg。

圖1 純化后的賴氨酸芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶Fig.1 Purified urethanase from Lysinibacillus fusiformis

表1 賴氨酸芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶的純化Table 1 Purification of urethanase from Lysinibacillus fusiformis

2.2 酶反應(yīng)的最適溫度及其穩(wěn)定性

如圖2所示，在10～60℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的逐漸升高，酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，最適反應(yīng)溫度為35℃；當(dāng)反應(yīng)溫度超過45℃后，酶活急劇下降，但在60℃時(shí)仍保持20%的酶活。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)氨基甲酸乙酯水解酶的活力影響Fig.2 Effects of temperature on the activity

由圖3可以看出，當(dāng)酶液在溫度為10～45℃條件下，酶活力可保持90%以上，具有較好的穩(wěn)定性；高于45℃后，酶活穩(wěn)定性顯著下降，當(dāng)溫度達(dá)到55℃以上，酶活幾乎完全喪失。

2.3 酶反應(yīng)的最適pH

pH值對(duì)酶活性的影響如圖4所示。當(dāng)pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)，隨著pH的升高，酶活逐漸升高，在pH為7.0時(shí)，酶活力達(dá)到最高；當(dāng)pH高于7.0后，酶活急劇下降；在pH為8.0時(shí)，酶活力完全喪失。上述結(jié)果表明，該氨基甲酸乙酯水解酶為中性酶。

圖3 溫度對(duì)氨基甲酸乙酯水解酶穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of temperature on urethanase stability

圖4 反應(yīng)pH值對(duì)氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響Fig.4 Effects of pH on urethanase activity

2.4 酶對(duì)鹽和乙醇的耐受性

氨基甲酸乙酯水解酶對(duì)NaCl和乙醇的耐受性分別如圖5和圖6所示。隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，酶活性都呈下降趨勢(shì)。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，酶活保留了10%，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，殘余酶活力為未經(jīng)NaCl處理酶活的8%。乙醇的添加同樣抑制了氨基甲酸乙酯水解酶的活性，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，酶活力保持了20%左右，乙醇體積分?jǐn)?shù)為18%時(shí)，殘余酶活力為5%。該結(jié)果表明，此氨基甲酸乙酯水解酶對(duì)低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl和低體積分?jǐn)?shù)乙醇具有一定耐受性，可為在醬油和黃酒中使用提供參考。

2.5 金屬離子與EDTA對(duì)酶活力的影響

各種金屬離子和EDTA對(duì)氨基甲酸乙酯水解酶活力的影響如表2所示，考察的所有金屬離子對(duì)酶活力有不同程度的抑制作用。 Mn2+、Zn2+、Ca2+、Co2+和 Mg2+抑制了 15%～20%的酶活力，F(xiàn)e2+和 Ni2+分別使酶活降為原來的49%和48%，而Cu2+嚴(yán)重抑制酶活達(dá)72%。上述金屬離子對(duì)酶活力無激活作用，且金屬螯合劑EDTA對(duì)酶活力無顯著影響，表明此酶是非金屬依賴型酶。

圖5 氨基甲酸乙酯水解酶對(duì)NaCl的耐受性Fig.5 Effects of NaCl on urethanase activity

圖6 氨基甲酸乙酯水解酶對(duì)乙醇的耐受性Fig.6 Effects of ethanol on urethanase activity

表2 金屬離子與EDTA對(duì)酶活力的影響Table 2 Effects of metal ions and EDTA on urethanase activity

2.6 酶的底物特異性

為了考察氨基甲酸乙酯水解酶的底物特異性，分別以氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、苯甲酰胺和谷氨酰胺為底物，檢測(cè)該酶對(duì)不同底物的水解能力。由表3可知，以氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸丁酯為底物時(shí)，隨著底物碳原子的增加，該酶的水解能力逐漸降低，對(duì)氨基甲酸丁酯的降解活性僅為對(duì)氨基甲酸乙酯的8%。此酶對(duì)乙酰胺有一定的降解作用，而對(duì)苯甲酰胺和谷氨酰胺則沒有降解效果。底物特異性的考察表明，此酶能夠特異性降解氨基甲酸乙酯。

表3 氨基甲酸乙酯水解酶底物特異性Table 3 Substrate specificity of urethanase

2.7 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

如圖7所示，以氨基甲酸乙酯為底物，測(cè)定不同底物濃度下酶促反應(yīng)速率。

圖7 賴氨酸芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶催化氨基甲酸乙酯的Lineweaver-Burk圖Fig.7 Lineweaver-Burk plots of purified urethanase from Lysinibacillus fusiform is

根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法得到方程

y=10.265x+0.273 6 （R2=0.999）

計(jì)算得出該氨基甲酸乙酯水解酶的Km值為37.5 mmol/L，轉(zhuǎn)化數(shù) Kcat為 1 176.4 s-1。

3 討論

課題研究中首次分離純化得到一種來自賴氨酸芽孢桿菌的氨基甲酸乙酯水解酶，并考察其酶學(xué)性質(zhì)。SDS-PAGE顯示其亞基分子量約為50 kDa，不同于地衣芽孢桿菌[14]（亞基分子量42 kDa）、馬紅球菌[20]（亞基分子量 55 kDa）、肺炎克雷伯氏菌[21]（亞基分子量 55 kDa）和變幻青霉[22]（亞基分子量13.7 kDa）來源的氨基甲酸乙酯水解酶的亞基分子量，表明此酶是一種新型的氨基甲酸乙酯水解酶。金屬離子對(duì)不同微生物源的氨基甲酸乙酯水解酶影響不同， 如終濃度 1 mmol/L 的 Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+對(duì)地衣芽孢桿菌[14]氨基甲酸乙酯水解酶無激活作用，而來源于肺炎克雷伯氏菌[21]的氨基甲酸乙酯水解酶活力卻受到Mn2+、Fe2+、Ca2+的顯著激活，酶活提高15%左右。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+、Cu2+、Ni2+顯著抑制了該氨基甲酸乙酯水解酶的活性，而EDTA對(duì)酶活性無影響，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。底物特異性的考察表明，其對(duì)氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丁酯的水解活性依次減小，與來源于地衣芽孢桿菌[14]的水解活性相反，其是隨著底物碳鏈長(zhǎng)度的增加，酶活力增強(qiáng)。考察此酶酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其能夠耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的NaCl和體積分?jǐn)?shù)15%的乙醇，保溫1 h后，殘余酶活逾8%，具有應(yīng)用在含鹽和乙醇的食品（醬油和黃酒等）中的潛力。

純化后的酶蛋白質(zhì)可通過N端測(cè)序并與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)得到序列信息，將有助于通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物和基因克隆的方式獲得該氨基甲酸乙酯水解酶的編碼基因，從而為外源高效表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)解析、催化機(jī)理的闡明和酶分子的定向改造奠定基礎(chǔ)，并實(shí)現(xiàn)應(yīng)用于不同食品中降解氨基甲酸乙酯。

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