陳鳳祥， 關(guān) 波， 陳 蘊(yùn)， 段作營(yíng)， 金 堅(jiān)， 李華鐘*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

干擾素 β（Interferon β，IFNβ）是由人成纖維細(xì)胞分泌的一種糖蛋白質(zhì)，它是一種具有廣譜抗病毒、抑制細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性的細(xì)胞因子，由166個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為22 000～23 000[1-2]。由于IFNβ相對(duì)分子質(zhì)量較小，易被腎小球?yàn)V過(guò)，因而在體內(nèi)的半衰期較短。作者所在實(shí)驗(yàn)室前期利用基因融合技術(shù)將IFNβ與人血清白蛋白質(zhì)（Human serum albumin，HSA）基因融合，并成功地在畢赤酵母（Pichia pastoris）KM71中進(jìn)行了表達(dá)，融合蛋白質(zhì)具有HSA和IFNβ的抗原性以及良好的臨床應(yīng)用前景[3]。

研究表明，外源蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)時(shí)，初生肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊、加工和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑超載，造成蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，成為外源蛋白質(zhì)分泌表達(dá)的限速步驟[4]。分子伴侶BiP是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的伴侶蛋白質(zhì)，能幫助新合成蛋白質(zhì)完成進(jìn)一步的折疊，或者與未折疊蛋白質(zhì)、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)結(jié)合并通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解（ER associated degradation，ERAD）途徑實(shí)現(xiàn)其降解[5-6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，共表達(dá)分子伴侶BiP能夠促進(jìn)畢赤酵母分泌外源蛋白質(zhì)[7]；但也有研究表明，BiP的過(guò)量共表達(dá)會(huì)對(duì)外源蛋白質(zhì)表達(dá)造成負(fù)面影響[8]。分析其原因可能是過(guò)表達(dá)BiP將導(dǎo)致其輔助分子伴侶Lhs1p或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)ATP等含量不足，過(guò)多的BiP不再能發(fā)揮分子伴侶活性，從而使蛋白質(zhì)進(jìn)入ERAD途徑而被降解[9-10]。

二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）能夠加速對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步折疊，主要負(fù)責(zé)二硫鍵的形成和異構(gòu)化，能夠防止新生多肽多聚體產(chǎn)生，而且能使錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)重新正確裝配[11]。二硫鍵的形成需要氧化型PDI再生，而黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（Endoplasmic reticulum oxidation 1，Ero1）能促進(jìn)氧化型PDI再生，從而激活其活性[12-13]。

研究中使用相對(duì)溫和的GAP啟動(dòng)子，構(gòu)建了共表達(dá)Ero1、PDI和BiP等蛋白質(zhì)折疊輔助因子的Pichia pastoris GS115/pPIC-IFNβ-HSA菌株，考察共表達(dá)這3種蛋白質(zhì)折疊輔助因子對(duì)融合蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

融合蛋白質(zhì)表達(dá)菌株P(guān)ichia pastoris GS115/pPIC-IFNβ-HSA和蛋白質(zhì)折疊輔助因子表達(dá)載體pGAP-Ero1、pGAP-PDI、pGAP-BiP 由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏，酵母表達(dá)載體pGAPZ B購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶AvrII，購(gòu)自Thermo公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母基因組提取試劑盒，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；酸洗玻璃珠 （500 μm），購(gòu)自Sigma公司；博來(lái)霉素（Zeocin），購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；酵母浸粉（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone Powder），購(gòu)自O(shè)XOID公司；其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 共表達(dá)轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建與驗(yàn)證

將 pGAP-Ero1、pGAP-PDI和 pGAP-BiP 共表達(dá)質(zhì)粒和pGAPZ B空載分別用AvrII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，電擊轉(zhuǎn)化GS115-IFNβ-HSA感受態(tài)細(xì)胞（1.5 kV、5 ms）[14]。 加入預(yù)冷的 1 mol/L 山梨醇30℃靜置培養(yǎng)1 h后，再加入YPD培養(yǎng)基30℃振蕩培養(yǎng) 2 h， 涂布 YPD平板 （含 400 μg/mL的Zeocin），置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

挑取若干YPD平板單菌落分別接種于5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中 （含 100 μg/mL Zeocin），200 r/min、30℃培養(yǎng)24 h，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用pGAP載體通用引物（正向：5′-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3′；反向：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以驗(yàn)證各蛋白質(zhì)折疊輔助因子基因的過(guò)表達(dá)載體是否成功整合至重組酵母菌中。

1.4 Ero1、PDI、BiP 的 Western blot分析

共表達(dá)菌株胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取及誘導(dǎo)表達(dá)參照pGAPZ B說(shuō)明書進(jìn)行。提取經(jīng)基因組DNA PCR驗(yàn)證正確的共表達(dá)菌株的胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot分析。

由于在構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，將Ero1、PDI和BiP終止密碼子去除，使得6×His標(biāo)簽分別與Ero1、PDI和BiP的C端融合表達(dá)（圖1）。因此，可利用抗6×His抗體檢測(cè)各蛋白質(zhì)折疊輔助因子是否在重組酵母胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)。

圖1 pGAP-Ero1、pGAP-PDI和pGAP-BiP質(zhì)粒圖譜Fig.1 Schematic map of pGAP-Ero1，pGAP-PDI and pGAP-BiP plasmids

1.5 共表達(dá) Ero1、PDI和 BiP菌株分泌表達(dá)IFNβ-HSA的SDS-PAGE和Western blot分析

接種共表達(dá) Ero1、PDI和 BiP的重組菌株至BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲菌體后在BMMY培養(yǎng)基中用體積分?jǐn)?shù)2%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，將不同誘導(dǎo)時(shí)間的發(fā)酵液離心后取上清液，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，并用圖像處理軟件ImageJ對(duì)SDS-PAGE結(jié)果進(jìn)行灰度定量，用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 共表達(dá)重組菌株生長(zhǎng)測(cè)定

將各共表達(dá)菌株和轉(zhuǎn)化pGAPZ B空載的對(duì)照菌株分別接種至YPD液體培養(yǎng)基，200 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)24 h，以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種至BMGY培養(yǎng)基，200 r/min、30℃培養(yǎng)，采用比濁法（OD600）測(cè)定菌體生長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 共表達(dá)Ero1、PDI和BiP酵母菌株的構(gòu)建及其陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選

將線性化的 pGAP-Ero1、pGAP-PDI、pGAP-BiP和空載pGAPZ B電擊轉(zhuǎn)化GS115-IFNβ-HSA感受態(tài)細(xì)胞。分別從YPD（含400 μg/mL Zeocin）平板上挑取轉(zhuǎn)化子若干，以其基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酵母基因組DNA的PCR鑒定Fig.2 Identification of genome of Pichia pastoris

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化空載的菌株基因組DNA經(jīng)擴(kuò)增后獲得約250 bp的片段 （C泳道）；而以轉(zhuǎn)化pGAP-Ero1、pGAP-PDI和pGAP-BiP菌株的基因組DNA為模板時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約2 000 bp處各有明顯條帶，表明 pGAP-Ero1、pGAP-PDI和pGAP-BiP表達(dá)框已成功整合至相應(yīng)轉(zhuǎn)化子基因組。

2.2 Ero1、PDI和BiP表達(dá)的Western blot分析

為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)折疊輔助因子 Ero1、PDI和BiP在胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)，用抗6×His抗體對(duì)Ero1、PDI和BiP共表達(dá)菌株和對(duì)照菌株胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行了Western blot分析，結(jié)果如圖3所示。

對(duì)照菌株胞內(nèi)蛋白質(zhì)的Western blot雜交沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶，而Ero1、PDI和BiP共表達(dá)菌株胞內(nèi)蛋白質(zhì)Western blot均出現(xiàn)特異性雜交條帶，表明蛋白質(zhì)折疊因子Ero1、PDI和BiP分別在共表達(dá)菌株中被過(guò)量表達(dá)。Ero1、PDI和BiP蛋白質(zhì)雜交條帶均比理論分子量略大，Ero1尤其顯著，這可能是由于畢赤酵母的Ero1自身存在糖基化修飾造成的[15]。

圖3 蛋白質(zhì)折疊輔助因子Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of folding helper factors

2.3 Ero1、PDI、BiP共表達(dá)對(duì)重組菌株生長(zhǎng)的影響

為了分析共表達(dá)各種蛋白質(zhì)折疊輔助因子是否對(duì)重組畢赤酵母菌株的生長(zhǎng)有不利影響，對(duì)共表達(dá)Ero1、PDI、BiP的菌株和對(duì)照菌株在BMGY培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pGAPZ B、Ero1、PDI及BiP菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of strains co-overexpressing pGAPZ B Ero1，PDI and BiP

結(jié)果表明，各種共表達(dá)菌株的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照菌株均無(wú)明顯差異。各菌株培養(yǎng)約24 h后到達(dá)平衡期，此時(shí)酵母細(xì)胞密度OD600≈50。這說(shuō)明，共表達(dá)Ero1、PDI、BiP 對(duì) IFNβ-HSA 融合蛋白質(zhì)表達(dá)菌株的正常生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

2.4 Ero1、PDI和 BiP共表達(dá)對(duì)融合蛋白質(zhì)IFNβ-HSA分泌表達(dá)的影響

為了分析共表達(dá)Ero1、PDI、BiP是否對(duì)融合蛋白質(zhì)IFNβ-HSA的分泌表達(dá)有促進(jìn)作用，將共表達(dá)Ero1、PDI、BiP的菌株和對(duì)照菌株分別誘導(dǎo)表達(dá)72 h后，離心取上清液，對(duì)各個(gè)菌株的IFNβ-HSA表達(dá)作SDS-PAGE和Western blot分析，并用ImageJ軟件對(duì)其表達(dá)量作相對(duì)定量，結(jié)果見圖5。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物IFNβ-HSA的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.5 Analysis of the expression of product IFNβ-HSA

由圖5可知，對(duì)照菌株和共表達(dá)菌株均表達(dá)融合蛋白質(zhì)IFNβ-HSA（分子量約90 kD）。利用SPSS對(duì)ImageJ定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示，誘導(dǎo)72 h后，Ero1、PDI和BiP共表達(dá)菌株融合蛋白質(zhì)表達(dá)量分別是對(duì)照菌株的1.8倍、1.9倍和1.1倍，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05），表明共表達(dá)Ero1和PDI對(duì)提高重組畢赤酵母外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量具有顯著作用，而共表達(dá)BiP對(duì)重組畢赤酵母外源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平?jīng)]有影響。

表1 蛋白質(zhì)輔助折疊因子表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)Table 1 Mean improvements of IFNβ-HSA by coexpression of folding helper factors

見上圖5，共表達(dá)PDI時(shí)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物中還存在一分子量約為50 kDa的條帶，用抗 HSA 抗體作 Western blot分析（圖 5（b））可見，雜交結(jié)果顯示此條帶并非表達(dá)產(chǎn)物IFNβ-HSA的相關(guān)條帶，其具體來(lái)源有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在GS115-IFNβ-HSA中分別共表達(dá)Ero1、PDI和BiP，探索了過(guò)量表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中這3種蛋白質(zhì)折疊輔助因子對(duì)外源蛋白質(zhì)IFNβ-HSA分泌表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ero1、PDI和BiP成功地在胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)，且不影響宿主細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。共表達(dá)Ero1和PDI的重組菌株，其IFNβ-HSA融合蛋白質(zhì)表達(dá)量有不同程度的提高，分別是對(duì)照菌株的1.8倍和1.9倍。這表明二硫鍵的形成過(guò)程可能是外源蛋白質(zhì)IFNβ-HSA分泌表達(dá)過(guò)程中的限速步驟之一，通過(guò)在Pichia pastoris GS115細(xì)胞中分別共表達(dá)Ero1和PDI，可能促進(jìn)了融合蛋白質(zhì)IFNβ-HSA折疊過(guò)程中二硫鍵的形成，有助于融合蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊加工，從而提高了外源蛋白質(zhì)IFNβ-HSA的表達(dá)量。共表達(dá)BiP的重組菌株中，IFNβ-HSA融合蛋白質(zhì)的表達(dá)量與對(duì)照組相當(dāng)，可能過(guò)表達(dá)BiP加重重組菌株表達(dá)外源蛋白質(zhì)的負(fù)擔(dān)，使得過(guò)多的BiP已不能發(fā)揮蛋白質(zhì)輔助因子的活性。已有的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，共表達(dá)BiP對(duì)外源蛋白質(zhì)表達(dá)的影響存在較大差異[16]，在某些情況下，共表達(dá)BiP對(duì)一些外源蛋白質(zhì)表達(dá)沒(méi)有顯著影響[17]。因此，組合表達(dá)不同的蛋白質(zhì)折疊輔助因子能否進(jìn)一步提高目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，值得深入研究。

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