張旦旦，余園，張曉梅，李恒，許正宏，2，史勁松

1(江南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥系，江蘇無錫，214122)

2(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

角蛋白是一種廣泛存在于自然界中的硬性蛋白，普通的溶劑和一般的蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)都難以令其溶解，因此利用傳統(tǒng)的物理或化學(xué)方法降解角蛋白存在提取效率低、耗能高、污染大、產(chǎn)物分子質(zhì)量較小等缺陷［1-2］。角蛋白酶(Keratinase)是一類可特異性降解不溶性角蛋白的蛋白酶類，生產(chǎn)菌株多篩選自角蛋白含量豐富的家禽廢棄物、毛發(fā)堆放地、羊圈土壤等，常見產(chǎn)角蛋白酶的細(xì)菌為鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬，如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、密旋鏈霉菌(Streptomyces pactum)等［3-4］。不同來源的角蛋白酶的理化特性各有不同，但除部分高溫嗜堿微生物來源的角蛋白酶外，大部分角蛋白酶為中性至堿性蛋白酶，最適作用溫度在40 ～60℃［5］。

本文經(jīng)過多次分離篩選，從7個不同來源的土壤樣品中篩選到32株微生物，并對其中產(chǎn)酶較高的3株微生物進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，其中1株為金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)，目前尚無該菌株產(chǎn)角蛋白酶的相關(guān)報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 出發(fā)菌株

金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)K13，保藏號為CGMCC No.8047，本實驗室篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基

初篩固體培養(yǎng)基(g/L):羊毛粉 5，K2HPO41，NaCl 0.5，瓊脂粉 20。

察氏/種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 30，NaNO33，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.01。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):羊毛粉10，K2HPO40.4，NaCl 0.5。自然pH值，1×105Pa滅菌20 min。

自制羊毛粉:將羊毛浸泡于0.1 mol/L NaOH溶液中3 d后，用自來水沖洗干凈，1×105Pa滅菌20 min，105℃烘干后，用粉碎機粉碎后經(jīng)研缽研磨制成羊毛粉。

1.2 菌株的分離篩選與培養(yǎng)方法

1.2.1 角蛋白酶產(chǎn)生菌土樣采集地點

土樣1:農(nóng)村多年無耕作的土壤

土樣2:羊圈表層土壤

土樣3:羊群活動頻繁地區(qū)的表層土壤

土樣4:樹林深處濕潤的土壤層

土樣5:竹林深處的土壤層

土樣6:家禽活動頻繁地區(qū)的表層土壤

土樣7:家禽活動頻繁地區(qū)的深層土壤

1.2.2 菌株篩選方法

分別取上述土樣1 g溶于10 mL無菌生理鹽水中，搖勻制成土壤懸液;將土壤懸液稀釋不同倍數(shù)后取200 μL涂布于上述篩選培養(yǎng)基的固體平板，30℃培養(yǎng)72 h;挑取較大的菌落，在初篩平板上反復(fù)劃線分離，直至分離到單菌落進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩培養(yǎng)基為上述的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，220 r/min，30℃恒溫培養(yǎng)72h后測定發(fā)酵上清液中的角蛋白酶活力。

1.2.3 菌株培養(yǎng)方法

種子制備方法:取平板單菌落1環(huán)接種于裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于恒溫振蕩搖床220 r/min，30℃培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵方法:取2%種子液接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于恒溫振蕩搖床220 r/min，30℃培養(yǎng) 72 h。

1.3 角蛋白酶活力的測定

測定體系:取10 mL試管，依次加入2.0 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(緩沖液具體pH值隨實驗而定)，10 mg自制羊毛粉底物，37℃預(yù)熱10 min后加入1.0 mL粗酶液，混勻，37℃恒溫振蕩水浴鍋反應(yīng)1 h(具體預(yù)熱與反應(yīng)溫度隨實驗而定)。加入2.0 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，10 000 r/min離心10 min，取上清液于280 nm測定其吸光度值，采用37℃恒溫振蕩前添加三氯乙酸的反應(yīng)管作對照。酶活計算公式如下:

X=△A280×100×n

式中:△A為反應(yīng)液的吸光度值-對照液的吸光度值;X為樣品的酶活力，U/mL;n為樣品的稀釋倍數(shù)。

酶活力單位定義:1 mL液體酶，在一定的溫度和pH條件下轉(zhuǎn)化羊毛粉底物，1 h使A280增加0.01個單位即為1個酶活力單位，以U/mL表示。

1.4 菌株鑒定方法

1.4.1 菌株形態(tài)學(xué)特征與生理生化特征鑒定［6］

將菌株接種察氏培養(yǎng)基平板中，30℃培養(yǎng)2～3d，觀察其菌落特征、菌體形態(tài)和革蘭氏染色特征，生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》。

1.4.2 菌株16S rDNA鑒定［3］

取對數(shù)生長期的菌液，提取其基因組DNA，以細(xì)菌16S rDNA通用引物(正向引物:5'-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’，反向引物:5'-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’)擴增其16S rDNA。

細(xì)菌DNA的提取參照上海捷瑞生物工程有限公司細(xì)菌基因組提取試劑盒說明;PCR擴增產(chǎn)物的純化參照上海捷瑞生物工程有限公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明;測序由上海生工生物工程有限公司完成。測序后，在GenBank中通過BLAST比對進(jìn)行菌種鑒定。

1.5 粗酶性質(zhì)

1.5.1 粗酶液的制備

將發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.5.2 粗酶的最適作用溫度、pH

維持其他條件不變，分別在不同溫度(30、40、45、50、55、60、70、80℃)、不同 pH 值(pH 3.0 ～10.0，其中pH 3.0～7.0采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 7.0～9.0采用Tris-HCl緩沖液，pH 9.0～10.0采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)條件下，按1.3中方法測酶活力，以酶活最高者為100%繪制曲線，以確定該角蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和pH。

1.5.3 角蛋白酶的SDS-keratin-PAGE電泳［7］

分別做2種蛋白膠，以普通蛋白膠做目標(biāo)蛋白的還原性電泳(A);在普通蛋白分離膠中加入1%的角蛋白溶液，使其最終濃度為0.2%，在該蛋白膠上做目標(biāo)蛋白的非還原性電泳(B)，電泳條件均為:4℃，150 V恒壓約50 min。蛋白膠A直接染色后脫色;B置于1%的TritonX-100中洗滌3次以去除SDS，每次10 min，然后置于pH 8.5的Tris-HCl緩沖液中55℃恒溫反應(yīng)10 h，將膠取出用考馬斯亮藍(lán)(R250)染色30 min后脫色。

1.6 金色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.6.1 菌株生長曲線和產(chǎn)酶曲線的測定

按1.2.3的培養(yǎng)方法進(jìn)行菌株K13的發(fā)酵，每隔8 h取2 mL發(fā)酵液，置于5 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min，沉淀置于鼓風(fēng)干燥箱中80℃以上干燥至恒重;上清液于10 000 r/min離心10 min，取上清液按1.3的方法測角蛋白酶酶活。

1.6.2 培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，保持其他條件不變，分別添加2%的碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、酵母粉)、0.2%無機氮源(NaNO3、NH4Cl、NH4HCO3)、1%有機氮源(牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白、豆餅粉)，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵(分別設(shè)置3組平行實驗，取平均水平)，以發(fā)酵64 h上清液的角蛋白酶活力為考核指標(biāo)探索各因素對金色鏈霉菌K13發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.6.3 培養(yǎng)基的正交實驗優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、NaNO3(C)、羊毛粉(D)4個影響角蛋白酶活力的主要因素，每個因素選取3個水平，進(jìn)行L9(34)正交實驗設(shè)計(表1)，根據(jù)實驗結(jié)果確定最佳培養(yǎng)基成分及水平，進(jìn)行驗證實驗。

表1 正交實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Experimental variables and levels for orthogonal design

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)角蛋白酶微生物菌株的篩選與鑒定

2.1.1 產(chǎn)角蛋白酶微生物的初篩

從7個土壤樣品中分離篩選角蛋白酶產(chǎn)生菌，經(jīng)初步分離純化共分離得到32株菌，菌株來源如表2所示。

表2 產(chǎn)角蛋白酶菌株的土壤初篩結(jié)果Table 2 Screening results of keratinase-producing strains

有羊毛存在的土壤中能利用角蛋白的微生物相對較豐富，其他土壤中也存在能利用羊毛角蛋白生長的微生物，但數(shù)量較少，表明微生物角蛋白酶為底物誘導(dǎo)型蛋白酶。根據(jù)鏡檢及菌落形態(tài)初步判斷32株菌中有13株放線菌，18株細(xì)菌，1株真菌，選擇生長良好的菌株繼續(xù)分離培養(yǎng)，共得到18株菌的純培養(yǎng)物。

2.1.2 產(chǎn)角蛋白酶微生物的復(fù)篩

將初篩得到的18株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測其產(chǎn)酶活力，其中13號菌株(放線菌)產(chǎn)酶活力最高達(dá)3.9 U/mL，4號(放線菌)和22號(細(xì)菌)菌株次之，其他菌株產(chǎn)酶均較低，且穩(wěn)定性不高(表3)，選取13號菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.3 產(chǎn)酶菌株的鑒定

2.1.3.1 13號菌株形態(tài)學(xué)特征與生理生化特征鑒定

該菌株菌落形態(tài)為圓形，質(zhì)地致密，表面干燥而多皺，無光澤，具有發(fā)達(dá)的基內(nèi)菌絲和黃色孢子。革蘭氏染色陽性，鏡檢有分枝的菌絲，孢子成鏈狀生長。根據(jù)菌株生理生化特征(表4)，并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》初步鑒定該菌株為放線菌目鏈霉菌科鏈霉菌屬。

表3 各菌株酶活力測定結(jié)果Table 3 Keratinase activities of strains

表4 菌株K13的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characters of strain K13

2.1.3.2 菌株的16S rDNA鑒定

按1.4.2所述實驗方法獲得13號菌株的16S rDNA，約1 600bp(圖1A)，經(jīng)測序比對，該菌株16S rDNA與金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)16S rDNA的同源性為99%，菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1B所示，結(jié)合菌株生理生化特征，將該菌株鑒定為金色鏈霉菌，命名為K13。文獻(xiàn)報道，金色鏈霉菌通常作為抗生素產(chǎn)生菌被廣泛研究，工業(yè)上作為一種四環(huán)類抗生素——金霉素的主要生產(chǎn)菌株［8］，目前尚無該菌株產(chǎn)角蛋白酶的相關(guān)報道，本文將對其展開研究。

2.2 金色鏈霉菌K13角蛋白酶粗酶性質(zhì)研究

2.2.1 粗酶的最適作用溫度和pH的測定

分別考察該角蛋白酶粗酶的最適溫度和pH，結(jié)果如圖2所示:過高或過低的溫度均對該酶活力有較大的抑制作用，中溫(50～60℃)條件下該酶相對酶活力保持在90%以上，表明該酶為中溫酶，最適作用溫度為55℃;該酶在酸性條件(pH 3.0～6.0)下相對酶活力低于20%，堿性條件(pH 7.5～10.0)下相對酶活力均保持在80%以上，表明該酶為堿性角蛋白酶，最適作用pH為8.5，且在堿性條件下的pH適應(yīng)范圍較寬。

圖1 菌株16S rDNA和系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 16S rDNA and phylogenetic tree of strain K13

圖2 金色鏈霉菌角蛋白酶粗酶性質(zhì)Fig.2 The crude enzymatic characteristics of keratinase produced by Streptomyces aureus K13

2.2.2 角蛋白酶的SDS-keratin-PAGE電泳

將發(fā)酵所得上清液用離心濃縮儀濃縮5～6倍，按1.5.3的方法進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示，對比還原性電泳條帶(A)與非還原性活性電泳條帶(B)，可知該菌株所產(chǎn)角蛋白酶分子質(zhì)量約為46 kDa。

圖3 角蛋白酶的SDS-keratin-PAGE電泳Fig.3 SDS-keratin-PAGE electrophoresis of keratinase

綜合以上結(jié)論，金色鏈霉菌K13所產(chǎn)角蛋白酶為中溫堿性角蛋白酶，分子質(zhì)量約為46 kDa，最適溫度為55℃，最適pH為8.5。比較目前已報道的角蛋白酶特性［5］，菌株K13所產(chǎn)角蛋白酶與菌株Streptomyces gulbagensis DAS 131(分子質(zhì)量46 kDa，最適溫度45℃，最適pH 9.0)［9］的理化性質(zhì)相似，后者在添加了3%淀粉的培養(yǎng)基中液態(tài)發(fā)酵7d，產(chǎn)酶活力達(dá)到最高14.3 U/mL。

2.3 金色鏈霉菌產(chǎn)角蛋白酶發(fā)酵條件初步探索

2.3.1 菌株產(chǎn)酶曲線的測定

考察金色鏈霉菌K13的生長及產(chǎn)酶曲線，如圖4所示:菌株經(jīng)過16 h的生長延滯期后進(jìn)入對數(shù)生長期，并于64 h進(jìn)入平穩(wěn)期;該菌株產(chǎn)酶屬于生長偶聯(lián)型，酶合成伴隨菌株生長而開始，并在菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期時(64 h)達(dá)到最高產(chǎn)酶4.15 U/mL;酶活力在80 h后迅速下降，可能是發(fā)酵后期，培養(yǎng)基營養(yǎng)匱乏，菌株利用自身合成的角蛋白酶以維持生長。

圖4 金色鏈霉菌K13生長及產(chǎn)酶曲線Fig.4 Growth and keratinase-producing curve of Streptomyces aureus K13

2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源優(yōu)化

考察不同碳氮源對菌株產(chǎn)酶的影響，如圖5所示。乳糖和酵母粉的添加一定程度抑制了產(chǎn)酶，而葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉均對產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，其中葡萄糖的促進(jìn)效果最為明顯，酶活力提高了110%;有機氮源蛋白胨和無機氮源NaNO3對產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，酶活力分別提高了63%和71%，其余氮源對產(chǎn)酶均有不同程度的抑制。以上結(jié)果表明，以羊毛角蛋白為底物發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶時添加合適的碳源或氮源對產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用。

圖5 不同碳氮源對金色鏈霉菌K13發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.5 Effects of different carbon and nitrogen sources on keratinase production by Streptomyces aureus K13

2.3.3 培養(yǎng)基組份的正交實驗優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇葡萄糖、蛋白胨、硝酸鈉和羊毛粉4個對產(chǎn)酶影響較為顯著的因素，以角蛋白酶酶活(U/mL)作為響應(yīng)值，進(jìn)行正交試驗優(yōu)化，結(jié)果如表5所示。

表5根據(jù)極差(R)分析，4個因素的主次順序為羊毛粉(D)＞葡萄糖(A)＞蛋白胨(B)＞NaNO3(C)，羊毛粉對酶活力的影響最大;由均值分析所得，最優(yōu)組合方案為A3B3C3D1，即葡萄糖4%，蛋白胨3%，NaNO30.3%，羊毛粉0.5%，在最佳條件下進(jìn)行3批次發(fā)酵實驗，平均酶活力為(44.2±1.7)U/mL，較優(yōu)化前(3.9 U/mL)提高了10.3倍。

表5 正交實驗表Table 5 Results and analysis of orthogonal design

試驗號因素A(葡萄糖)/(g·L-1)B(蛋白胨)/(g·L-1)C(NaNO3)/(g·L-1)D(羊毛粉)/(g·L-1)響應(yīng)值酶活/(U·mL-1)7 40 10 3 10 33.6±1.30 8 40 20 1 20 16.7±0.86 9 40 30 2 5 39.4±0.97 k1 22.2 26.1 27.6 34.7 k2 27.0 22.7 23.5 28.8 k3 29.9 30.3 28.1 15.6 R 7.8 7.5 4.6 19.2因素主次關(guān)系 D＞A＞B＞C最優(yōu)組合水平 A3B3C3D1

3 討論

本文以羊毛角蛋白為底物，從7個土壤樣品中篩選獲得1株角蛋白酶活性較高的菌株，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定為金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)，命名為K13，對該菌株粗酶性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn):菌株K13所產(chǎn)角蛋白酶為中溫堿性角蛋白酶，分子質(zhì)量約為46 kDa，最適溫度為55℃，最適pH為8.5，且在堿性條件下的pH適應(yīng)范圍較寬。從分子質(zhì)量大小分析，菌株K13所產(chǎn)角蛋白酶與菌株Streptomyces sp.S7(44 kDa)，Streptomyces gulbagensis DAS 131(46 kDa)極其相近，上述菌株均為鏈霉菌屬，對羽毛有一定的降解能力，且EDTA對酶活性有一定的抑制作用［9-12］;從最適pH與溫度分析，相同或不同菌株來源的角蛋白酶均表現(xiàn)出不同性質(zhì)，本文所述角蛋白酶的最適pH/溫度與菌株Bacillus subtilis KD-N2(pH8.5，T55)相同，與Bacillus cereus DCUW(pH8.5，T50)，Bacillus licheniformis K-508(pH8.5，T52)，Chryseobacteriumsp.kr6(pH8.5，T50)，Streptomyces thermoviolaceus(pH 8，T55)等菌株相似［5］。

筆者通過傳統(tǒng)的菌種選育手段篩選到1株產(chǎn)角蛋白酶的金色鏈霉菌K13，經(jīng)4因素3水平的正交實驗優(yōu)化，其產(chǎn)酶活性達(dá)到44.2 U/mL，該產(chǎn)酶水平較已報道的基因工程菌株［13-14］相去甚遠(yuǎn)，但在野生菌株［13-14］中仍有一定的優(yōu)勢，且目前尚無該菌株產(chǎn)角蛋白酶的相關(guān)報道。對該菌株產(chǎn)酶特性與代謝途徑、酶蛋白分子結(jié)構(gòu)及編碼基因等的進(jìn)一步研究，將有望獲得新的角蛋白酶，并對探討和完善金色鏈霉菌代謝產(chǎn)物及基因組結(jié)構(gòu)意義重大。

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