王淑芳，楊潤強，宋玉，顧振新

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京，210095)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種4碳非蛋白質(zhì)氨基酸，具有降血壓、調(diào)節(jié)心率、緩解壓力等生理功能［1］。當(dāng)植物在熱擊、冷擊、鹽、機械刺激和低氧等脅迫條件下，谷氨酸脫羧酶(GAD)和二胺氧化酶(DAO)被強烈激活，從而導(dǎo)致GABA積累［2］。研究表明，植物來源的GAD是1種鈣調(diào)素(CaM)結(jié)合蛋白，其活性受Ca2+/CaM調(diào)控［3］。植物受到鹽脅迫時，細胞液中Ca2+濃度升高［4］，促使CaM轉(zhuǎn)錄水平提高，激活一系列生理反應(yīng)。磷酸吡哆醛(PLP)作為GAD的輔基對其活性的發(fā)揮起重要作用［5］。從米胚中分離純化得到的GAD脫除輔基后，活性完全喪失，但在含有PLP的體系中，活性可以恢復(fù)到90%以上［6］。通常認為，鹽脅迫促進GABA的積累源于GAD活性的激活［7］。但近年來的研究表明，鹽脅迫條件下，植物體內(nèi)游離態(tài)多胺(PAs)含量升高，多胺氧化酶(PAO)、DAO活性也隨之升高。

逆境條件下，植物籽粒的萌發(fā)和生長受到抑制、呼吸改變、蛋白酶、淀粉酶活性提高，同時合成GABA抵御脅迫。Yin等［8］報道，NaCl脅迫下發(fā)芽大豆中GABA大量富集;VB6作為PLP的結(jié)構(gòu)類似物可激活發(fā)芽糙米中 GAD活力，從而富集 GABA［9］;Ca不僅與CaM形成Ca2+/CaM參與GAD活力的激活，而且可提高DAO活力［10］。因此，在大豆籽粒低氧脅迫下發(fā)芽時，采用同時含有NaCl、VB6和CaCl2的培養(yǎng)液，將對GABA的富集具有顯著作用。本研究優(yōu)化了培養(yǎng)液組成，在優(yōu)化的組分下，研究大豆發(fā)芽過程中主要生理生化指標(biāo)和GABA含量的動態(tài)變化，以及GABA合成關(guān)鍵酶的變化情況，旨在探明大豆芽菜GABA富集的同時，明確其他主要營養(yǎng)成分變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大豆(云鶴YH-NJ)，2013年產(chǎn)自中國吉林省，購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，置 -20℃冰箱貯存，備用。GABA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)美國Sigma公司;乙腈，上海陸都化學(xué)試劑廠;β-巰基乙醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;EDTA，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;磷酸吡哆醛，Sigma公司;丙三醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;聚乙烯吡咯烷酮，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;過氧化物酶，上海國源生物技術(shù)有限公司;腐胺，美國Sigma公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

Orion818型 pH測試儀，美國 Orion Research，Inc.;755B型分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;液相色譜儀 Agilent 1200，安捷倫公司;TDL-40B離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;PYX-DHS-BS型隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.4 大豆芽菜培養(yǎng)

取30 g大豆籽粒，用1%的NaClO水溶液浸泡消毒15 min，去離子水沖洗至pH中性，于30℃黑暗條件下浸泡6 h后置于24℃、相對濕度85%的發(fā)芽機中，以水為培養(yǎng)液發(fā)芽4 d，得大豆芽菜。

1.5 實驗設(shè)計

將芽菜置于帶蓋的培養(yǎng)瓶(φ 5 cm×18.5 cm)中，加入10 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)，通入空氣(0.9 L/min)，培養(yǎng)2 d。選取 NaCl(A)、VB6(B)和CaCl2(C)作為研究對象，采用3因素3水平實驗設(shè)計，評價各因素之間的交互作用，實驗因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表Table 1 Coded values of variables used in Box-Behnken design

1.6 生長動力學(xué)曲線

大豆經(jīng)預(yù)處理后，置于優(yōu)化后的培養(yǎng)液中脅迫培養(yǎng)2 d。每隔12 h取樣，樣品用蒸餾水清洗并用吸水紙吸干表面水分，液氮速凍后待測。以預(yù)處理方式培養(yǎng)為對照。

1.7 測定指標(biāo)與方法

芽長:采用游標(biāo)卡尺測量，每30株大豆芽菜作為一個樣本。

呼吸速率:采用小籃子法測定［11］。

可溶性蛋白含量:采用考馬斯亮藍法測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)［11］。

游離氨基酸:采用茚三酮溶液顯色法測定，以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)［11］。

GABA含量:參照 Bai等［12］的方法測定。

GAD活性:參照張磊［13］的方法測定。

DAO活性:參照Yang等［14］的方法測定。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。應(yīng)用SPSS 16.0作差異顯著性分析。Box-Behnken試驗結(jié)果采用設(shè)計專家8.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)液組分優(yōu)化

對濃度 NaCl(mmol/L)(A)、VB6(μmol/L)(B)和CaCl2(mmol/L)(C)進行了3因素3水平響應(yīng)面分析試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

采用Design Expert軟件對表中數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到GABA含量對編碼自變量A、B和C的二次多項回歸方程:

Y=0.941 09+0.003 890 83A+0.0405 64B+0.148 08C+0.000 267 5AB+0.001 197 92AC+0.000 487 5 BC-0.000 330 444A2-0.000 439 056B2-0.018 478C2

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計和結(jié)果Table 2 Design and response of the Box-Behnken

對上述回歸模型進行方差分析(表3)。結(jié)果表明，模型是顯著的(P＜0.001)，回歸模型的決定系數(shù)為0.958，說明該模型能夠解釋95.8%的變異。因此，可用此模型對GABA含量進行分析和預(yù)測。對回歸模型進行方差分析，F(xiàn)值為17.82，回歸模型極其顯著(P＜0.005)。模型的失擬性檢驗不顯著(P＞0.05)，說明二次模型相關(guān)性良好。模型的信噪比(adeq precision)為11.668，其值遠大于4。所有的統(tǒng)計分析特征值表明，模型具有實踐指導(dǎo)意義。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of Variance with regression model

根據(jù)回歸分析所得二次方程，在試驗設(shè)定范圍內(nèi)，分析任意兩變量之間的交互作用，同時固定其他變量的取值，可得等高線圖。圖1-A表示CaCl2濃度為6.0 mmol/L時，NaCl和 VB6濃度對大豆芽菜GABA含量的影響。NaCl的一次項(P＜0.005)和二次項(P＜0.005)極其顯著影響GABA含量，NaCl和VB6的交互作用顯著。NaCl濃度一定時，GABA含量隨VB6濃度增加先升高后降低。VB6濃度較低(40～70 mmol/L)時，圖1-A中等高線分布較密，表明此時NaCl濃度對GABA含量的影響較大。當(dāng)NaCl濃度42.49 mmol/L，VB6濃度 62.60 μmol/L 時，GABA含量達到最高值。

圖1 NaCl、VB6及 CaCl2的交互作用對GABA含量的影響Fig.1 Contour plots showing the effect of interaction between NaCl，VB6and CaCl2on GABA content

圖1-B表示，VB6濃度在70 μmol/L條件下，NaCl和CaCl2濃度對GABA含量的影響。CaCl2的一次項(P＜0.05)和二次項(P＜0.05)顯著的影響大豆芽菜中GABA的含量，但NaCl和CaCl2濃度的交互作用不顯著(P=0.064 0)。在一定的NaCl濃度下，GABA含量隨著CaCl2濃度的增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，濃度為6.21 mmol/L時達到最高值。同樣，在一定CaCl2濃度下，GABA含量隨著NaCl濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，濃度為42.49 mmol/L達最大值。

CaCl2和VB6對大豆芽菜GABA含量的交互作用不顯著(圖1-C)。與VB6相比，CaCl2濃度對GABA含量的影響較大。當(dāng)CaCl2濃度一定時，GABA含量隨VB6濃度增加呈逐漸升高的趨勢。CaCl2濃度為6.21 mmol/L、VB6濃度為 62.20 μmol/L 時，GABA 含量達到峰值。由此可見，培養(yǎng)液添加適當(dāng)濃度的CaCl2和VB6可提高大豆芽菜中GABA含量。

2.2 培養(yǎng)液組分驗證試驗

對大豆芽菜GABA含量的二次多項數(shù)學(xué)模型解逆矩陣后得出，在低氧聯(lián)合鹽脅迫培養(yǎng)條件下，當(dāng)培養(yǎng)液組分中NaCl濃度42.49 mmol/L、VB6濃度62.60 μmol/L、CaCl2濃度6.21 mmol/L時，大豆芽菜中GABA富集量的預(yù)測值為2.75 mg/g DW，實測值為2.77 mg/g DW，高于隨機選擇組。相關(guān)性分析表明，實測值與預(yù)測值接近，表明實驗所擬合的模型可用來預(yù)測培養(yǎng)液組分和試驗響應(yīng)值之間的關(guān)系(表4)。

表4 驗證試驗設(shè)計和結(jié)果Table 4 Arrangement and result of validation trials

2.3 大豆發(fā)芽生長動力學(xué)曲線

如圖2-A所示，大豆芽長隨發(fā)芽時間延長而逐漸增長，脅迫條件下，大豆芽長增長緩慢，發(fā)芽132 h時，芽長僅為對照組的70%左右。這表明脅迫條件下大豆芽的生長受到了抑制。發(fā)芽96 h內(nèi)，大豆呼吸速率隨發(fā)芽時間延長而增大，發(fā)芽96 h后，脅迫條件下大豆芽菜呼吸速率低于對照。可見，低氧脅迫，不利于大豆芽菜的呼吸作用(圖2-B)。由圖2-C可見，大豆發(fā)芽過程中可溶性蛋白含量逐漸降低，非脅迫組發(fā)芽144 h時可溶性蛋白含量比發(fā)芽0 h減少57.08 mg/g。而脅迫條件下大豆芽菜中可溶性蛋白含量迅速降低，發(fā)芽144 h時，可溶性蛋白含量比發(fā)芽0 h減少167.08 mg/g，僅為對照組的45.45%。這表明脅迫處理條件下大豆芽菜中更多的可溶性蛋白被分解利用。大豆芽菜游離氨基酸含量呈上升趨勢。脅迫培養(yǎng)144 h時，游離氨基酸含量比對照高94%，是發(fā)芽0 h的12.57倍?？梢?，低氧脅迫處理可促使大豆芽菜生成更多的游離氨基酸(圖2-D)。

圖2 大豆發(fā)芽期間主要生理生化變化Fig.2 The main physiological and biochemical changes of soybean during germination

隨發(fā)芽時間延長，大豆芽菜GAD活性逐漸增大。發(fā)芽0～96 h，大豆芽菜GAD活性緩慢增長，96～144 h大豆芽菜GAD活性增加迅速，發(fā)芽144 h時，活性達到最大值。低氧脅迫條件下GAD活性達到最大值時比非脅迫處理高14.66 U/g DW，這說明低氧脅迫對大豆芽菜中GAD活性有激活作用(圖2-E)。脅迫條件下，大豆DAO活性隨培養(yǎng)時間延長呈先升高后降低的趨勢(圖2-F)。培養(yǎng)72 h時，大豆DAO活性達到最大值。發(fā)芽96～144 h，脅迫組DAO活性高于對照組，脅迫處理120 h時，DAO活性是對照組的1.7倍。由此表明，逆境脅迫提高了大豆DAO活性。由圖2-G可知，大豆發(fā)芽0 ～144 h，GABA含量逐漸升高。發(fā)芽96 h時，脅迫處理大豆GABA含量急劇增加，脅迫處理144 h時，GABA含量為2.73 mg/g，顯著高于非脅迫處理?？梢?，脅迫培養(yǎng)有利于大豆芽菜中GABA積累。

由表5可見，低氧脅迫下，大豆芽長與游離氨基酸、GAD活性、GABA含量呈正相關(guān)，與呼吸強度、可溶性蛋白、DAO活性呈負相關(guān)。由此可見，大豆脅迫培養(yǎng)96～144 h過程中，大豆芽長逐漸增長，但呼吸強度減弱，DAO活力下降?？扇苄缘鞍着c游離氨基酸相關(guān)性在0.01水平上顯著，這說明可溶性蛋白與游離氨基酸兩者之間關(guān)系密切，在生命代謝過程中大分子蛋白被蛋白酶水解為小分子的游離氨基酸，供給代謝活動需要。GABA含量與可溶性蛋白、游離氨基酸相關(guān)性顯著，可見含氮物質(zhì)在大豆芽菜體內(nèi)的代謝是隨著可溶性蛋白的分解，游離氨基酸積累，GABA也逐漸積累的過程。

表5 低氧脅迫下大豆發(fā)芽期間生理生化指標(biāo)和GABA含量的相關(guān)性Table 5 Correlations between physiological，biochemical parameters and GABA content in soybeans during germination under hypoxia

3 討論

PLP是GAD的輔酶，VB6與PLP結(jié)構(gòu)相似，起到與PLP相同的功能。張磊［13］研究米糠中GABA富集時，添加0.40 mmol/L VB6后GABA含量達到最大值，添加量大于或小于0.40 mmol/L，GABA富集量均顯著下降。發(fā)芽蠶豆在VB6添加濃度為60 μmol/L時，GABA含量最大［15］。本實驗采用響應(yīng)面實驗法得到VB6濃度62.60 μmol/L時，GABA富集量最大。

通常認為，鹽脅迫促進GABA的積累源于GAD活性的激活［7］。但近年來的研究表明，鹽脅迫條件下，植物體內(nèi)游離態(tài)多胺含量升高，PAO、DAO活性也隨之升高。李巖［9］研究表明，低氧脅迫下鹽提高發(fā)芽蠶豆GAD和DAO活性，促進GABA富集，其中PAs降解對GABA富集的貢獻率在37.6%～45.0%。植物細胞內(nèi)Ca2+對GAD活性的調(diào)節(jié)主要是通過鈣調(diào)素來完成的，但GAD提取后其活性是否受Ca2+影響，取決于分離得到的GAD是否結(jié)合有CaM。植物受到環(huán)境脅迫時均會引起胞質(zhì)Ca2+濃度的增加［16］，增加的Ca2+刺激了GAD活性，促進了GABA的積累。本研究發(fā)現(xiàn)，外源添加NaCl和Ca2+對大豆芽菜富集GABA有積極作用，但是，Ca2+調(diào)控大豆體內(nèi)代謝機理有待從分子水平加以深入研究。

Koca等［17］報道，鹽脅迫時發(fā)芽芝麻的芽長和根長受到不同程度的抑制。也有報道表明，GABA的合成能夠調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育［18］。在莖伸長研究中，機械刺激引起的生長抑制現(xiàn)象可被Ca2+鰲合劑和CaM拮抗劑所阻斷。機械刺激能夠短時增加胞內(nèi)Ca2+和 GABA 水平［19］，同時莖的伸長受到抑制［20］。GABA處理可刺激向日葵幼苗產(chǎn)生乙烯，促進ACC合成酶的轉(zhuǎn)錄［21］。用外源性GABA處理大豆可顯著提高葉片中腐胺、亞精胺和精胺的含量［22］。以上結(jié)果表明，GABA對植物生長的調(diào)節(jié)作用是通過調(diào)控乙烯和多胺的合成及含量實現(xiàn)的［23］。推測環(huán)境脅迫可以升高胞內(nèi) Ca2+和 H+水平，激活 GAD、DAO，引起GABA積累，然后GABA與其受體結(jié)合從而調(diào)控植物的生長發(fā)育。本研究得出大豆在脅迫發(fā)芽過程中，芽長生長受到抑制，呼吸速率降低，這與前人研究結(jié)果相近。

植物體內(nèi)蛋白質(zhì)等含氮化合物的變化反映了環(huán)境脅迫下植物代謝過程中蛋白質(zhì)損傷程度。植物體內(nèi)催化生化反應(yīng)的酶是可溶性蛋白，逆境條件下往往導(dǎo)致酶活性提高，蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)發(fā)生降解，可溶性蛋白含量下降［24］，游離氨基酸含量的增加，為合成GABA提供充足的底物。同時，與脯氨酸、甜菜堿、蔗糖、多胺等相似，GABA可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)起到抵御逆境脅迫作用［21］。從而，大豆芽菜在低氧聯(lián)合NaCl脅迫下GABA大量富集。除了物質(zhì)基礎(chǔ)，GABA形成關(guān)鍵酶活性在脅迫條件下同樣顯著提高，本研究結(jié)果顯示，低氧脅迫條件下 GAD和DAO活性顯著高于對照，因此低氧脅迫下關(guān)鍵酶活性的提高也是GABA富集的關(guān)鍵因素。

4 結(jié)論

低氧脅迫下，NaCl、VB6和CaCl2顯著促進大豆芽菜GABA積累;并且NaCl和VB6對GABA富集具有顯著的交互作用。

［1］ Mody I，De Koninck Y，Otis T，et al.Bridging the cleft at GABA synapses in the brain［J］.Trends in Neurosciences，1994，17(12):517-525.

［2］ XING S G，JUN Y B，HAU Z W，et al.Higher accumulation of γ-aminobutyric acid induced by salt stress through stimulating the activity of diamine oxidases in Glycine max(L.)Merr.roots［J］.Plant Physiology and Biochemis-try，2007，45(8):560-566.

［3］ Baum G，Chen Y，Arazi T，et al.A plant glutamate decarboxylase containing a calmodulin binding domain.Cloning，sequence，and functional analysis［J］.Journal of Biological Chemistry，1993，268(26):19 610-19 617.

［4］ Reddy V S，Reddy A S.Proteomics of calcium-signaling components in plants ［J］.Phytochemistry，2004，65(12):1 745-1 776.

［5］ Salzmann D，Christen P，Mehta P K，et al.Rates of evolution of pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，270(2):576-580.

［6］ 張暉.米胚谷氨酸脫羧酶性質(zhì)及其富集 γ-氨基丁酸研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2004.

［7］ Olsson P，Yilmaz J L，Sommarin M，et al.Expression of bovine calmodulin in tobacco plants confers faster germination on saline media［J］.Plant Science，2004，166(6):1 595-1 604.

［8］ YIN Y，YANG R，GU Z.NaCl stress and supplemental CaCl2regulating GABA metabolism pathways in germinating soybean ［J］.European Food Research and Technology，2014，238(5):781-788.

［9］ 李巖.發(fā)芽蠶豆γ-氨基丁酸富集途徑及高效富集技術(shù)研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［10］ YANG R，CHEN H.，GU Z.Factors influencing diamine oxidase activity and γ-aminobutyric acid content of fava bean(Vicia faba L.)during germination ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(21):116 16-116 20.

［11］ 李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［12］ BAI Q，F(xiàn)AN G.，GU Z，et al.Effects of culture conditions on γ-aminobutyric acid accumulation during germination of foxtail millet(Setaria italica L.)［J］.European Food Research and Technology，2008，228(2):169-175.

［13］ 張磊.米糠中 γ-氨基丁酸富集技術(shù)及保健飲料制作研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［14］ YANG R，YIN Y，GUO L，et al.Sequence analysis of diamine oxidase gene from fava bean and its expression related to γ-aminobutyric acid accumulation in seeds germinating under hypoxia-NaCl stress［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2014，DOI:10.1002/jsfa.6461.

［15］ 陳惠，楊潤強，韓永斌，等.發(fā)芽蠶豆富集 γ-氨基丁酸的培養(yǎng)液組分優(yōu)化［J］.中國糧油學(xué)報，2012，26(11):27-31.

［16］ Pandey S，Tiwari S，Upadhyaya K，et al.Calcium signaling:linking environmental signals to cellular functions［J］.Critical Reviews in Plant Sciences，2000，19(4):291-318.

［17］ Koca H，Bor M，zdemir F，et al.The effect of salt stress on lipid peroxidation，antioxidative enzymes and proline content of sesame cultivars［J］.Environmental and Experimental Botany，2007，60(3):344-351.

［18］ Bown A W，Shelp B J.The metabolism and functions of g-aminobutyric acid ［J］.Plant Physiology，1997，115(1):1-5.

［19］ Gallego P P，Whotton L，Picton S，et al.A role for glutamate decarboxylase during tomato ripening:the characterisation of a cDNA encoding a putative glutamate decarboxylase with a calmodulin-binding site ［J］.Plant Molecular Biology，1995，27(6):1 143-1 151.

［20］ Carroll A D，F(xiàn)ox G G，Laurie S，et al.Ammonium assimilation and the role of［gamma］-aminobutyric acid in pH homeostasis in carrot cell suspensions［J］.Plant Physiology，1994，106(2):513-520.

［21］ Kinnersley A M，Turano F J.Gamma aminobutyric acid(GABA)and plant responses to stress［J］.Critical Reviews in Plant Sciences，2000，19(6):479-509.

［22］ Turano F J，Kramer G F，WANG C Y.The effect of methionine，ethylene and polyamine catabolic intermediates on polyamine accumulation in detached soybean leaves［J］.Physiologia Plantarum，1997，101(3):510-518.

［23］ Bouche N，F(xiàn)romm H.GABA in plants:just a metabolite［J］.Trends in Plant Science，2004，9(3):110-115.

［24］ ZHOU W，SUN Q J，ZHANG C F，et al.Effect of salt stress on ammonium assimilation enzymes of the roots of rice(Oryza sativa)cultivars differing in salinity resistance［J］.Acta Botanica Sinica-English Edtion，2004，46(8):921-927.