，，，，(.中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東 廣州50006；.贛南醫(yī)學院病原生物學教研室)

草麻黃抗補體組份對血小板變形及內皮細胞損傷作用

陳健文1，張文平2，周長華1，黃守堅1，陳少銳1
(1.中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東 廣州510006；2.贛南醫(yī)學院病原生物學教研室)

目的從草麻黃中分離抗補體組份并觀察其抗補體依賴性的損傷作用。方法采用柱層析結合紫外吸收觀察的方法分離抗補體組份；采用比濁法觀察組份對眼鏡蛇毒因子引起的血小板變形的影響；采用MTT法觀察組份對異種血清對內皮細胞損傷的影響。結果紫外吸收為196 nm的組份具有抗補體作用，麻黃組份能有效抑制眼鏡蛇毒因子引起的血小板變形，高、中、低劑量對血小板變形的抑制率分別為49.8%±10.7%、32.8%±4.2%、22.5%±6.2%；麻黃組份能有效減輕異種血清對內皮細胞的損傷，高、中、低劑量對補體致內皮細胞損傷抑制率分別為88.1%±7.1%、79.8%±3.3%、65.0%±4.5%。結論麻黃抗補體組份對補體依賴性損傷有保護作用。

草麻黃； 補體； 攻膜復合物； 補體依賴性損傷

補體系統(tǒng)(complement system)是由30多種蛋白組成的復雜系統(tǒng)，它由補體固有蛋白、補體調節(jié)蛋白、補體受體組成，補體系統(tǒng)有多種生物學功能[1]。通常補體系統(tǒng)受到補體調節(jié)蛋白的精確調控不會引起同源組織損傷，如果補體系統(tǒng)在病理條件下過度激活，就會引起依賴補體的組織損傷，引起包括自身免疫性疾病、成人呼吸窘迫綜合癥、非典型性肺炎、移植中的超急性排斥反應等[2-3]。補體激活產生的攻膜復合物C5b6789n(Member Attack Complex,MAC)能引起血小板活化和血管內皮的損傷[4-5]，該作用構成了補體依賴性損傷的血管內凝血機制。抑制補體的激活可以有效地防止一些免疫性損傷。草麻黃(ephedra sinica)為中國的傳統(tǒng)中藥，具有廣泛的藥理作用。多個治療免疫性疾病的方劑中含有麻黃成分[6-7]，研究發(fā)現(xiàn)麻黃的水提物能抑制補體的激活[8]，麻黃的抗補體成分可能參與了免疫性疾病的治療。本研究從麻黃中分離出抗補體組份，研究其抗補體活性，并針對依賴補體損傷的基本病理過程(血管內凝血機制)，觀察麻黃組份的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

眼鏡蛇毒因子(Cobra Venom Factor,CVF):實驗室制備，采自華南眼鏡蛇(Naja naja atra)；大鼠、豚鼠、新西蘭白兔由中山大學實驗動物中心提供；新生小牛來源于廣州奶牛研究所；草麻黃由廣州奇星藥廠生藥部提供；綿羊血由廣州儒林畜牧場提供；Sephadex G-100購于Pharmacia；500型Chrono-Log血小板聚集儀購于Chrono-Log.USA；810型Aggro/Link電腦接口購于Chrono-Log.USA。

1.2 麻黃組份的粗制品的分離

參照文獻[8]的方法加以改進：100 g麻黃用1 200 mL蒸餾水浸泡24 h，煮沸1 h，趁熱用四層紗布過濾得棕黃色液體。待液體降至室溫后，用1 mol/L的氫氧化鈉調液體的pH為9.0出現(xiàn)大量沉淀，攪拌1 h后2 000 g離心30 min，取沉淀用無水乙醇洗滌，2 000 g離心30 min取沉淀。沉淀用50 mL蒸餾水重懸后，用1 mol/L的鹽酸調液體的pH為4.0，攪拌12 h后用冷凝回流燒瓶煮沸1 h(保持液體體積不變)，冷卻至室溫后，1 000 g離心15 min，取上清液。重復堿沉淀，酸溶解的步驟2次，取上清液,即得粗制品溶液。

1.3 粗制品溶液的層析分離

取Sephdex G-100裝柱，柱高55 cm，內徑1.8 cm，凝膠體積140 mL。取5 mL粗制品上柱進行層析，洗脫液為pH 4.0的水，操作壓15 cm水柱，每15 min收集1管，每管4.5 mL。以196 nm為監(jiān)測波長測定吸光度,并定性測定各管的抗補體活性,收集有抗補體活性的各管,低溫真空干燥保存。

1.4 抗補體活性測定方法

參照文獻[9]，設置倍比稀釋的麻黃組分管及對照管,全溶管，測定各管在541 nm波長的吸光度。根據溶血率Y=樣本管541/全溶管541,以Lg[Y/(1-Y)]為軸,以麻黃組份劑量的常用對數為X軸,推算回歸方程。當Y/(1-Y)=1時即50%溶血時，所對應的劑量即為抑制50%溶血的劑量。

1.5 比濁法測血小板變形聚集

比濁法測血小板變形聚集，按文獻方法制備血小板血漿并計數[10-11]，調整血漿血小板數為(6～7)×1011/L。加樣器取250 μL貧血小板血漿(PPP)和PRP富血小板血漿置于已硅化的玻璃管,PPP 為空白對照，PRP置于Chrono-Log血小板聚集儀測定孔并放入硅化攪拌磁棒攪拌(1 000轉/分)，37°預熱3 min。起動程序，設定基線并描記30 sPRP基線后加入CVF 5 μL描記15 min血小板變形，聚集曲線。實驗組同上描記30 s基線后加入體積為25 μL的倍比稀釋的麻黃組份(低劑量組：0.24 g/L、中劑量組：0.36 g/L、高劑量組：0.54 g/L)攪拌3 min后加入CVF 5 μL,描記曲線觀察麻黃組份對血小板變形聚集的影響。以25 μL的生理鹽水代替麻黃組份作為空白對照重復步驟。

1.6 MTT法觀察麻黃組份對兔血清對牛內皮細胞的損傷

按文獻方法取材和原代培養(yǎng)內皮細胞[12]。培養(yǎng)的細胞經第八因子(Ⅷ因子)相關抗原抗體酶聯(lián)免疫法(ABC法染色),鑒定為內皮細胞。繼續(xù)培養(yǎng)并傳代，實驗用2～5代細胞。將細胞懸液配制成1×108/L,接種于24孔板，每孔0.8 mL,待細胞基本融合進行處理。分對照組、模型組及高、中、低劑量的麻黃組份組(5、2.5、1.25 g/L，每4個孔為一個處理組)。對照組:56 ℃加熱30 min熱滅活的新鮮兔血清用VBS緩沖液1∶4稀釋+PBS緩沖液；模型組:用VBS緩沖液1∶4稀釋新鮮兔血清+PBS緩沖液；高、中、低劑量的麻黃組份組:用VBS緩沖液1∶4稀釋新鮮兔血清+倍比稀釋的麻黃多糖(溶于PBS緩沖液)。在各組中緩沖液或麻黃組份溶液預先與血清混合，在37°溫箱孵育10 min后加入24孔板中搖勻,置于培養(yǎng)箱中4 h,中途再搖勻一次。處理4 h后,采用MTT法測定細胞生存率。在酶標儀上測定光密度值(OD值),測定波長為570 nm,參考波長為630 nm。以細胞生存率=處理組OD/對照組OD ×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS10.0軟件,各組數值以均數±標準差表示，單因素方差分析后LSD檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 草麻黃抗補體組份的提取與分離

生藥麻黃經水煮后，對水溶液進行乙醇的洗滌，二次的煮沸，以及三次的堿溶液的沉淀、酸溶液的溶解過程得粗制品溶液。將粗制品經Sephedex G-100分子篩層析柱分離，取在196 nm波長的紫外光有高吸收峰的組分,并用致敏綿羊紅細胞進行抗補體活性測定。麻黃100 g獲得有196 nm波長吸收特征的抗補體組份30.2 mg，回收率為0.3%。

2.2 抗補體活性測定結果

富含補體的豚鼠血清能使敏化的綿羊紅細胞溶解。預先將豚鼠血清與麻黃多糖孵育，能抑制其溶血作用。以系列劑量確定組份的抗補體活性單位，根據相對溶血率和抗補體組份劑量，計算出組份對豚鼠血清的的IC50為44.8 mg/L。

2.3 麻黃抗補體組份對眼鏡蛇毒因子致大鼠血小板變形抑制率

眼鏡蛇毒因子引起大鼠血小板顯著變形，預先加入麻黃組份能有效抑制3 min后加入CVF引起的血小板變形。變形抑制率隨著麻黃組份劑量的增加而增加，呈現(xiàn)量效關系，見表1。

表1麻黃組份對CVF引起的血小板變形抑制率(n=5)

組別變形抑制率(%)生理鹽水對照組9．3±3．2麻黃組份低劑量組(0．24g/L)22．5±6．2麻黃組份中劑量組(0．36g/L)32．8±4．2a麻黃組份高劑量組(0．54g/L)49．8±10．7b

與對照組比較，a:P<0.05，b:P<0.01

2.4 麻黃抗補體組份對兔血清對牛內皮細胞損傷的影響

培養(yǎng)的細胞經Ⅷ因子相關抗原抗體酶聯(lián)免疫法ABC法染色,鑒定是內皮細胞。 新鮮兔血清能損傷內皮細胞，細胞生存率降低。麻黃組份預先與兔血清37 ℃孵育10 min后,能減輕兔血清對培養(yǎng)的牛內皮細胞的損傷，呈現(xiàn)出劑量關系，見圖1。

圖1 麻黃抗補體組份對兔血清對牛內皮細胞損傷的影響1：對照組；2：模型組；3：低劑量組；4：中劑量組；5：高劑量組. 與模型組比較，*:P<0.05

3 討 論

本文根據該組分在酸性液中溶解、在堿性液中析出的特點,對煮沸后的麻黃水溶液進行多步處理。在實驗過程中,曾對丟棄的沉淀物及上清液進行測定,發(fā)現(xiàn)它們不同程度地具有抑制補體對致敏綿羊紅細胞的溶解作用,即有抗補體活性。推測麻黃煮沸水解后產生多種產物，具有不同的化學性質，相當多的物質由于具有某些活性基團而表現(xiàn)出抗補體活性，本文作者采用的方法分離的只是其中的一部分。應用分子篩以及活性測定法來對活性組分進行分離，發(fā)現(xiàn)在196、202 nm有吸收峰組分表現(xiàn)出較高效價的抗補體活性,其中峰值為196 nm的含量最高。文獻采用的薄板層析分離的方法[8]，需反復制備薄板，一次上樣量小的缺點，采用分子篩柱層析配合196 nm紫外吸收測定的方法對抗補體成分進行分離，簡便實用，上樣量大，重復性好，得率較高，能滿足實驗室的需要。

本實驗組利用來源于華南地區(qū)中華眼鏡蛇(naja naja atra)的眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor,CVF)建立起激活補體旁路引起血小板變形聚集的模型。該蛇毒因子同時具有激活C3、C5的作用且除激活補體作用外尚未發(fā)現(xiàn)其他直接的生物活性。旁路激活補體作用于大鼠血小板發(fā)生明顯的變形和緩慢的血小板聚集，參與生理性止血或病理性血栓形成。該作用依賴于補體，因為56 ℃，30 min處理血漿后(熱滅活補體)變形聚集作用消失[13-14]。麻黃抗補體組份能有效減輕血小板的變形作用，表明該組份對旁路激活途徑有抑制作用，提示有防治血管內凝血的作用。

補體活化能通過多種機制促進血管內凝血的發(fā)生，C5b6789n(攻膜復合物)能溶解內皮細胞，破壞細胞間連接，暴露并激活內皮下基質，基質粘附并激活血小板及凝血酶引起凝血反應[15]。補體活化產生的過敏毒素C3a、C5a可結合并激活炎癥細胞(如中性粒細胞和巨噬細胞)產生氧自由基及彈性蛋白酶影響內皮細胞功能并使硫酸化肝素脫落加強了凝血傾向[16-17]。

異種血清與培養(yǎng)的內皮細胞共同孵育,建立起超急性排斥的模型已被廣泛應用于實驗研究當中。大多數實驗研究認為經典激活途徑是超急性排斥反應發(fā)生的主要原因[18-20]。由于天然抗體的存在，補體的激活過程很快,所以補體的細胞毒作用也很迅速,如C5a促進黃嘌呤脫氫酶在5～10 min內轉化為黃嘌呤氧化酶,促進氧自由基的生成[21]。在30～60 min被激活的內皮細胞丟失超過50%的細胞表面的硫酸化肝素[22]。 MAC在5 min內可在細胞連接上形成5 μm直徑的小洞[23]。本次實驗將新鮮兔血清與新生小牛胸主動脈內皮細胞孵育4 h能使超急性排斥反應充分發(fā)生。麻黃組份預先與血清溫育10 min后，觀察到其減弱了新鮮血清對內皮細胞的損傷作用?？赡苁怯捎诖嬖诼辄S組份抑制補體活化，減輕了補體依賴性損傷。本文中發(fā)現(xiàn)麻黃組份能有效地抑制補體引起的血小板激活以及抑制補體損傷內皮細胞，表明該組份可能防止補體依賴性的血管內凝血反應，為麻黃治療免疫性疾病提供了理論依據，也為進一步研究和開發(fā)麻黃做出了初步探索。

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IsolationofAnti-complementComponentsfromEphedraSinicaanditsProtectiveEffectonComplement-dependentInjury

CHEN Jianwen,ZHANG Wenpin,ZHOU Changhua,et al
(LaboratoryofPharmacologyandToxicology,SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou，Guangdong510006,China)

ObjectiveTo isolate the anti-complement components from ephedra sinica and investigate its protective effect on complement-dependent injury.MethodsAnti-complement components were seprerated by using column chromatography;turbidimetric assay was used to investigate the effect of anti-complement component on CVF-induced platelet metamorphose;MTT method was used to investigate the effect of anti-complement components on endothelial cells injury caused by rabbit serum.ResultsAnti-complement components effectively reduced CVF-induced platelet metamorphose and attenuated the endothelial cells injury caused by rabbit serum.ConclusionAnti-complement components may have protective effect on complement-dependent injury.

ephedra sinica； complement； member attack complex； complement-dependent injury

2095-1116(2014)05-0436-04

2014-03-18

陳健文，本科，主管技師，研究方向：藥物藥效學，E-mail：cjw1975@263.net.通訊作者陳少銳，博士，講師，研究方向：心血管藥理學，E-mail：chshaor@mail.sysu.edu.cn.

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(此文編輯：蔣湘蓮)