， ，卓然， ， (南華大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，湖南 衡陽 421001)

·臨床醫(yī)學·

紡錘體檢查點蛋白Cenp-E在肝癌組織的表達及臨床意義

劉斌，劉婧，劉卓然，汪翼，吳廣
(南華大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，湖南 衡陽 421001)

目的觀察紡錘體檢查點蛋白(Cenp-E)在肝癌組織和人類正常肝組織表達水平的差異，以探討Cenp-E蛋白在肝癌細胞中的表達及臨床意義。方法用熒光定量PCR和Western blot分別檢測Cenp-E基因和蛋白在肝癌組織和正常肝組織的表達水平。結果正常肝組織中Cenp-E基因mRNA水平(0.023 78±0.009 73)明顯高于肝癌組織(0.014 58±0.008 73)；Cenp-E蛋白表達量在正常肝組織中(0.656±0.012)明顯高于在肝癌組織中的表達(0.301±0.009)，且二者有顯著性差異。結論Cenp-E低表達在肝癌的發(fā)生過程中起重要作用。

紡錘體檢查點； Cenp-E基因； 肝癌

肝細胞癌(human hepatocellular carcinoma，HCC)是十大惡性腫瘤之一,發(fā)生機制仍不十分清楚。研究證實,HCC存在基因組不穩(wěn)定性或遺傳學不穩(wěn)定性。應用比較基因組雜交(CGH)技術對50例的HCC基因組圖譜進行了分析,發(fā)現(xiàn)DNA缺失普遍存在于4q(70%)、8p(65%)、17p(51%)、13q(37%)、6p(37%)和1p(30%)；而DNA增縊頻繁發(fā)生在8q(60%)、1q(58%)、6p(30%)和17q(30%),表明在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中存在多種染色體的異常[1]。以上表明HCC的發(fā)生是一種多染色體，多基因異常的結果。但具體涉及哪些基因以及他們在癌變過程中所起的作用尚有待進一步研究。

紡錘體檢查點(spindle checkpoint，SCP)的功能是監(jiān)測細胞染色體分離。檢查點功能喪失的一個后果是遺傳不穩(wěn)定性,促使細胞更容易惡變。由此可見由于紡錘體檢查點在有絲分裂中負責監(jiān)督染色體排位和分離,它們的結構改變和組分喪失也可以引發(fā)一些癌癥[2]。有報道SCP另一個重要基因有絲分裂阻滯缺陷蛋白2(MAD2)在乳腺癌中蛋白表達是降低的[3]。本研究探討紡錘體檢查點蛋白Cemp-E在肝癌組織的表達情況，為肝癌的臨床診斷提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

收集2012年1月～2013年10月南華大學附屬第一醫(yī)院和南華大學附屬第二醫(yī)院肝癌患者術中肝癌組織及癌旁正常肝組織21例。術前經(jīng)患者及家屬同意,并通過南華大學倫理委員會批準。DNA及質(zhì)粒抽提試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自上海華舜公司。Cenp-E和GAPDH的兔一抗，羊抗兔二抗購自Santa-Cruz公司。SYBR Green染料熒光定量試劑購自Takara公司。RIPA裂解液購自上海申能博彩。

1.2 標準質(zhì)粒的構建

1.2.1 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 將肝癌組織及癌旁正常組織按照試劑盒說明書操作用Trizol試劑(GIBICO公司)提取總RNA。然后按照Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應及產(chǎn)物鑒定 引物序列由Takara公司設計并合成,Cenp-E基因上游引物：5′-GCTGTCTGCGATACTGTGAAC-3′；下游引物：5′-CAATCCCTCCAAAATCAAGTG-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GCAGAGGGGGCAGAGATGA-3′，下游引物：5′-ACTCCTCTGGCTTCTCTGGTT-3′。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 15 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，35個循環(huán)；最后72 ℃退火延伸10 min；PCR產(chǎn)物4 ℃保存。

1.2.3 T-A克隆 將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,按照華舜膠回收試劑盒說明書純化PCR產(chǎn)物,按照Takara操作說明書將其連接到pMD18-T質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細菌中，鋪板挑陽性菌落做菌落PCR，初步鑒定為陽性者增菌提質(zhì)粒送公司測序，經(jīng)DNAssist Versuib 1.02軟件比對后制備純化質(zhì)粒用于定量PCR標準曲線的建立。

1.3 熒光定量PCR

用SYBR Green染料熒光定量法(Takara公司的試劑)檢測Cenp-E基因的mRNA的水平，Cenp-E基因與內(nèi)參引物見前。用已稀釋的標準質(zhì)粒作為陽性標準品。擴增條件為：95 ℃ 10 s 1個循環(huán) ；95 ℃ 5 s，63 ℃ 31 s 40個循環(huán)。

1.4 Western blot免疫印跡

1.4.1 蛋白質(zhì)抽提和定量(參照試劑說明)，步驟如下 (1)每100 mg組織加入400 μL RIPA裂解液和4 μL PMSF。放入勻漿器中于冰上研磨。

(2)移至1.5 mL Ep管，冰上放置30 min后，4 ℃ 13 000 rpm離心30 min。

(3)收集上清即為蛋白液，分裝為50 μL每管于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量測定.

1.4.2 Western blot檢測Cenp-E蛋白的表達 將肝癌組織，提出的蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜．兔一抗的釋度為1∶200；羊抗兔二抗皆作1∶5 000稀釋;ECL法顯色。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù),結果以平均數(shù)±標準差表示。組內(nèi)比較用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05差異有顯著性。

2.1 Cenp-E基因mRNA水平分析

熒光定量PCR檢測Cenp-E基因在各組的mRNA水平，溶解曲線如圖1所示，以Cenp-E基因mRNA拷貝數(shù)/GAPDH基因mRNA拷貝數(shù)的均值作為該樣品中Cenp-E基因表達水平，在正常肝組織中表達水平(0.023 78±0.009 73)高于肝癌組織(0.014 58±0.008 73),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 肝癌組織Cenp-E蛋白表達

Cenp-E蛋白表達如圖2所示，可以發(fā)現(xiàn)Cenp-E與GAPDH的灰度值比值在正常肝組織中為0.656±0.012,在肝癌組織中為0.301±0.009.P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義(n=21)。

3 討 論

Cenp-E主要定位于著絲粒的外層,是一種重要著絲粒特異蛋白，同時也是著絲粒點與微管有效連接的動力蛋白。越來越多的實驗證明Cenp-E在SCP機制起著非常重要的作用，現(xiàn)在研究表明，一定量的Cenp-E水平，對SCP的激活是起非常重要的作用[4]。Cenp-E主要通過BubR1來影響SCP機制，當Cenp-E與BubR1作用時，通過一系列的分子反應后，MAD2開始從著絲粒脫落，姐妹染色單體開始分離，從而導致細胞分裂開始[5]。

圖2 Cenp-E蛋白表達. 1：正常肝組織；2：肝癌組織. 與正常肝組織相比，*：P<0.05

另外研究發(fā)現(xiàn)在許多癌細胞有異常的SCP功能。MAD2表達降低見于鼻咽癌、肝細胞癌、人乳腺癌及其一些乳腺癌細胞系和卵巢癌等，并與SCP缺陷切相關[6]。Bubl是SCP中另外一種較重要的癌基因，Bubl的mRNA降低也見于結腸癌和急性粒細胞性白血病[7]，高水平Bubl、BubR1和Bub3表達也與胃癌細胞增殖能力密切相關[8]。但Cenp-E與腫瘤之間的關系還不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)Cenp-E在正常肝組織中表達明顯高于肝癌組織，肝癌組織中Cenp-E蛋白表達的降低引起的紡錘體檢查點監(jiān)控功能下降，很可能是導致肝癌細胞有絲分裂失控并導致染色體數(shù)目紊亂的重要原因之一。我們推測肝癌組織Cenp-E表達水平的不足可能是引起紡錘體檢查點的功能異常的重要原因之一，最終導致細胞分裂失控和染色體數(shù)目異常以及腫瘤細胞的發(fā)生。

由于組織標本包含細胞的復雜性和不純性，本研究只能大致從量上分析肝癌和正常組織Cenp-E的表達差異。進一步在肝癌細胞系和正常細胞系中研究Cenp-E的功能，將為進一步探明肝癌的發(fā)生機制奠定基礎，也為肝癌臨床早期預防及診斷治療提供新的依據(jù)。

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ExpressionoftheSpindleCheckpointProteinCenp-EintheHumanHepatomTissueandItsClinicalSignificance

LIU Bin,LIU Jing,LIU Zhuoran,et al
(Clinicallaboratory,thesecondaffiliatedhospital,universityofsouthchina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo study the differential expression and its clinical significance of the spindle checkpoint protein Cenp-E gene between the human hepatoma and hepatic tissue.MethodsReal-time fluorescent-quantitation PCR and Western blot were employed to detect the expressions of the Cenp-E mRNA and protein,respectively.ResultsThe expression of the Cenp-E mRNA in human hepatic tissue(0.023 78±0.009 73) was higher than that in human hepatoma tissue(0.014 58±0.008 73).The expression of the Cenp-E protein in human hepatic tissue(0.656±0.012) was higher than that in human hepatoma tissue(0.301±0.009).ConclusionCenp-E gene low expression in human hepatocellular carcinoma plays an important role in the its developmental process.

spindle checkpoint; Cenp-E gene; hepatoma

2095-1116(2014)05-0459-03

2014-01-17

湖南省教育廳課題(No.13C796).

劉斌 ,碩士，主管技師，研究方向：腫瘤細胞周期和染色體分裂機制，E-mail: 29869248@.qq.com.

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(此文編輯：秦旭平)