丁俊男，遲德富

（東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

混合鹽堿脅迫對桑樹種子萌發(fā)和根系生長的影響

丁俊男，遲德富

（東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

將兩種中性鹽（NaCl和Na2SO4）、兩種堿性鹽（NaHCO3和Na2CO3）按不同比例混合，模擬出16種鹽度和堿度不同的鹽堿條件，并對桑樹種子萌發(fā)過程進(jìn)行混合鹽堿處理，測定桑樹種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢等種子萌發(fā)參數(shù)，以及萌發(fā)中根系長度和活力指數(shù)等根系生長參考，通過模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)值的方法分析了各參數(shù)與各種致脅變因素之間的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明：在復(fù)雜的鹽堿混合脅迫下，影響桑樹種子萌發(fā)和根系生長的致脅變因素主要是鹽度、pH和緩沖量。鹽度是桑樹種子萌發(fā)過程中的主導(dǎo)因素，堿脅迫的影響較小；而堿脅迫(pH值)主要抑制桑樹種子萌發(fā)過程中根系生長和活力指數(shù)，尤其是pH大于8.0時(shí)，桑樹幼根褐化、變軟，根系生長主要受pH值和緩沖量等堿性條件的制約。因此，鹽脅迫限制了桑樹種子發(fā)芽，堿脅迫抑制了萌發(fā)中根系生長。這是松嫩平原鹽堿土制約植被恢復(fù)的重要限制因素之一。

桑樹種子；萌發(fā)過程；根系生長；混合鹽堿脅迫

松嫩平原鹽堿多以NaCl、Na2SO4為主的中性鹽和以NaHCO3、Na2CO3為主的堿性鹽形成的，其危害性高于單一的中性鹽[1-2]。目前，已經(jīng)有大量的研究證明堿性鹽脅迫比中性鹽脅迫對植物的生化破壞力更強(qiáng)[3-4]。桑樹雖然具有較強(qiáng)的抗低溫、鹽堿和干旱等逆境條件的能力，但是，復(fù)雜的鹽堿條件限制了桑樹種子的萌發(fā)和幼苗的生長，但有關(guān)桑樹種子在鹽堿條件下種子萌發(fā)和根系生長特性方面的研究較少。目前，有關(guān)鹽堿條件下植物種子萌發(fā)已在星星草[5]、高粱[6]、棉花[7]、大棗[8]和向日葵[9]等農(nóng)作物中報(bào)道，主要引起植物產(chǎn)生滲透脅迫和離子脅迫，改變植物細(xì)胞內(nèi)部離子濃度和種類，使植物細(xì)胞吸水困難，葉綠體受到損傷，膜系統(tǒng)遭到破壞，從而造成植物體的傷害甚至死亡。松嫩平原鹽堿土地區(qū)桑樹植物生長的先決條件是桑樹種子能夠正常萌發(fā)，而在桑樹種子萌發(fā)過程中，鹽度和堿度分別影響到種子萌發(fā)的哪個(gè)過程還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)分別以不同含量的兩種中性鹽（NaCl、Na2SO4）和兩種堿性鹽（NaHCO3、Na2CO3）模擬了松嫩平原鹽堿環(huán)境，探討了混合鹽堿脅迫對桑樹種子萌發(fā)和根系生長的影響，以期為解決桑樹在鹽堿地上的正常萌發(fā)和生長提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)于2013年7月在東北林業(yè)大學(xué)植物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將兩種中性鹽NaCl和Na2SO4、兩種堿性鹽NaHCO3和Na2CO3按不同比例混合，根據(jù)桑樹種子的萌發(fā)特點(diǎn)及其對酸堿的耐受程度的不同，分別設(shè) 50、100、150、200 mmol·L-14 個(gè)鹽濃度處理（文中分別1、2、3、4代表4個(gè)濃度），然后每個(gè)鹽濃度內(nèi)按堿比例逐漸增大的趨勢設(shè)4個(gè)pH值剃度，依次標(biāo)為A、B、C、D，共計(jì)16個(gè)處理組合。各處理的鹽分組成及比例見表1。各處理液的pH值用數(shù)字pH計(jì)測定，并分別用低濃度的KOH和HCl將A、B、C、D各處理pH值標(biāo)定為7.0、8.0、9.0和10.0，其各溶液中各鹽組分及比例如表1所示。

試驗(yàn)所用“青龍?！狈N子，由黑龍江省蠶業(yè)研究所提供。將16種處理液分別加到鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿各加5 ml，然后將每個(gè)培養(yǎng)皿中都整齊擺入30粒“青龍?！狈N子。每個(gè)處理重復(fù)3次，共48個(gè)培養(yǎng)皿。放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為使培養(yǎng)皿內(nèi)的鹽濃度保持不變，每2天更換一次培養(yǎng)皿及濾紙，每次更換時(shí)加入的處理液用量及方法與第一次相同，待種子萌發(fā)后進(jìn)行各萌發(fā)參數(shù)的測定。

1.2 測定項(xiàng)目和方法

按照國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局頒發(fā)的《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》（1995）分別測定桑樹種子萌發(fā)過程中的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)：發(fā)芽率（Germination rate，GR） （%） =第6 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽勢（Germination energy，GE） （%） = 4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)（Germination index，GI） =ΣGt/Dt（Gt指時(shí)間 t的發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）；活力指數(shù)（vigor index，VI）=萌發(fā)率×（幼苗根的長度（cm）），并記錄累積發(fā)芽率（accumulate germination percentage）和根系長度（root length，RI）。鹽害系數(shù)按董志剛等人的方法計(jì)算，其公式為鹽害系數(shù)（%）= （對照值-處理值）/對照值×100%。在桑樹種子萌發(fā)過程中的致脅變因素包括鹽濃度、pH值、緩沖量、Na+、Cl-、、和等，根據(jù)處理液的實(shí)際比例算出。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用Excel和SPSS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SE），采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，并且采用隸屬函數(shù)法對各鹽濃度和pH值進(jìn)行桑樹種子萌發(fā)和初期根系生長主導(dǎo)因素的綜合評定[10]，隸屬函數(shù)值X(ij)采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)值的方法計(jì)算，公式為：X(ij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)，式中X(ij)表示i種類j指標(biāo)的隸屬值；Xij表示i種類j指標(biāo)的測定值；Xjmax、Xjmin分別為指標(biāo)的最大值和最小值，然后求其各隸屬函數(shù)的總和，利用總隸屬函數(shù)值對桑樹種子萌發(fā)情況進(jìn)行排序，并利用各因素與萌發(fā)項(xiàng)目的相關(guān)性確定桑樹種子萌發(fā)的主導(dǎo)影響因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹種子萌發(fā)參數(shù)之間的相關(guān)分析

表2顯示桑樹種子萌發(fā)期間發(fā)芽率（GR）、發(fā)芽指數(shù)（GI）、發(fā)芽勢（GE）、根長（RL）和活力指數(shù)（EI）之間的相關(guān)性分析表。結(jié)果表明，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢之間的相關(guān)系數(shù)都在0.95以上，均達(dá)極顯著正相關(guān)（P＜0.01），根長與活力指數(shù)的相關(guān)性較大，而發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢與根長、活力指數(shù)之間的相關(guān)性較小，其原因可能種子萌發(fā)階段和根系伸長階段所受制約因素不同造成的。因此，將發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢確定為桑樹種子萌發(fā)的參考指標(biāo)，而將根長與活力指數(shù)確定為影響根系生長的參考指標(biāo)。

2.2 鹽堿脅迫因素與桑樹種子萌發(fā)參數(shù)之間的相關(guān)分析

通過表3中各萌發(fā)參數(shù)與各脅迫因素的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各萌發(fā)參數(shù)與各脅迫因素之間均為負(fù)相關(guān)，即各脅迫因素均能抑制桑樹種子的萌發(fā)和根系的生長。其中，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)三個(gè)指標(biāo)與鹽濃度相關(guān)性高于其它指標(biāo)，其相關(guān)性極顯著（F0.01=0.59），與緩沖量和[]+[]之間的呈顯著負(fù)相關(guān)（F0.01=0.468），與[]、[]和[之間的相關(guān)性較差，這說明桑樹種子的萌發(fā)主要受鹽濃度的影響，而根系長度和活力指數(shù)受鹽濃度影響略有下降，與pH值、緩沖量和2[+[]之間達(dá)極顯著負(fù)相關(guān)，說明桑樹萌發(fā)過程中根系生長主要受其環(huán)境中堿性條件的限制。

表3 各脅迫因素與發(fā)芽指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)Table3 Correlation coefficients between stress factors and germination indexes

圖1 混合鹽堿條件對桑樹種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of complex salt and alkali conditions on germination of mulberry seeds

2.3 不同鹽濃度對桑樹種子萌發(fā)參數(shù)的影響

進(jìn)一步分析不同鹽濃度對桑樹種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢的影響（圖1），可以看出在復(fù)合鹽堿脅迫下，種子萌發(fā)比CK推遲1 d。鹽濃度一定時(shí)，堿比例增加，種子萌發(fā)明顯受到抑制，當(dāng)鹽濃度為100 mmol·L-1時(shí)種子萌發(fā)減弱，達(dá)到150 mmol·L-1時(shí)種子萌發(fā)基本停止，萌發(fā)困難，鹽濃度達(dá)到200 mmol·L-1時(shí)，種子不再萌發(fā)（結(jié)果未列出）。隨著鹽濃度的變化，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均變化明顯，隨著鹽濃度的增大，三個(gè)指標(biāo)均呈現(xiàn)明顯降低趨勢。在鹽濃度為50 mmol·L-1到 150 mmol·L-1的區(qū)段內(nèi)，種子萌發(fā)下降明顯，150 mmol·L-1之時(shí)，萌發(fā)受到嚴(yán)重抑制。

2.4 pH值對桑樹根系生長的影響

由于pH值抑制種子根系生長，進(jìn)一步分析不同pH值對根系生長中的根系長度和活力指數(shù)的影響的程度。圖2結(jié)果顯示，鹽處理和堿處理均明顯抑制種子根系的生長。在低鹽濃度下，桑樹種子雖然能夠保證正常的萌發(fā)，但其根系生長受到嚴(yán)重的抑制，并且在鹽濃度一定時(shí)隨著pH值的增加根系生長受到抑制的程度加大，特別是在種子萌發(fā)的第6 d，各處理的根系長度在同一鹽濃度但不同pH值條件下表現(xiàn)出顯著差異水平。說明根系生長除受鹽濃度影響外，受溶液中堿性環(huán)境影響也較為顯著，通過根系長度和活力指數(shù)在不同pH值下生長趨勢可以看出，在鹽濃度50 mmol·L-1和100 mmol·L-1下當(dāng)pH值增加到9.0和10.0時(shí)，根系生長受到明顯抑制。

圖2 混合鹽堿條件對桑樹根系生長的影響Fig.2 Effects of complex salt and alkali conditions on the root growth of mulberry seedlings

2.5 混合鹽堿下桑樹種子萌發(fā)和根系生長的綜合評價(jià)

表4結(jié)果顯示，隸屬函數(shù)值排名前幾位的均是低鹽濃度，說明鹽分對種子萌發(fā)影響最大，當(dāng)鹽濃度一定時(shí)，桑樹各萌發(fā)和根系生長參數(shù)的隸屬函數(shù)均隨堿含量的升高呈現(xiàn)降低趨勢。當(dāng)鹽濃度達(dá)到150 mmol·L-1時(shí)，隸屬函數(shù)總排序雖然不是按堿濃度增加而增加，但由于此時(shí)桑樹種子的萌發(fā)受到嚴(yán)重抑制，各參數(shù)的隸屬函數(shù)值之間并無顯著差異，而當(dāng)鹽濃度增加到200 mmol·L-1時(shí)，桑樹種子無萌發(fā)跡象，各隸屬函數(shù)值均為0。

3 討 論

通過測定桑樹種子萌發(fā)過程中的種子發(fā)芽和根系生長指標(biāo)，桑樹種子在鹽堿脅迫下的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢之間存在明顯正相關(guān)，各指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)都在0.95以上，均達(dá)極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而根長與活力指數(shù)之間呈現(xiàn)明顯正相關(guān)關(guān)系。但是，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢與根長、活力指數(shù)之間的相關(guān)性較小。因此，可以將發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢確定為桑樹種子萌發(fā)的參考指標(biāo)，而將根長與活力指數(shù)確定為影響根系生長的參考指標(biāo)。

本試驗(yàn)通過以兩種中性鹽NaCl和Na2SO4、兩種堿性鹽NaHCO3和Na2CO3按不同比例混合模擬實(shí)際情況下土壤鹽堿含量分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)合鹽對桑樹種子的萌發(fā)影響與單鹽脅迫有著相似的特點(diǎn)，都是隨著鹽濃度的升高，種子的萌發(fā)率呈明顯下降趨勢，并且發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等參數(shù)均隨著鹽濃度的增加而下降。但是，混合鹽堿脅迫包含的脅迫因素比單鹽復(fù)雜，各生理指標(biāo)受到不同離子以及離子之間相互作用的影響，加上種子萌發(fā)過程中種子發(fā)芽和根系生長所處環(huán)境不同，有必要確定影響萌發(fā)的主導(dǎo)因素。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，盡管脅迫因素很多，但是鹽度仍是決定桑樹種子發(fā)芽的主導(dǎo)因素，而堿脅迫的影響很小。其原因可能是隨著鹽脅迫的不斷升高，種子周圍的水勢逐漸降低，種子的生理吸水受到限制，致使種子胚乳內(nèi)儲藏的物質(zhì)不能動員，種子難以萌發(fā)，也可能是在種子吸漲吸水過程中高濃度的鹽脅迫會破壞種子的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜透性的增大導(dǎo)致細(xì)胞中電解質(zhì)的外滲量增加，從而導(dǎo)致種子萌發(fā)受阻[11-12]。發(fā)芽勢主要反映了種子發(fā)芽的快慢和整齊度，發(fā)芽率反映了種子發(fā)芽的多少，發(fā)芽指數(shù)能夠反映種子在整個(gè)發(fā)芽期的綜合活力，這些指標(biāo)雖能夠從不同的角度反映出桑樹種子萌發(fā)期的耐鹽性強(qiáng)弱，但單個(gè)指標(biāo)反映耐鹽性往往具有一定的片面性[13]，為研究植物在復(fù)合鹽脅迫下的綜合評定，不能僅僅對單一指標(biāo)進(jìn)行分析，需要將各指標(biāo)綜合起來，從而建立合適的數(shù)量化指標(biāo)體系來進(jìn)行抗鹽堿脅迫的綜合評價(jià)。本研究中采用了數(shù)學(xué)分析方法——隸屬函數(shù)法，通過對不同鹽堿濃度下的桑樹種子的5個(gè)生理生化指標(biāo)進(jìn)行綜合分析評判，通過隸屬函數(shù)法的排序可以發(fā)現(xiàn)，排名前幾位的均是低鹽濃度，同樣說明鹽分對種子萌發(fā)影響最大。

根系的生長和萌發(fā)分別受不同因素的限制，因此影響根系生長和桑樹種子萌發(fā)的主導(dǎo)因素也不相同，本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)后，pH值和緩沖量與桑樹根系長度和活力指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而在種子萌動階段與環(huán)境的物質(zhì)交流主要以吸水為主，所以受環(huán)境pH影響很小。pH脅迫會造成種子周圍礦質(zhì)營養(yǎng)狀況的嚴(yán)重破壞[14]，而在種子生長后期，涉及胚根、胚芽的生長以及細(xì)胞分裂、伸長和分化等生理過程，需要從環(huán)境攝取大量礦質(zhì)元素，因此植物不僅需要進(jìn)行必要的滲透調(diào)節(jié)，同時(shí)也需要進(jìn)行細(xì)胞中酸堿環(huán)境的調(diào)節(jié)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)保持鹽濃度不變堿含量升高的情況下，在高堿性鹽脅迫使桑樹根系嚴(yán)重氧化，pH達(dá)到8.0時(shí)根系開始變?nèi)彳?，根尖生長點(diǎn)褐化，生長受到嚴(yán)重抑制。通過隸屬函數(shù)法的排序也可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)保持鹽濃度一致，根系的生長主要受pH值和緩沖量等堿性脅迫因素影響。

表4 混合鹽堿脅迫下桑樹種子萌發(fā)期各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table4 Effects of complex salt and alkali conditions on salt toxicity coefficient of indices in germination stage

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Effects of mixed salt and alkali stress on germination and root growth of mulberry seeds

DING Jun-nan, CHI De-fu
(College of Life Sciences, Northeast Forest University, Harbin 150040, Heilongjiang, China)

During germination, seeds of mulberry were treated with 16 different of alkalinity and salinity conditions, which were established by mixing NaCl, NaHCO3, Na2SO4, and Na2CO3at various proportions. Germination parameters (germination rate,germination index and germination energy etc.) and root growth parameters (root length, vigor index etc.) were investigated. The correlations of indexes and stress-caused factors during mulberry seeds germination were analyzed by using method of subordinate function value. The results show that salinity, pH, buffer capacity were the dominant stress acting factors in all of stress indexes during mulberry seed germination and root growth under complex saline and alkali conditions; Salinity was the leading factor on the germination of mulberry seeds than alkali stress, but root length and vigor index were inhibited more seriously by alkali stress than salt stress; While alkaline stress (pH value) mainly inhibited the root growth during germination and vigour index of Mulberry seeds,Mulberry root became darkened and soft when pH was over 8, so root growth was mainly inhibited by pH and buffer capacity. It was found that the germination of mulberry seeds was inhibited by salinity, and the root growth were limited by alkali stress. These stress were one of the most important limiting factors of vegetation recovery in Songnen Plain, Northeast China.

Morus alba L.; mulberry seeds; germination process; root system growth; salt and alkali mixed stress

S722.3

A

1673-923X(2014)12-0078-05

2014-01-20

國家自然科學(xué)基金（31370649）項(xiàng)目資助

丁俊男（1982-），男，黑龍江哈爾濱人， 博士研究生，主要從事分子生物學(xué)研究；E-mail：ding.junnan@163.com

遲德富（1962-），男，遼寧海城人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯直Ｗo(hù)學(xué)； E mail：chidefu@126.com

[本文編校：文鳳鳴]