周國英 ，徐海舟，晏 俊 ，張 磊 ，伍 南 ，閆瑞坤

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，教育部經(jīng)濟林培育與保護重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.阿克蘇地區(qū)林業(yè)局，新疆 阿克蘇 8430002）

不同培養(yǎng)條件對摩西球囊霉生長發(fā)育的影響

周國英1，徐海舟1，晏 俊1，張 磊1，伍 南2，閆瑞坤2

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，教育部經(jīng)濟林培育與保護重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.阿克蘇地區(qū)林業(yè)局，新疆 阿克蘇 8430002）

為了獲得大量杉木內(nèi)生菌根菌的接種菌劑，以摩西球囊霉Glomus mosseae為研究對象，對其宿主植物、培養(yǎng)基質(zhì)、栽培密度和營養(yǎng)液濃度四方面培養(yǎng)因素進行了研究。結(jié)果表明：摩西球囊霉的最佳宿主植物為高粱，最佳培養(yǎng)基質(zhì)為3號培養(yǎng)基質(zhì)處理，即沙：蛭石：土的比例為2∶1∶1（體積比），最佳栽培密度為20株/5L盆，最佳的營養(yǎng)條件為追施用濃度為30%的Hoagland’s營養(yǎng)液。

摩西球囊霉；AM真菌；擴繁；生長發(fā)育

AM菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi）廣泛分布于自然界，能與世界上80%以上的植物形成共生體系[1-2]。大量研究表明，AM菌根真菌能促進宿主對土壤中礦質(zhì)元素P、N、K、Cu、Zn等元素的吸收，從而促進植物生長，提高宿主根系對根部病菌的抵抗力和增強植物對干旱、高溫、重金屬的抗性[3-5]。李琳等[6]對我國南方杉木林根際的菌根菌資源進行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)摩西球囊霉、根內(nèi)球囊霉和光壁無梗囊霉屬于優(yōu)勢種，縮球囊霉和幼套球囊霉屬于常見種。本文對其中優(yōu)勢種摩西球囊霉的擴繁條件進行篩選，探討了宿主植物、培養(yǎng)基質(zhì)、栽培密度和營養(yǎng)液濃度四種因素對摩西球囊霉生長發(fā)育的影響，旨在為研制出適用于南方杉木林的生物肥料提供支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗菌種：采用杉木優(yōu)勢內(nèi)生菌根菌——摩西球囊霉（Glomus mosseae），中南林業(yè)科技大學(xué)實驗室提供。

供試植株：高粱、三葉草、玉米和蔥種子均從市場上購買。

培養(yǎng)基質(zhì)：沙蛭石混合物（1號），其沙和蛭石體積比為3∶1；沙土混合物（2號），其沙和土體積比為3∶1；沙蛭石土混合物（3號），其沙、蛭石和土體積比為2∶1∶1；沙土混合物（4號），其沙和土體積比為1∶1。其中河沙采中南林業(yè)科技大學(xué)校園建筑用河沙，土為黃壤土（均用5 mm篩過篩）。

1.2 實驗方法

1.2.1 宿主植物的篩選

將4號培養(yǎng)基質(zhì)在100℃條件下間歇滅菌2次。用高錳酸鉀對容積為5 L塑料盆進行消毒。種子用10%（體積分數(shù)）的H2O2消毒，28℃催芽，70%種子露白即播種。播種時，每盆分別先裝2 kg基質(zhì)，后鋪30 g菌劑，再覆0.5 kg基質(zhì)。每種宿主植物設(shè)3次重復(fù)，共12盆。出苗后1周定苗，每盆玉米、高粱15株，蔥、和三葉草均為20株，試驗期間根據(jù)需要澆水及Hoagland’s營養(yǎng)液，三個月后收獲，取樣用于相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.2 培養(yǎng)基質(zhì)的篩選

將1、2和3號培養(yǎng)基質(zhì)在100℃間歇滅菌兩次。將上一步實驗篩選出的最適宿主植物消毒后，播種方法同上，每種培養(yǎng)基質(zhì)設(shè)3次重復(fù)，共9盆。出苗1周后定苗。試驗期間根據(jù)需要澆水及Hoagland’s營養(yǎng)液，三個月后收獲，取樣用于相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.3 栽培密度的篩選

以篩選出來的最適宿主植物及培養(yǎng)基質(zhì)接種，設(shè)10株/盆、20株/盆、40株/盆和60株/盆的四種處理，每個處理重復(fù)3次，共12盆。播種方法同上，出苗1周后定苗。試驗期間根據(jù)需要澆水及Hoagland’s營養(yǎng)液。三個月后收獲，取樣用于相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.4 營養(yǎng)液濃度的篩選

對摩西球囊霉篩選出以上最適培養(yǎng)條件后，按同樣的方法消毒播種，出苗1周后定苗。分 別 設(shè) 濃 度 為10%、20%、30%、50%、100%Hoagland’s營養(yǎng)液5種處理，每個處理重復(fù)3次，共15盆。從出苗起每周用不同處理的營養(yǎng)液灌施一次，每次每盆100 mL，第8周起每次每盆200 mL，至12周停止灌施。試驗期間根據(jù)需要澆水。三個月后收獲，取樣用于相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.5 實驗數(shù)據(jù)測定

根據(jù)Phillips & Hayman方法[7]測定AM真菌不同結(jié)構(gòu)(菌絲、泡囊、叢枝)的侵染率及菌根侵染率，計算公式為：侵染率=(AM真菌侵染根段數(shù)/檢查總根段數(shù))×100%，菌根長度=根長×侵染率。

基質(zhì)風(fēng)干后采用濕篩傾注法測定 AM真菌孢子數(shù)[8]。本實驗中孢子密度為每mL干土中所含的AM真菌孢子數(shù)量。采用稱重法測量植物地上部分與地下部分干重。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan’s法對均值檢測其差異顯著性（P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同宿主植物對摩西球囊霉生長的影響

摩西球囊霉與供試的4種宿主植物都能正常共生。由表1可知，與高粱共生培養(yǎng)后，其孢子密度達到84個·mL-1，菌絲含量達到75.7%，侵染率高達86.9%，與其他三種宿主植物相比具有顯著性差異。這表明：高粱對摩西球囊霉的擴繁較為有利。

表 1 不同宿主植物對摩西球囊霉生長發(fā)育的影響Table 1 Effects of different host plants on growth of Glomus mosseae

2.2 不同培養(yǎng)基對摩西球囊霉生長的影響

3種培養(yǎng)基質(zhì)的養(yǎng)分都較貧乏，但也存在一定的差異，主要差異表現(xiàn)在有機質(zhì)、速效磷和速效鉀上（表2）。

表2 基質(zhì)的基本理化性狀Table 2 Chemical and physical properties of different substrates

表3 不同培養(yǎng)基質(zhì)對摩西球囊霉生長發(fā)育的影響Table 3 Effects of different culture substrates on growth of Glomus mosseae

由表3可以看出，摩西球囊霉的菌絲含量、侵染率和孢子密度明顯受到了培養(yǎng)基質(zhì)的影響。3號培養(yǎng)基質(zhì)處理的菌絲含量、侵染率和孢子密度均達到了最大值，分別為80.3%、87.4%和88個·mL-1。不同培養(yǎng)基質(zhì)對于摩西球囊霉處理下的宿主高粱的生長狀況也表現(xiàn)出一定的差異（表4）。摩西球囊霉與3號基質(zhì)組合處理下高粱的地上部、地下部干重和菌根長度均顯著高于其他處理，分別為 16.19 g·盆-1、2.03 g·盆-1和 98.25 cm·盆-1。由于地上部及地下部生物量不一致，根冠比發(fā)生變化，而3號基質(zhì)處理的高粱的根冠比最小，說明3號基質(zhì)最有利于高粱的生長。3號處理的菌根長度顯著高于其他處理，1號最低。

表4 不同基質(zhì)處理對宿主高粱生物量的影響Table 4 Effects of different culture substrates on biomass of sorghum

2.3 不同栽培密度對摩西球囊霉生長的影響

表5 不同栽培密度對摩西球囊霉生長發(fā)育的影響Table 5 Effects of different planting density on growth ofGlomus mosseae

由表5可知，栽培密度能夠調(diào)節(jié)菌絲含量、侵染率和孢子密度。當(dāng)栽培密度為20株/5L盆時，其菌絲含量81.6%、菌根的侵染率為88.3%和孢子密度為90個·mL-1，顯著高于其他處理組。結(jié)果還表明：菌絲含量、侵染率和孢子密度在一定范圍內(nèi)隨著栽培密度的增加而增大，超過一定范圍，隨著栽培密度的增加，菌絲含量、侵染率和孢子密度反而減小。因此，栽培密度可以作為調(diào)節(jié)手段來控制侵染根段、菌絲及孢子等繁殖體數(shù)量的目的。

表6 不同栽培密度對宿主高粱生物量的影響Table 6 Effects of different planting density on biomass of sorghum

由表6可知：高粱地上部干重和地下部分干重與栽培密度成正比的關(guān)系。研究表明，植物中同化產(chǎn)物的分配情況和植物的生長狀況可以通過根冠比反映出來，一般情況下根冠比越大，植物生長受到抑制的程度越強。高粱根冠比隨栽培密度的增加而增大，當(dāng)栽培密度為60株/5L盆時，根冠比達到了最大值。這表明：隨栽培密度不斷增加，物質(zhì)更多地向根中分配，植物受抑制的程度越明顯。

菌根長度測定結(jié)果表明：不同栽培密度的高粱菌根長度存在一定差異，當(dāng)栽培密度為20株/5L盆時，菌根最長，達到了98.92 cm·盆-1。同時還表明：菌根長度起初隨栽培密度的增加而增大，當(dāng)?shù)竭_一定栽培密度之后，又隨之增大而減少。

2.4 不同營養(yǎng)液濃度對摩西球囊霉生長的影響

表7 不同營養(yǎng)液濃度對摩西球囊霉生長發(fā)育的影響Table 7 Effects of different nutrient solution concentration treatments on growth of Glomus mosseae

根據(jù)表7，不同濃度的營養(yǎng)液能明顯影響菌絲含量、泡囊含量、叢枝含量、菌根侵染率和孢子密度，這些指標(biāo)均表現(xiàn)出了基本一致的規(guī)律，即低濃度時隨營養(yǎng)液濃度的增加而增加，達到一定水平后又隨著營養(yǎng)液濃度的增加開始下降。在本試驗條件下，追施30%營養(yǎng)液的處理組中，其相關(guān)指標(biāo)均為最高。這說明菌根共生體中真菌的生長狀況和繁殖體數(shù)量是可以通過人工調(diào)控的方法來控制的。

表8 不同營養(yǎng)液濃度對宿主高粱生物量的影響Table 8 Effects of fertilized with different strength nutrient solutions on biomass of sorghum

由表8結(jié)果表明：不同的營養(yǎng)液濃度一定程度上影響了高粱各部分生物量，隨著濃度的增大，地上部和地下部干重也隨之增大，在濃度由30%增加到100%，地上部和地下部急速增加。高粱根冠比則表現(xiàn)出與營養(yǎng)液濃度呈反比的關(guān)系，根冠比最小的是100%濃度營養(yǎng)液處理組。實驗結(jié)果表明：在養(yǎng)分脅迫的條件下，高粱的生長狀況隨著施用營養(yǎng)液強度的增加而逐步得到改善，其生長受抑制的程度也相應(yīng)地逐步得到緩解。

菌根長度測定結(jié)果表明：追施濃度為30%營養(yǎng)液菌根長度最長，追施100%的濃度菌根長度最短。這表明，根系的生長發(fā)育受到宿主植物的營養(yǎng)狀況的影響。因此，通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)液的強度，可以調(diào)控宿主植物根系的生長。

3 討論與結(jié)論

AM真菌生長發(fā)育受宿主植物、栽培基質(zhì)、營養(yǎng)等諸多因素的影響[9-11]，而且對宿主植物也有選擇性。本實驗采用的摩西球囊霉能與較多的宿主植物共生，可以看出它與供試的4種宿主植物的共同狀況有所不同。高粱處理組中，菌絲含量、侵染率和孢子密度等指標(biāo)都最高。由此看出，該共生體對AM真菌生長比較有利。

土壤有機質(zhì)含量能影響叢枝菌根真菌的生長發(fā)育，叢枝菌根真菌的數(shù)量在一定范圍內(nèi)隨有機質(zhì)含量的升高而增多，超過這一范圍，叢枝菌根真菌的數(shù)量反而減少[12]。采用的3種培養(yǎng)基質(zhì)都屬于貧養(yǎng)分基質(zhì)，相比之下，3號基質(zhì)養(yǎng)分較高。有研究表明，菌根侵染率明顯受到土壤磷水平的影響，進而影響菌絲和孢子的數(shù)量。在一定范圍內(nèi)，增加磷元素的供給能促進菌根真菌的生長發(fā)育，但超過一定值，反而會抑制其生長發(fā)育。氮元素也能影響菌根真菌的生長發(fā)育，其規(guī)律與磷相一致[13]，但沒有磷營養(yǎng)關(guān)系密切。在3號培養(yǎng)基下的宿主植物的侵染率、生物量等指標(biāo)與其它兩種培養(yǎng)基有顯著差異。說明本試驗中所用基質(zhì)的有機質(zhì)、氮元素和磷元素等養(yǎng)分含量在促進叢枝菌根真菌生長發(fā)育的范圍之內(nèi)，因此在選定基質(zhì)基礎(chǔ)上，適當(dāng)增加基質(zhì)中的養(yǎng)分，促進宿主植物的生長，進而促進菌根真菌的生長發(fā)育。綜合考慮侵染根段、菌絲和孢子，沙蛭石土混合物（體積比為2∶1∶1）是以高粱作為宿主植物擴繁摩西球囊霉的最佳培養(yǎng)基。

栽培密度顯著影響了高粱的生長。在栽培密度迅速增加時，高粱干重基本維持不變，這表明高粱長勢逐漸變瘦弱了。但在一定范圍內(nèi)仍可以滿足真菌生長發(fā)育的需要。菌絲含量、侵染率和孢子密度在一定范圍隨著密度增大而逐漸增大。其原因可能是：一方面菌根共生體中，真菌完全從宿主植物獲取碳源，其利用量占植物固定量的1～5%[12]。適當(dāng)增加栽培密度，提高了植物群體光合勢，同化產(chǎn)物更多地向根部供應(yīng)，促進了AM真菌的生長。另一方面適當(dāng)增加栽培密度，植物需要更多的養(yǎng)分，因此需要大量的根外菌絲來幫助宿主植物吸收根系本身在空間位置上吸收不到的養(yǎng)分，這為菌根真菌發(fā)揮其養(yǎng)分吸收功能提供了良好機會。實驗說明：密度可以作為一種調(diào)節(jié)手段來獲得最大數(shù)量的侵染根段、菌絲及孢子等繁殖體，而使植物的生長維持在較低水平，真菌生長處于較高水平。本實驗中，栽培密度為20株/5 L盆時，摩西球囊霉生長發(fā)育最好。

當(dāng)培養(yǎng)基里養(yǎng)分含量很低且施用低濃度的營養(yǎng)液時（10%、20% Hoagland’s營養(yǎng)液），一方面因為基質(zhì)中養(yǎng)分含量很少，菌根真菌吸收不到充足的養(yǎng)分，抑制了菌根的侵染及根外菌絲的生長發(fā)育，另一方面抑制了宿主植物的生長發(fā)育，因而提供給菌根真菌其生長發(fā)育所需的碳水化合物就會很少，抑制了共生體的建立和發(fā)展；隨著營養(yǎng)液強度的不斷增強（30%Hoagland’s營養(yǎng)液），可利用的養(yǎng)分逐漸增多，共生關(guān)系得到進一步發(fā)展，共生體雙方生長狀況都日趨改善，植物的生長狀況和真菌的生長發(fā)育都較好；但當(dāng)施加營養(yǎng)液的強度達到一定程度時，基質(zhì)中營養(yǎng)能充分滿足植物生長的需要，植物也變得十分健壯，不再需要菌根真菌提供養(yǎng)分，并在與真菌的競爭中處于優(yōu)勢地位，抑制了菌根真菌的生長發(fā)育。因此，宿主植物—菌根真菌之間共生關(guān)系是建立在養(yǎng)分的條件上，互惠共生關(guān)系的建立和發(fā)展與基質(zhì)中養(yǎng)分有著密切的關(guān)系。在本實驗中，向基質(zhì)中追施30%強度Hoagland’s 營養(yǎng)對菌根真菌的生長發(fā)育最有利。因此，在養(yǎng)分貧乏的基質(zhì)中進行菌劑培養(yǎng)時，必須追施適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)液。追施中等強度營養(yǎng)液（30%），最能促進真菌的生長發(fā)育。此時，宿主植物的生長雖然在一定程度上受到抑制，但其制造的碳水化合物完全能滿足菌根真菌生長發(fā)育的需要。

本實驗主要對摩西球囊霉的擴繁的宿主植株、培養(yǎng)基質(zhì)、栽培密度和營養(yǎng)液濃度四種條件進行了研究，確定了最佳的擴繁條件：宿主植物為高粱，培養(yǎng)基質(zhì)為3號培養(yǎng)基質(zhì)處理，即沙∶蛭石∶土的比例為2∶1∶1（體積比），栽培密度為20株/5 L盆，營養(yǎng)條件為追施用濃度為30%的Hoagland’s營養(yǎng)液。

[1] Maria J. Harrison. The arbuscular mycorrhizal symbiosis: an underground association[J]. Trend in plant science, 1997, 2(2):54-60.

[2] 杜永吉,孫鑫博,韓烈保. 內(nèi)生真菌感染對高羊茅光合和形態(tài)特性的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2010,31(1):41-47.

[3] 鄧小軍,周國英,劉君昂,等. 湖南油茶林叢枝菌根真菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)特征[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2011,31(10): 38-42.

[4] 趙 昕.叢枝菌根真菌對喜樹幼苗的接種效應(yīng)[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué), 2006.1-6.

[5] 李冬霞,張 猛,李 賀,等. 棗樹越冬期內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌研究[J]. 經(jīng)濟林研究,2010,28(1):86-89.

[6] Li Lin, Zhou Guo-ying, Liu Jun-ang,et al.The resource investigation and community structure characteristics of mycorrhizal fungi associated with Chinese fi r[J]. African Journal of Biotechnology, 2011,10(30):5719-5724.

[7] Phillips J M，Hayman D S. Improved procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J]. Trans Br Mycol Soc, 1970,55: 158-161

[8] Gerdemann J W, Nicolson T H. Spores of mycorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting[J].Trans Br Mycol Soc, 1963,46:235-244

[9] 陳 寧,王幼珊,李曉林,等.宿主植物栽培密度對AM真菌生長發(fā)育的影響[J].菌物系統(tǒng),2003,22(1): 88-94.

[10] Gaur A, Adholeya A. Effects of the particle size of soilless substrates upon AM fungus inoculum production[J]. Mycorrhiza,2000, 10: 43-48.

[11] 陳 寧,王幼珊,李曉林,等.營養(yǎng)液強度對AM真菌生長發(fā)育的影響[J].菌物系統(tǒng),2003,22 (22): 394-401.

[12] 李曉林,馮 固.叢枝菌根生態(tài)生理[M].北京:華文出版社,2001: 1-358.

[13] 陳 寧,王幼珊,楊延杰,等. 不同氮磷比例營養(yǎng)液對AM真菌生長發(fā)育的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,2007,13(1):143-147.

Effects of different culture conditions on growth of Glomus mosseae

ZHOU Guo-ying1, XU Hai-zhou1, YAN Jun1, ZHANG Lei1, WU Nan2, YAN Rui-kun2
(1. Key Lab. for Economic Forest Cultivation and Conservation of Chin Education Ministry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Forestry Bureau of Akesu, Akesu 843002, Xinjiang, China)

In order to obtain lots of inocula of endomycorrhiza from Chinese fir, the culture conditions of the fungi including host plants, culture substrate, planting density and nutrient solution concentration were studied. The results show that the best host plant was sorghum, the optimum culture medium was the culture medium No.3 (volume ratio was sand∶vermiculite∶soil =2∶1∶1), the optimum planting density was 20 plants / 5 L pot and the optimal nutrition condition was Hoagland’s solution with 30% concentration by means of topdressing concentration.

Glomus mosseae; arbuscular mycorrhizal fungi; propagation; growing development

S718.8

A

1673-923X(2014)10-0010-04

2013-10-24

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201004014）；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新項目（601000232）

周國英（1966-），女，湖北應(yīng)城人，教授，博士，主要從內(nèi)生菌根菌繁殖技術(shù)研究；E-mail：gyzhou2118@163.com

[本文編校：吳 彬]