譚益民，何苑皞，郭文平

(1. 中南林業(yè)科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南 長沙 410004；3.湖南省攸縣黃豐橋國有林場，湖南 株洲 412307)

基于分子技術的土壤微生物多樣性研究進展

譚益民1,2，何苑皞1,2，郭文平3

(1. 中南林業(yè)科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南 長沙 410004；3.湖南省攸縣黃豐橋國有林場，湖南 株洲 412307)

土壤微生物多樣性是維系土壤功能的重要因素，但是由于傳統(tǒng)的研究方法存在一定的局限性，使得過去研究其多樣性及群落結構成為一個難題。隨著分子生物學方法的應用，現(xiàn)在可以同時對可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物進行研究，解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法存在的問題。綜述了土壤微生物多樣性的分子生物學研究方法，對比了各方法的優(yōu)缺點，為選擇合適的方法進行土壤微生物多樣性研究提供了參考。

土壤微生物多樣性；分子生物學技術；研究進展

微生物作為分解者以及生產者，支撐著整個地球上的物質循環(huán)，使生命得以延續(xù)。土壤是微生物多樣性最為豐富的地方，人類僅僅研究了其中的很小一部分，絕大多數(shù)還處于未知狀態(tài)。土壤微生物多樣性研究對于開發(fā)微生物資源、治理環(huán)境污染、維持生態(tài)服務功能以及促進土壤可持續(xù)利用等方面具有十分重要的意義。人們對土壤微生物多樣性的研究最開始是利用平板計數(shù)法，但這種方法存在缺陷，如忽略了不可培養(yǎng)微生物，擴大了生長迅速、產孢量大的微生物數(shù)量等。因此人們又開發(fā)了許多其他的方法研究土壤微生物多樣性。近年來較為熱門的研究方法是以分子生物學為基礎的分子技術，如變性梯度凝膠電泳、末端限制性片段長度多態(tài)性分析等。隨著高通量測序技術的開發(fā)，其在土壤微生物多樣性領域的應用也日趨廣泛。本文就目前應用較多的幾種土壤微生物多樣性分子研究方法進行綜述，以期為土壤微生物多樣性研究提供參考。

1 土壤微生物多樣性概念

土壤微生物多樣性是指土壤微生物群落的種群和種間差異，它在保持土壤質量和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性等方面具重要意義。土壤微生物群落結構和組成的多樣性與均勻性不僅提高了土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和和諧性，同時也提高了對抗土壤微生態(tài)環(huán)境惡化的緩沖能力[1]。對土壤微生物多樣性的研究在開發(fā)超常生物資源、應對全球氣候變化、治理環(huán)境污染、維持生態(tài)服務功能以及促進土壤可持續(xù)利用等方面具有重要意義。目前對土壤微生物多樣性的研究主要集中在物種多樣性、遺傳多樣性、結構多樣性及功能多樣性這4個方面。

2 土壤微生物多樣性研究方法

隨著分子生物學技術的發(fā)展，一些新的方法被應用于土壤微生物多樣性研究，如：DNA重組，DNA-DNA雜交，變性梯度凝膠電泳(DGGE)，溫度梯度凝膠電泳（TGGE）等。

2.1 鳥嘌呤加胞嘧啶方法（G+C）

G+C方法是基于不同的微生物種類所含有的G+C豐度不相同，不同物種之間的差異在3%～5%之間這一原理[2]。G+C豐度測定的方法主要有密度梯度離心、熱變性法、不同DNA樣本雜交、變性DNA(單鏈DNA)復性動力曲線分析等。因為不同的類群可能含有相同的G+C豐度，因此這種方法的準確度不高。G+C豐度分析方法的優(yōu)點在于它不會受PCR誤差的影響，但它所需DNA多達 50 μg（見表 1）。

表 1 土壤微生物多樣性分子研究方法的優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of some molecular-based methods to study soil microbial diversity

Griff i ths等[3]應用該技術證明了被Cd污染的土壤中微生物群落分布與其他重金屬污染（Cu,Ni,Pb,Zn）土壤中微生物群落分布存在明顯差異。Nüsslein和Tiedje[4]運用G+C含量研究了夏威夷森林與牧場的不同植被下微生物多樣性的變化，揭示了植物對微生物群落組成具有重要的影響。

2.2 核酸重組和雜交

核酸重組和雜交技術是基于核酸分子堿基互補配對的原理，用特異性探針與待測樣品的DNA或RNA形成雜交分子的過程。這種技術通過測定DNA重組率[5]或DNA雜交動力相似度[6]來研究土壤微生物多樣性。用于微生物多樣性研究的探針主要有rRNA基因探針、抗性基因探針和編碼代謝酶基因探針等。

核酸重組和雜交已用來研究微生物群落遺傳多樣性[7]以及細菌分子生態(tài)學領域[8-10]。其中熒光原位雜交(Fluorescence in Situ Hybridization, FISH)方法應用較多，并已成功用于污染環(huán)境的土壤微生物多樣性研究[11]。但是也有實驗表明FISH方法對于土壤樣品的靈敏度較低[12]。核酸重組和雜交技術還可利用PCR擴增由mRNA反轉錄的cDNA研究活動微生物種群的瞬間動態(tài)。

2.3 DNA芯片

DNA芯片技術是指將數(shù)以萬計的DNA探針片段有序地固定于支持物表面上，然后與標記的樣品進行雜交。通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品的快速、平行、高效地檢測或診斷。由于該法把大量DNA探針固定在狹小的空間內，因此可以實現(xiàn)高速度、高通量、集約化和低成本的分析。最近，DNA雜交技術和DNA芯片技術相結合用來鑒定細菌[13]和微生物多樣性研究[14]。芯片既能通過所包含特殊目標基因（硝酸鹽還原酶、固氮酶或萘雙加氧酶基因）來提供微生物功能多樣性信息，也能發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的不同微生物種群。吳力游[15]在分離新的反硝化菌株、克隆亞硝酸還原酶基因的基礎上構建和測試了功能基因芯片(FGA)和群落染色體芯片(CGA)，建立了用這兩種芯片進行的雜交檢測的技術方法，并探索了它們在自然細菌群落分析上的應用。

反相基因組探針(Reverse sample genome probing, RSGP)是一種利用基因組DNA雜交來鑒定微生物的方法。RSGP的固定相是標準參照物。由于它與基因芯片的設計思路相同，只是密度比芯片小，所以RSGP也可認為是一種全基因組芯片。但使用RSGP和微陣列只能檢測出最為豐富的種群，如果用基因或者DNA片段取代基因組則可以解決這一問題，并且能確定群落中的功能基因[16]。RSGP已被用于分析原油以及污染土壤中的微生物群落[17-21]。Voordouw等[20]利用RSGP技術研究了加拿大西部原油產地的采出水和腐蝕取樣板中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)硝酸鹽還原細菌可能是金屬腐蝕的原因。

2.4 基于PCR的方法

PCR通過擴增16S rDNA、18S rDNA或ITS區(qū)域對微生物進行鑒定，目前已應用于研究微生物的多樣性、鑒定微生物種類以及系統(tǒng)發(fā)育關系[22-23]。利用PCR研究土壤微生物多樣性的方法主要有變性梯度凝膠電泳（DGGE）/溫度梯度凝膠電泳（TGGE），單鏈構象多態(tài)性（SSCP），限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）/擴增核糖體DNA限制性分析(ARDRA)等。

2.4.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）/溫度梯度凝膠電泳（TGGE）

變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）是研究微生物多樣性的兩種相似方法，其中TGGE是由DGGE衍生出的技術[24]。DGGE和TGGE是利用化學變性劑或溫度對DNA雙鏈分子進行處理，使得長度相同而序列不同的DNA片段分離[24]。根據(jù)電泳條帶的多寡和條帶的位置可以初步辨別出樣品中微生物的種類多少，粗略分析土壤樣品中微生物的多樣性。

DGGE和TGGE最初是用來研究DNA序列突變位點。Muyzer等[25]首次將DGGE應用到微生物遺傳多樣性研究上。Sachie等[26]研究了土壤中的Collimonas細菌對土壤真菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)Collimonas改變了土壤真菌群落但是對微生物生物量、纖維素分解率和植物生長無影響。Korkama等[27]對挪威云杉的外生菌根研究，結果證明外生菌根的多樣性及群落結構與寄主的生長率和大小有關。王奇贊等[28]采用DGGE法分析了天目山毛竹入侵闊葉林后土壤細菌群落結構的變化，結果表明入侵后土壤細菌多樣性無顯著變化。Cheung等[29]將TGGE與PCR相結合研究石油污染土壤中細菌多樣性時，發(fā)現(xiàn)石油重度污染土壤中分支桿菌比輕度污染土壤中少。DGGE/TGGE還被用來研究添加不同氮肥以及復合肥對根際細菌和真菌多樣性的影響。一些學者對分解代謝基因進行DGGE分析[30]獲得具有某一特定功能的特殊微生物多樣性的信息，如具有降解污染物功能的微生物。

2.4.2 單鏈構象多態(tài)性（SSCP）

單鏈構象多態(tài)性（Single-strand conformation polymorphism，SSCP）是另外一種對DNA擴增產物進行電泳分離分析的技術。由于單鏈DNA的構象差異使得它們在聚丙烯酰胺凝膠上的遷移率發(fā)生變化，因此可將不同的單鏈DNA分離開[31-32]。SSCP與DGGE具有相同的局限性，并且SSCP技術易受膠濃度和電泳溫度等條件的影響。

與DGGE/TGGE相似，SSCP最初是用來研究人類DNA的基因多態(tài)性[33]。Lee等[32]首次將SSCP技術應用到環(huán)境樣品的微生物群落多樣性分析中。Stach[34]利用PCR-SSCP技術研究土壤細菌多樣性。SSCP還被用于研究細菌群落的演替[35]，根際微生物群落[36-37]，厭氧發(fā)酵罐中細菌群落的變化[38]以及根際叢枝菌根真菌[39-40]。

2.4.3 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）/擴增核糖體DNA限制性分析（ARDRA）

限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法和擴增核糖體DNA限制性分析（Amplif i ed ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）方法也常用于微生物群落的分析，該方法依賴于DNA多態(tài)性。RFLP廣泛的應用于新物種的發(fā)現(xiàn)、微生物分類及鑒定、微生物遺傳多樣性的檢測和細菌群落結構研究[41]等。RFLP是一種十分有效的觀察微生物群落結構變化的方法[42]。張于光等利用RFLP方法對三江源地區(qū)不同的土壤中固氮微生物進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同植物類型的土壤中分別具有1-2個優(yōu)勢種[43]。Sandaa等[44]用RFLP方法研究了重金屬污染對土壤中可培養(yǎng)細菌和總細菌群落結構的影響，結果發(fā)現(xiàn)增加重金屬濃度會降低細菌群落的多樣性。Moffett等[45]利用ARDRA技術發(fā)現(xiàn)農田中Zn污染土壤中的細菌群落多樣性低于非污染土壤。

2.4.4 末端限制性片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP）

末端限制性片段長度多態(tài)性分析（Terminaterestriction length fragment polymorphism，T-RFLP）解決了RFLP的一些缺陷。它的基本原理與RFLP相同，不同之處是它使用了熒光染料標記的PCR引物（TET或6-FAM），在計算機程序自動分析時僅分析熒光標記的末端限制片段[46]。T-RFLP簡化了條帶，由于它的每一個條帶代表了一種分類單位或者核糖體基因型因此它提供了多樣性的信息，可以用來分析復雜群落[47]。

T-RFLP用來研究細菌群落在空間和時間上的變化[48]、細菌群落多樣性[49-50]。Tonin等[51]利用T-RFLP技術觀察和監(jiān)測種群以及評估在重金屬污染土壤中蘆葦堇菜（Viola calaminaria）根際的叢枝菌根真菌多樣性。張慧[52]利用T-RFLP研究了不同利用方式對紅壤坡地微生物多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)不同利用方式對紅壤坡地中微生物多樣性差異不顯著。有些學者認為利用T-RFLP研究微生物多樣性無法得到準確結果，如Dunbar等[53]所用的統(tǒng)計數(shù)據(jù)與T-RFLP所產生的DNA條帶相矛盾，并且四種不同類型土樣之間的多樣性并未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。

2.4.5 核糖體基因間隔區(qū)分析（RISA）/自動核糖體間隔區(qū)基因分析(ARISA)

核糖體基因間隔區(qū)分析（Ribosomal inter genic spacer analysis, RISA）和自動核糖體間隔區(qū)基因分析（Automated ribosomal intergenic spacer analysis,ARISA），都是DNA指紋技術。RISA和ARISA方法是用PCR擴增16S和23S核糖體亞基中的間隔區(qū)（ISR），然后電泳分離。由于ISR長度和序列的異質性使得ISR可以區(qū)分不同的細菌菌株以及親緣關系較近的種群[54]。RISA和ARISA的區(qū)別在于，RISA運用銀染顯色技術檢測序列多態(tài)性，而ARISA中上游引物用熒光標記并進行自動檢測。這兩種方法都能提供高重復性的細菌群落譜但是RISA需要大量的DNA并耗時，而銀染顯色技術敏感度不高，導致結果偏低。ARISA提高了該方法的靈敏度，降低了時耗，但是它仍然受PCR的限制。

目前RISA被用于土壤、植物根際、污染土壤以及接種后微生物多樣性對比。Ranjard等[55]用RISA研究了Hg對細菌群落結構的影響，發(fā)現(xiàn)在Hg污染脅迫下，耐Hg細菌增多并且整個細菌群落多樣性降低。陳穎等[56]利用熒光定量PCR和ARISA對非根際土壤和根際土壤中細菌和真菌的數(shù)量及群落結構進行了分析，研究結果表明不同植物物種可以通過根系影響土壤微生物群落組成。Hanene等[57]使用DGGE和ARISA方法對經過堆肥處理的農田土壤細菌群落和多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)不同堆肥處理的農田土壤中的細菌群落差異不明顯，同時他們得出結論DGGE進行細菌鑒定較準確，而ARISA更適用于優(yōu)勢群落分析。

2.5 高通量測序技術

高 通 量 測 序 技 術（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術（Nextgeneration sequencing technology）[58]或深度測序（Deep sequencing）[59]。高通量測序技術以能一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定為標志，這使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全面的分析成為可能。

高通量測序技術是相對于傳統(tǒng)的Sanger測序技術而言的。它與傳統(tǒng)的Sanger測序技術比較其優(yōu)點主要有一下幾個方面：①高通量測序利用芯片進行大規(guī)模平行測序，極大的節(jié)省了時間；②高通量測序具有定量功能，可反映樣品中DNA的豐度；③成本低廉，利用高通量測序技術進行人類基因組測序，耗資不到傳統(tǒng)Sanger測序法的1%[60]；④實現(xiàn)了邊合成邊測序，不需要等到測序完成后再上機。

2.5.1 高通量測序技術種類

高通量測序平臺的代表是羅氏公司（Roche）的 454測 序 儀（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD測序儀（ABI SOLiD sequencer）。高通量測序常用方法的優(yōu)缺點見表2。

（1）Genome Sequencer FLX （GS FLX） 測序系統(tǒng)

Genome Sequencer FLX （GS FLX）測序系統(tǒng)是羅氏診斷公司（Roche）開發(fā)的第二代測序平臺[61]。GS FLX測序是一種基于焦磷酸測序，并依靠生物發(fā)光進行DNA序列分析的新技術。GS FLX的原理簡單來說就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用，將PCR反應每一個堿基（dNTP）的延伸與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過記錄熒光信號的有無和強度，達到實時測定DNA序列的目的。GS FLX測序的流程大體是樣品處理、文庫制備、emPCR、反應板準備、上機測序。其核心是“一個片段=一個磁珠=一條讀長（one fragment=one bead=one read）”。也就是一個300～800 bp的DNA片段通過接頭（adaptor）與磁珠相連，即每個磁珠都只結合一條DNA片段，每個磁珠只產生一條讀長，并通過GS FLX系統(tǒng)進行分析。目前最新的GS FLX系統(tǒng)，一次運行可獲得一百多萬個讀長片段，高質量讀長達到400 bp，讀取超過5億個堿基信息。GS FLX測序系統(tǒng)的特點主要是可檢測的物質范圍較大、研究定量化以及實現(xiàn)了真正意義的高通量

表2 高通量測序各方法優(yōu)缺點Table 2 Advantages and disadvantages of different methods of high-throughput sequencing

（2）Illumina Genome Analyzer測序系統(tǒng)

Illumina公司的新一代測序儀Genome Analyzer最早由Solexa公司研發(fā)[62]。與GS FLX測序系統(tǒng)一樣，Illumina Genome Analyzer測序系統(tǒng)通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術對待測的模板DNA進行測序。不同是Illumina Genome Analyzer測序系統(tǒng)直接在dNTP上連接熒光基團和阻斷基團，通過“去阻斷—延伸—激發(fā)熒光—切割熒光基團—去阻斷”這樣一個循環(huán)的方法來依次讀取目的DNA上的堿基排列順序，而不是采用焦磷酸氧化熒光素的形式激發(fā)光信號。Illumina Genome Analyzer測序的大體流程是樣品處理、文庫制備、DNA片段在Cluster Station上成簇擴增、DNA簇在Genome Analyzer上邊合成邊測序、Paired-End Module、數(shù)據(jù)分析。

（3）ABI SOLiD sequencer測序系統(tǒng)

SOLiD全 稱 為supported oligo ligation detetion，它的獨特之處在于以四色熒光標記寡核苷酸的連續(xù)連接反應為基礎，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應，可對單拷貝DNA片段進行大規(guī)模擴增和高通量并行測序[63]。SOLiD測序既沒有DNA聚合酶合成過程中的錯配問題，又有SOLiD特有的“雙堿基編碼原理”提供的糾錯機制，這使得每個堿基可被判讀2次，系統(tǒng)準確性達99.99%，因此SOLiD的系統(tǒng)準確性大大領先于其他測序平臺。由于SOLiD乳化PCR過程中的微珠僅1 μm比GS FLX系統(tǒng)要小得多，因此每張玻片能容納更多的微珠，在同一系統(tǒng)中可具有更高的通量，單次運行能得到的最大數(shù)據(jù)量為300 Gb。ABI SOLiD sequencer測序的流程是文庫制備、乳液PCR/ 微珠富集、微珠沉積、連接測序、數(shù)據(jù)分析。

2.5.2 高通量測序系統(tǒng)的應用

高通量測序主要應用于De novo測序、基因深度測序、轉錄組深度測序、數(shù)字表達譜、染色質免疫沉淀、甲基化分析等[64]。高通量測序在各領域的微生物多樣性研究上也有應用[65-70]。其最開始是被應用于礦井中環(huán)境微生物多樣性的研究[71]。He[72]等人利用高通量測序技術對土壤微生物群落結構的研究表明隨著CO2升高群落結構產生顯著變化。Nacke[73]等人利用454測序技術對比了不同管理模式下德國森林和草地土壤細菌的群落結構，發(fā)現(xiàn)不同管理模式下土壤的細菌群落結構具有顯著差異，并且細菌群落結構受樹種和土壤pH的影響較大。Lihua Lu等[74]人對土豆連作環(huán)境下土壤真菌進行454測序，結果表明Sordariales和Hypocreales真菌受連作的影響較大。Chunhong Mao等[75]利用GS FLX技術研究土壤中苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）時，發(fā)現(xiàn)了20多種新的基因，并對這些基因的功能進行了分析。Hollister[76]等研究高鹽生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性時發(fā)現(xiàn)，在高鹽環(huán)境中微生物群落的多樣性仍然十分豐富，并且這些微生物與樣點的含水量、磷含量、有機碳總含量以及pH具有密切的關系。McLellan[77]等研究污水處理廠的微生物多樣性，結果表明污水微生物群落代表了一種獨特的群落結構，這種群落結構由人類排泄微生物以及環(huán)境中特定微生物的豐富度所決定。Mulan Dai等[78]人利用GS FLX技術研究不同土壤中叢枝菌根（AM）真菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)AM真菌具有自我恢復能力并且農田土壤中的AM真菌具有較高的豐富度。Stéphane等[79]利用 Illumina Genome Analyzer研究不同土層的微生物群落發(fā)現(xiàn)有機質層與礦質層的微生物有明顯差別，有機質層以細菌、脊索動物類、節(jié)肢動物以及子囊菌為主，而礦質層則以古生菌為主。

近年來國際上使用高通量測序研究土壤微生物多樣性及群落結構的研究者越來越多，發(fā)表的文章近300篇，其中大部分使用的是GS FLX系統(tǒng)。可見GS FLX系統(tǒng)以讀長大、時間短的優(yōu)勢成為目前探索土壤微生物多樣性的主流手段。而Illumina系統(tǒng)以其數(shù)據(jù)量大、成本低的特點也將成為今后土壤微生物多樣性研究的主要手段之一。

2.6 第三代測序技術

第三代測序技術是以單分子實時測序（single-molecule sequencing）和納米孔為標志的測序技術。第三代測序平臺主要有Helicos的Heliscope單分子測序儀、Pacif i c Bioscience的SMRT技術、Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測序技術和Life Technologies公司的FRET測序技術。第三代測序技術可解決第二代測序技術中PCR產生誤差以及讀長偏短的缺陷，同時它還可以直接測RNA序列以及甲基化的DNA序列。但是研究人員仍對該技術保持謹慎態(tài)度，主要是由于其錯誤率相對較高。目前第三代測序技術還主要用于醫(yī)學及相關領域的研究[80-82]。相信在不久的將來，第三代測序技術將會更加的成熟和完善并在土壤微生物領域得到應用。

3 展 望

土壤是微生物的大本營，要全面了解土壤微生物的群落結構以及他們的功能，尚需研究人員進一步探索不同環(huán)境下土壤微生物的多樣性，并交叉利用地質學、地球化學、分析化學、微生物學、分子生物學等多學科研究方法，只有綜合分析各項研究結果才能獲得土壤微生物群落結構和功能的全貌。分子技術克服了純培養(yǎng)的缺陷，豐富了我們對土壤微生物多樣性的認識。本文介紹了幾種常見的基于分子技術的土壤微生物多樣性研究方法。盡管這些技術可以獲得不可培養(yǎng)微生物的信息，但是每一種方法都僅能提供土壤微生物多樣性的一部分信息且他們自身都存在的缺陷，具有有一定的局限性。因此，發(fā)展新的技術研究土壤微生物多樣性極具挑戰(zhàn)性。目前我們并不知道一克土壤里到底存在多少微生物，也無法確定哪一種研究多樣性的方法更好。所以在研究土壤微生物多樣性時最好同時運用幾種方法，以獲得更多的信息。另外，目前對植物-微生物-土壤之間的相互作用研究較多，但是生物-化學-物理因素之間的相互作用我們卻知之甚少。如果一個新的技術能應用在該領域，我們則對微生物及其環(huán)境之間的關系會有一個更清晰的視野。

現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展使我們看到了揭開土壤微生物世界秘密的希望，同時也給我們提供了更廣闊的研究空間，現(xiàn)代分子生物技術與其他方法有機結合一定會大力推進土壤微生物多樣性研究。

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Research progress on soil microbial diversity based on molecular techniques

TAN Yi-min1,2, HE Yuan-hao1,2, GUO Wen-ping3
(1.Key Lab. for Non-wood Forest Cultivation and Conservation Supported by China Ministry of Education, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2.College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004, Hunan, China; 3. Hunan Huangfengqiao State-owned Forest Farm, Zhuzhou 412307, Hunan, China)

Microbial diversity within the soil is crucial to many functions but the traditional research methods had some limitations thus making the studies of the diversity and community structure to be diff i cult problems. With the application of molecular biological methods, it is now possible to detect both culture-able and un-culture-able microbial species and solve the problems of traditional methods. This review was focused on the molecular methods of soil microbial diversity and the advantages and disadvantages of these methods were compared, thus providing reference for appropriate method for microbial diversity research.

soil microbial diversity；molecular biotechnology；research progress

S718

A

1673-923X(2014)10-0001-09

2014-06-17

基金項目：林業(yè)公益性行業(yè)科研專項項目（201004014）；中南林業(yè)科技大學研究生科技創(chuàng)新基金資助項目（2010bx02）

譚益民（1962-），男，湖南湘潭人，教授，博士，博導，主要從事林業(yè)及旅游相關研究

何苑皞（1983-），女，湖南株洲人，博士研究生，主要從事森林微生物方面的研究；E-mail：heyuanhao218@gmail.com

[本文編校：吳 彬]