張宇麗+陸鴻略++++梁媛+++++畢靜+++++齊智偉++++++張淑君

[摘要] 目的 探討Dickkopf-1在喉咽癌組織中的表達(dá)及其與各臨床病理因素的關(guān)系。 方法 選擇2008年1月～2013年12月來(lái)源于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的30例喉咽癌組織和10例喉咽部正常黏膜組織，采用免疫組化SP法檢測(cè)中組織的Dickkopf-1的表達(dá)情況。 結(jié)果 ①Dickkopf-1在喉咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（36.67%），明顯低于喉咽部正常黏膜組織（80.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。②Dickkopf-1在喉咽癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分級(jí)、臨床分型、年齡和腫瘤大小無(wú)關(guān)（P > 0.05）。 結(jié)論 Dickkopf-1在喉咽癌組織中低表達(dá)可能與喉咽癌發(fā)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 喉咽癌；Dickkopf-1；免疫組化

[中圖分類(lèi)號(hào)] R739.65 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）12（a）-0019-04

喉咽癌亦稱(chēng)下咽癌，在國(guó)外其發(fā)病率約占每年新發(fā)頭頸部惡性腫瘤的5%，占全身惡性腫瘤的0.3%；在國(guó)內(nèi)其發(fā)病率約占每年新發(fā)頭頸部惡性腫瘤的1.4%，占全身惡性腫瘤的0.2%[1]。絕大多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌，男性多發(fā)，最常見(jiàn)部位是梨狀窩，女性的喉咽癌多發(fā)生在環(huán)后區(qū)。雖然喉咽癌發(fā)病率較其他頭頸部惡性腫瘤相對(duì)較低，但是由于其發(fā)生位置隱蔽，相對(duì)臨床癥狀出現(xiàn)較晚，患者就診時(shí)多已經(jīng)處于晚期。喉咽部有豐富的區(qū)域淋巴管，因此發(fā)現(xiàn)時(shí)往往伴有廣泛的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。喉咽癌生物學(xué)性質(zhì)惡劣，組織分化差，預(yù)后不良，喉咽癌已成為頭頸部惡性腫瘤中治療效果最差的腫瘤之一。盡管過(guò)去的幾十年里，喉咽癌的治療模式發(fā)生了重大變化，包括外科手術(shù)、放療和化療等多學(xué)科綜合治療變得極為重要。但總的5年生存率仍為25%～40%，基礎(chǔ)和臨床研究均在努力尋求新的治療方案來(lái)最大限度的提高生存率和降低喉咽癌的發(fā)病率。在目前已知的多種高發(fā)性惡性腫瘤中Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而來(lái)影響細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲。作為Wnt通路的抑制因子，Dickkopf-1（DKK-1）蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的Dickkopfs（DKKs）家族成員之一。大量研究發(fā)現(xiàn)，Dickkopf-1蛋白通過(guò)經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及非經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是當(dāng)今腫瘤分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)喉咽癌和喉咽部正常黏膜組織中Dickkopf-1的表達(dá)情況，并分析Dickkopf-1表達(dá)與各臨床病理因素之間關(guān)系，試圖為探討喉咽癌的發(fā)生、發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇2008年1月～2013年12月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）耳鼻咽喉科住院手術(shù)治療的30例喉咽癌患者手術(shù)切除的癌組織，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)所切除喉咽部腫瘤組織均為鱗狀細(xì)胞癌；患者均為男性，年齡為39～71歲，中位年齡56歲；術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（根據(jù)術(shù)后病理決定有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）24例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例；臨床分期采用1997年UICC TNM分類(lèi)分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期26例；高分化4例，中分化17例，低分化9例；臨床分型：梨狀窩癌18例，喉咽后壁癌12例；腫瘤直徑<3 cm 10例，≥3 cm 20例。另外選擇我院耳鼻咽喉科同期手術(shù)切除非喉咽癌患者的喉咽部正常黏膜組織10例作為對(duì)照，均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)；其中男9例，女1例；年齡31～65歲，中位年齡51歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，全部患者及家屬均知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 所取新鮮組織均在離體后立即放入10%中性甲醛中固定，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后制成5 μm厚組織切片備用。

1.2.2 主要試劑 由美國(guó)Santa Cruz公司提供的Dickkopf-1兔抗人多克隆抗體（sc-25516）；由北京四正柏生物科技有限公司提供的即用型DAB顯色試劑盒；SP試劑盒是由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供的即用型快捷免疫組化Max Vision試劑盒。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組織化學(xué)（SP）法，按照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)步驟：石蠟標(biāo)本常規(guī)5 μm連續(xù)切片，電熱恒溫箱80℃烤箱50 min，切片浸入二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度酒精水化，3%H2O2室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS浸泡5 min。微波爐加熱0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）至沸騰后將上述組織切片放入，抗原熱修復(fù)15 min，室溫冷卻40 min，PBS沖洗，滴加一抗，4℃冰箱過(guò)夜。PBS沖洗，滴加二抗，濕室內(nèi)孵育15 min。PBS沖洗，DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗，終止顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂膠封片，鏡檢。一抗稀釋比例為1∶100，以PBS代替一抗做陰性對(duì)照，以美國(guó)Santa Cruz公司提供的陽(yáng)性對(duì)照片做陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 判定結(jié)果 采用Volm雙評(píng)分法分別由3名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生在光鏡200倍下隨機(jī)選擇5個(gè)染色均勻視野進(jìn)行觀察，根據(jù)其評(píng)分的平均值判定結(jié)果：①按染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)顯色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②按陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率26%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率>50%為3分。最后將以上兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0～2分判定為“+”，3～4分判定為“++”，5～6分判定為“+++”?！?”為陰性表達(dá)，“++”和“+++”為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉咽癌組織及喉咽部正常黏膜組織中的Dickkopf-1蛋白的表達(dá)情況

Dickkopf-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色著色，陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞漿。Dickkopf-1在喉咽癌組織及正常喉咽部黏膜組織中均有表達(dá)，在喉咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于喉咽部正常黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 4.0434，P = 0.0443）。見(jiàn)圖1～2（封三）、表1。

2.2 喉咽癌臨床病理因素與Dickkopf-1蛋白表達(dá)的關(guān)系

Dickkopf-1蛋白在喉癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分級(jí)、臨床分型、腫瘤大小、吸煙量和年齡無(wú)關(guān)（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

Dickkopf-1為一種分泌型糖蛋白，Glinka等[2]于1998年在兩棲動(dòng)物非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)Dickkopf-1蛋白，是一種有力的Wnt信號(hào)通路拮抗劑，在胚胎頭頸形成期起重要作用。有學(xué)者在2000年發(fā)現(xiàn)，人Dickkopf-1基因位于10 號(hào)染色體10q11上。進(jìn)一步研究表明，β-catenin可調(diào)控其下游靶基因Dickkopf-1的作用，可能與Wnt信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)[3-4]。學(xué)者首次在人HEK239T 細(xì)胞中提取出Dickkopf-1，其分子量約為45 kU，隨著研究的不斷深入，更多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)從不同細(xì)胞中提取出的Dickkopf-1的分子量存在一定差異，35～45 kU不等[5-6]。Dickkopf-1蛋白擁有255～350個(gè)氨基酸殘基，通過(guò)cDNA編碼，靠近N端的Cys-1和靠近C端的Cys-2為兩個(gè)富含半胱氨酸的保守區(qū)域?？拷麮端的Cys-2是由10個(gè)半胱氨酸殘基構(gòu)成，在全部Dickkopfs家族成員Dickkopf-1～4中均呈高度保守狀態(tài)，在抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路過(guò)程中發(fā)揮決定性作用[7-8]。目前已知的Dickkopf-1受體有兩種：一種是低密度脂蛋白受體（LRP-5/6）；另一種是kremen蛋白受體。Dickkopf-1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LRP5/6蛋白受體直接抑制Wnt蛋白的活性，或通過(guò)Kremen蛋白受體間接與LRP5/6蛋白受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面LRP5/6蛋白受體水平明顯下降，從而抑制Wnt蛋白向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)，阻斷Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑[9]。Dickkopf-1蛋白在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況及意義各有不同，但在喉咽癌中是否表達(dá)及其意義，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)在喉咽癌組織中Dickkopf-1的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于喉咽部正常黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率Dickkopf-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Dickkopf-1蛋白表達(dá)可能與喉咽癌的發(fā)生有關(guān)。這與很多學(xué)者的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是一致的，在多種惡性腫瘤組織中Dickkopf-1表達(dá)下調(diào)。崔素芬等[10]對(duì)36例宮頸癌組織標(biāo)本進(jìn)行Dickkopf-1陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示Dickkopf-1陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)明顯下調(diào)。伊諾等[11]檢測(cè)并比較Dickkopf-1在子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜癌組織中Dickkopf-1表達(dá)明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織。Mikheev等[12]研究發(fā)現(xiàn)，外源性注入Dickkopf-1后宮頸癌Hela 細(xì)胞池中的Hela 細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，而大劑量外源性注入Dickkopf-1有助于誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。有異常甲基化出現(xiàn)于Hela細(xì)胞內(nèi)的Dickkopf-1基因啟動(dòng)子區(qū)，可能與組蛋白降解有關(guān)[13]。Licchesi等[14]研究表明，在進(jìn)展中的肺腺癌中，Dickkopf-1啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化導(dǎo)致Dickkopf-1的低表達(dá)。仵正等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Dickkopf-1在胰腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，MSP分析發(fā)現(xiàn)約40%的Dickkopf-1在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)為甲基化。然而應(yīng)用去甲基化調(diào)節(jié)劑處理后Dickkopf-1基因的表達(dá)明顯上調(diào)。Yamaguchi等[16]及陳恒君等[17]分別通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Dickkopf-1抑制惡性黑色素瘤的生長(zhǎng)及其功能是通過(guò)抑制β-catenin來(lái)發(fā)揮作用，對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖及功能調(diào)控有著至關(guān)重要的作用。喬玲等[18]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞BMMS-03通過(guò)釋放Dickkopf-1，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)途徑，對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的惡性表型具有明顯抑制作用。

Kenji等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Dickkopf-1在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）中的表達(dá)明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示Dickkopf-1參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。侯安麗等[20]研究結(jié)果顯示宮頸鱗狀細(xì)胞癌分化程度越差，Dickkopf-1的表達(dá)也越低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，臨床分期越晚，Dickkopf-1的表達(dá)也明顯降低。Naoki等[21]研究結(jié)果表明，Dickkopf-1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）組織中表達(dá)下調(diào)，作為抑癌基因在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中充當(dāng)重要角色，與腫瘤預(yù)后相關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，在喉咽癌組織中Dickkopf-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分型、臨床分型、腫瘤大小、吸煙量和年齡無(wú)關(guān)?？紤]與本實(shí)驗(yàn)樣本量較小有關(guān)，增大樣本量后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，預(yù)期發(fā)現(xiàn)其在喉咽癌腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移中的作用。

Dickkopf-1作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制分子，與喉咽癌發(fā)生有關(guān)，預(yù)期成為喉咽癌治療及預(yù)防的新靶點(diǎn)，具體作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2014-08-16 本文編輯：蘇 暢）

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（收稿日期：2014-08-16 本文編輯：蘇 暢）

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（收稿日期：2014-08-16 本文編輯：蘇 暢）