何瑋，郭琳微，樊鵬輝，郭斌，傅艷萍，尉亞輝

（陜西省生物技術重點實驗室，西北大學生命科學學院，西北大學西部草原毒害草研究中心，陜西 西安710069）

黃花棘豆（Oxytropisochrocephala），俗稱馬絆腸、團巴草等，為豆科棘豆屬多年生草本植物。黃花棘豆主要分布在我國甘肅、寧夏、青海、四川和西藏等地區(qū)，是我國西部草場的主要毒害草之一，其含有神經毒素苦馬豆素（swainsonine），牲畜誤食后易引起病癥甚至死亡，對畜牧業(yè)造成了非常大的損失［1－2］。隨著我國草原放牧強度逐年增加，加之全球氣候變化劇烈，黃花棘豆在我國天然草原不斷蔓延［3］，但以滅除為主的傳統(tǒng)防控方法容易對草場的生態(tài)環(huán)境造成進一步破壞。近年來，對黃花棘豆等毒草的防控逐漸轉為生態(tài)控制。因此，為了對其進行有效防控，明確其在草場的競爭優(yōu)勢機制顯得尤為重要。

前人研究表明，黃花棘豆根系較發(fā)達，種子繁殖數(shù)量多，抗逆性強，容易在草原上形成優(yōu)勢種群，抑制其他植物的生長，降低草原的生物多樣性，引起草原退化，破壞草原的生態(tài)平衡［4］。化感作用是植物在生長過程中獲得競爭優(yōu)勢的一種重要手段，而關于黃花棘豆的化感物質和釋放途徑、作用機理已有報道［3－5］。這些工作大多是通過人工控制的黃花棘豆水浸提液處理其他植株來完成的，為黃花棘豆的化感作用研究奠定了基礎。但同時，黃花棘豆在自然狀態(tài)下是否對其伴生植物具有顯著的化感作用還需要進一步研究。自然環(huán)境下，植物殘株在土壤中的自然腐解過程中可能會對其他植物造成影響，因此在實驗室或野外環(huán)境下模擬植物腐解過程，是一種研究植物化感作用的有效方法。例如，周淑清等［6］研究發(fā)現(xiàn)，狼毒（Stellerachamaejasme）的地上部分和地下部分腐解對苜蓿（Medicagosativa）的株高、干重、葉面積、葉綠素含量均產生一定的抑制作用。黃花棘豆在土壤中的自然腐解過程中是否對其他植物的生長表現(xiàn)出化感作用？其是否通過與根系細菌群落之間的相互作用間接影響其他植物的生長？以上問題還研究較少。因此，有必要對相關問題進行研究和探討。相關研究可以為更好地尋找黃花棘豆的有效防控提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物與土壤材料采集

黃花棘豆全株材料采于2012年8月，采樣地點為青海省祁連縣（N 37°57′13.62″，E 100°18′51.12″，海拔3780m）。采集后的植物材料保存于4℃條件下，于48h內帶回實驗室以備后續(xù)研究；植物材料粉碎后過40目篩（0.425mm），保存在4℃冰箱備用。實驗選擇紫花苜蓿和黑麥草（Loliumperenne）作為化感作用目標材料，種子同年購于江蘇圣源種業(yè)有限公司。

黃花棘豆根系與非根系土壤樣品采集于2013年6月，采樣地點為寧夏自治州海原縣（N 36°26′49.80″，E 105°37′26.46″，海拔2656m）。在0.5km2植被覆蓋均一的范圍內，根據是否有黃花棘豆生長隨機選取5點；黃花棘豆根系土壤為實驗組（實驗編號2.1），并以5m范圍內無黃花棘豆生長的非根系土壤作為對照組（實驗編號2.2）。用鋼土鉆采集土樣，采樣深度為0～25cm，取得土壤剝去表層2cm以去除表層土干擾。將實驗組和對照組各5個新鮮土樣混勻后，分別裝于2個牛皮紙袋中，保存于干冰冷凍箱內，于24h內帶回實驗室后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 黃花棘豆在土壤中的腐解對兩種牧草生長的影響

2012年8月，在植物材料采集后1周內，將含有1%，2%，3%，4%和5%黃花棘豆全株粉碎物的營養(yǎng)土（w／w）裝入培養(yǎng)盆中，每盆土壤總重為200g，同時將不含有黃花棘豆粉碎物的等重營養(yǎng)土組作為對照。紫花苜蓿和黑麥草種子在培養(yǎng)皿上發(fā)芽后，隨機挑選發(fā)芽和生長情況較好、形態(tài)一致的2種牧草種子各180粒，播種于5個不同濃度處理組和1個對照組中（共6組），每組3盆作為3組重復，每盆10粒種子。植物材料培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)條件為：光強3000lx，光照14h，25℃；黑暗10h，18℃，植物生長所需澆水量參照周淑清等［7］。培養(yǎng)10d后，每盆選生長最優(yōu)的定苗3株。60d后，按照周淑清等［7］的方法測定各組紫花苜蓿和黑麥草株高、生物量（干重）和葉綠素含量。

1.3 黃花棘豆根系微生物群落成分及組成比例分析

2013年6月，在土壤采集后1周內按照李靖宇等［8］的方法對黃花棘豆根系土和非根系土總DNA進行提取。提取的土壤總DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠檢測完整性，并使用BioSpec－nano分光光度計（島津，日本）測定DNA的濃度及純度。以土壤總DNA為模板，選擇16SrDNA V3區(qū)序列進行PCR擴增，擴增用正反向引物合成于上海生工公司，序列為341－F：TTACCGCGGCTGCTGGCAC，534－R：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG。25μL PCR反應體系為：DNA模板75ng，正反引物（10μmol／L）各1.5μL，Hot Start Taq PCR Master Mix（Takara，日本）12.5μL，補雙蒸水至25μL。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)數(shù)35；72℃延伸7min；12℃保存［9］。

擴增產物（黃花棘豆根系土，實驗編號2.1；非根系土，實驗編號2.2）于Illunima2000?平臺進行MiSeq雙端測序，以Green Genes為參考序列數(shù)據庫，使用Uclust軟件根據序列相似性進行聚類；參考Green Genes數(shù)據庫用軟件RDP classifier進行物種注釋，并統(tǒng)計在不同分類水平上土壤中的細菌物種構成；OTUs Heatmap和Venn圖使用python腳本語言和 R語言編寫腳本完成；使用 EstimateS（Version 9，http：／／purl.oclc.org／estimates）對根系土和非根系土組內微生物多樣性指數(shù)進行計算；使用Excel 2010軟件制作物種組成的柱狀圖和餅狀圖。

1.4 數(shù)據處理與分析

實驗1.2中所有測定指標均為3次生物學重復，用SPSS 19.0分析軟件新復極差檢驗法（SSR法）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 黃花棘豆在土壤中的腐解對兩種牧草生長的影響

黃花棘豆在土壤腐解過程中對紫花苜蓿生長的影響和其在土壤中的含量相關（表1）。當黃花棘豆含量達到5%時，對紫花苜蓿的株高產生極顯著抑制作用（P＜0.01），而其他處理之間均無顯著性差異；生物量方面，低含量的（≤3%）黃花棘豆處理對紫花苜蓿的生物量無顯著性影響，但當黃花棘豆含量達到4%時，開始顯示出極顯著的抑制作用（P＜0.01）；紫花苜蓿中葉綠素（a＋b）在黃花棘豆含量2%時開始降低，和對照差異極顯著（P＜0.01），表明黃花棘豆的化感抑制作用強烈，并隨著土壤中黃花棘豆含量的增加而下降。

表1 黃花棘豆在土壤中的腐解對紫花苜蓿生長的影響Table 1 Effect of O.ochrocephalaon the seedling growth of M.sativaduring the decay process in soil

黃花棘豆在土壤中的腐解對黑麥草生長的影響同樣呈現(xiàn)出和其在土壤中含量相關的趨勢（表2）。黃花棘豆對黑麥草的株高沒有顯著的抑制作用，且當其含量在1%～3%時，對黑麥草的株高具有促進作用。生物量方面，4%～5%含量處理組對黑麥草顯示出極顯著的抑制作用（P＜0.01），黑麥草平均干重為0.1240和0.1270g，比對照組下降約20%。葉綠素（a＋b）含量的差異分析表明，各處理組間差異較大；4%～5%處理組降低了葉綠素濃度（P＜0.01），而低含量處理組對葉綠素濃度無影響，甚至具有促進作用。當土壤中黃花棘豆含量在2%時，黑麥草的株高和干重均達到最高，分別為50.17cm和0.1656g／株，而土壤中黃花棘豆含量在1%時，黑麥草的葉綠素（a＋b）濃度最高，為0.9590mg／g。

表2 黃花棘豆在土壤中的腐解對黑麥草生長的影響Table 2 Effect of O.ochrocephalaon the seedling growth of L.perenne during the decay process in soil

2.2 黃花棘豆生長土壤微生物群落差異

2.2.1 測序質量評估，數(shù)據回歸及OTUs統(tǒng)計

黃花棘豆16SrDNA V3區(qū)PCR擴增產物為194 bp，擴增產物條帶單一，滿足后續(xù)測序要求。對根系土（實驗組編號：2.1）與非根系土（對照組，編號：2.2）樣品進行數(shù)據質量檢測；單堿基平均質量得分在30以上，測序質量較好；序列質量得分為37，表明質量很高，低質量堿基占比較少。單土樣測序深度分析（Rarefaction Curve）表明測序深度已覆蓋土樣中的所有物種，測序的序列數(shù)目也滿足分析要求。

表3 每個土樣中序列及OTU的數(shù)量Table 3 Number of sequence and OTU（Operational Taxonomic Units）of each soil sample

圖1 根系土和非根系土樣OTUs維恩圖Fig.1 OTUs Venn diagram of two soil samples

用Uclust軟件根據序列相似性進行聚類，得到序 列 聚 類 單 元（Operational Taxonomic Units，OTU）；選擇97%作為序列相似性閾值，并對每個土樣的序列數(shù)進行統(tǒng)計。根系土的聚類單元數(shù)比非根系土對照組少779個（表3），表明對照組土壤中細菌的多樣性可能更高。兩個土樣包含的OTUs的交叉情況用Venntu展示（圖1），并存的OTUs有3669個，單獨存在于根系土的OTUs有1081個，而非根系土有1860個特異性OTUs，和根系土相比略高。

2.2.2 土壤細菌群落組成與結構分析 土壤細菌群落比對分析顯示，黃花棘豆根系土（2.1）和非根系土（2.2）在門級別上的細菌主要為7個門（圖2），這些細菌占總檢測細菌群落92%以上。黃花棘豆根系和非根系土細菌組成存在較大的差異——不同門級別下的細菌占總細菌群落的比例不同，這主要體現(xiàn)在根系土中屬于變形菌門（Proteobacteria），疣微菌門（Verrucomicrobia），芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），厚壁菌門（Firmicutes）的細菌豐度比非根系土相應的門的細菌豐度分別提高16.53%，1.45%，2.32%，1.76%；與之對應的是放線菌門（Actinobacteria），酸桿菌門（Acidobacteria），硝化螺旋菌門（Nitrospirae），細菌在根系土組中的豐度比非根系土組低15.43%，4.67%，0.44%。未知菌門在根系土和非根系土組中各占4.07%和6.22%，表明這些細菌不能在門級別被歸類。同樣，綱級別的根系土和非根系土在細菌菌群的類型上沒有太大的差異，但是每個綱級別下菌群的比例存在著較大的差異（數(shù)據未展示）。

圖2 黃花棘豆土壤微生物群落結構圖（門級）Fig.2 The soil microbial community structure（Phylum level）

圖3 土壤微生物群落結構圖（目級）Fig.3 The soil microbial community structure（Order level）

目級與科級結合（圖3，圖4）的微生物細菌群落分類對比表明，黃花棘豆根系土壤與非根系土壤中細菌種類的差異在這兩個分類級別上主要表現(xiàn)為酸桿菌門（Acidobacteria）iii 1－15目，變形菌門伯克氏菌目（Burkholde－riales），變形菌門黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae），變形菌互營桿菌科（Syntrophobacteraceae），放線菌門Gaiellaceae（科），厚壁菌門芽孢桿菌科（Bacillaceae）等。這些目和科的細菌在根系土和非根系土中所占比例相差很大（圖3，圖4）。由于土壤細菌微生物多樣性非常高，數(shù)據庫比對結果顯示在科級和屬級下還存在著很多不能被分類的細菌，自科級開始，有很多的細菌無法再被細分，圖4結果統(tǒng)計顯示科級和屬級下不能被辨別（未知）的微生物分別達到了60%和90%左右，此外，從兩組樣品的OTU聚類圖可以看出，大部分OTU在根系土和非根系土細菌群落的豐度在綱（class）級別以下差異較小，僅有少部分OTU的豐度差異在4～8倍（22～23）以上。

圖4 土壤微生物群落OTUs heat map分類聚類圖Fig.4 Heat map of bacterial OTUs from the two edaphic samples

2.2.3 物種多樣性指數(shù)分析 一系列的物種α多樣性指數(shù)可以反映各群落內微生物多樣性的豐富度［10］。黃花棘豆根際土及非根系土的細菌群落多樣性分析表明，兩者在細菌群落組成上的多樣性指數(shù)差異不大，根際土細菌群落豐度較非根系土略低；但非根系土的細菌種類更多，其種間遺傳距離和也遠遠大于根系土（表4）。

表4 物種多樣性指數(shù)Table 4 Species diversity index

3 討論

自然界中植物化感作用的例子已多見報道，如黑胡桃樹（Juglansnigra），其釋放的水溶性羥基胡桃苷雖然無毒，但經水解和氧化后生成的次生代謝產物胡桃醌對共生植物具有強烈的毒性，使得草本植物不能夠在黑胡桃樹下存活［11－12］；鼠尾草（Salvialeucophylla）中含有的揮發(fā)性萜類物質是造成其周圍植物死亡的主要原因［13］；歐石楠（Heathwort）和葒草（Polygnlumorientale）的根系分泌物對多種作物的生長具有強烈的抑制作用［14］。目前，使用供體植物的水浸提液、土壤腐解液、淋溶和根系分泌物質來研究植物的化感作用是本領域研究的主要手段，但是如何能夠盡可能在模擬自然環(huán)境下研究植物間的生長關系，是揭示化感作用更加合理的方式。本文的實驗結果表明，黃花棘豆在土壤腐解過程中，對紫花苜蓿和黑麥草兩種牧草的生長均表現(xiàn)出高濃度的抑制特性，對紫花苜蓿的抑制作用更為明顯；而黑麥草對黃花棘豆的化感作用較不敏感，說明黑麥草對黃花棘豆的化感作用具有一定的抗性。同時，低濃度黃花棘豆處理兩種牧草未表現(xiàn)出顯著的抑制效應，甚至有部分促進作用。天然草原群落中黃花棘豆是否對群落中的其他植物起化感作用，可能取決于其植株密度；在低密度的情況下，黃花棘豆的蔓延可能與其他因素相關。

植物化感的方式可以是直接的，如通過根系分泌的化合物來抑制其他植物生長，也可能是間接的，即通過根系與土壤微生物環(huán)境進行物質與信號的交流對其他植物起到抑制作用［15］。微生物群落在植物與土壤間起著非常重要的作用，植物分泌的化感物質既可以通過改變微生物群落實現(xiàn)利己性，也可以通過對病原菌種類和數(shù)量的調控，降低病原菌浸染對植物所造成的負調控作用，保證植物的正常生長［16］。在生態(tài)系統(tǒng)中，逃離天敵假說（enemy release）認為，土壤微生物環(huán)境在與本地植物長期的共同進化過程中，多數(shù)情況下形成對本地植物穩(wěn)定的負反饋作用，以此制約某種特定的本地植物生長，達到物種多樣性平衡；當某物種脫離原生地的土壤微生物群落時，由于脫離了原生地土壤微生物環(huán)境的負反饋，容易形成優(yōu)勢種［17］。本研究結果表明，黃花棘豆根系土和非根系土細菌微生物群落種類相似，但部分分類單元的微生物所占比例差異較大，這些差異可能與黃花棘豆的擴散有著密切的關系。例如變形菌門（Proteobacteria）在黃花棘豆根系土中的豐度比非根系土高16.53%，門水平下進一步細分后顯示變形菌伯克氏菌目（Burkholderiales）和海洋螺菌目（Oceanospirillales）的豐度都在根系土中較高。這和已報道的在玉米（Zeamays）、橡樹（Quercuspalustris）和擬南芥（Arabidopsisthaliana）中的結果相似［18］。變形菌門細菌被廣泛認為可以高效同化土壤中植物根系分泌的不同類型的含碳化合物，為自身的快速生長提供碳源，因此變形菌門細菌通常在細菌群落中體現(xiàn)出一種“機會主義”生長的趨勢。變形菌門細菌在黃花棘豆根系土細菌群落中豐度較高，表明這類細菌可以利用黃花棘豆根系土中的碳源并和黃花棘豆形成一定的共生，但這種共生作用與同一植物群落的其他植物表現(xiàn)較弱；通過這種共生作用，黃花棘豆也可能會從中獲益以促進自身的生長。同時，Mendes等［19］在對甜菜（Betavulgaris）的研究中發(fā)現(xiàn)，在不同土壤中生長的甜菜，當土壤微生物中變形菌門中伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae），放線菌乳桿菌科（Lactobacillaceae）的相對比例增加到一定程度的時候，病原菌立枯絲核菌所引起的作物枯死病就能得到有效控制；已有研究證實，假單胞科菌類可以通過釋放抗真菌類抗生素的方式，抑制土壤中一些如尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）、禾頂囊殼菌（Gaeumannomycesgraminis）等病原菌對植物的侵害，并誘導植物提高自身對病原菌的抗性［20－21］。黃花棘豆根系土中的伯克氏菌科、黃色單胞菌科和假單胞菌科豐度均高于非根系土，當多種菌門的微生物數(shù)量達到一個相對豐度時，而非某一菌類及其數(shù)量的變化，會形成抑制病原菌的土壤微生物群落，增強植物抗性［22］。

黃花棘豆非根系土細菌群落中放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）細菌豐度比根系土組中分別高15.43%和4.67%。放線菌門細菌是廣泛存在于土壤中的一大類細菌，其中放線菌綱（Actinobacteria）放線菌目（Actinomycetales）中的一些細菌會在土壤中起抑制植物病原菌和促進植物生長的作用，如部分鏈霉菌屬（Streptomyces）和小單胞菌屬（Micromonospora）細菌［23］。但雖然黃花棘豆非根系土中放線菌門細菌的豐度高于根系土組，但是此差異主要是由油菌綱（Thermoleophila）Gaiellales目細菌造成的。由于目前Gaiellales目細菌的功能還未知，因此此類型細菌的豐度變化會對黃花棘豆或其伴生種的生長造成怎樣的影響還未知。酸桿菌門細菌是研究較晚的一類細菌，它的一個顯著特點是生長在營養(yǎng)成分較為缺乏的土壤中，生長緩慢，因此較難分離和培養(yǎng)，且其功能還不是非常清楚，但是可以作為較貧瘠土壤環(huán)境的指示［24］，這反映出在同一群落中，和其伴生種相比，黃花棘豆生長的土壤養(yǎng)分情況可能更好，通過養(yǎng)分的富集來改善自身生長的土壤條件。由于土壤細菌群落結構多樣，種類復雜，除上述細菌之外，其他一些類別的細菌在科屬水平以下不能被細分。黃花棘豆根系土和非根系土中細菌結構的差異，可能是黃花棘豆獲得生長優(yōu)勢的重要原因。同時，黃花棘豆極有可能在生長或者腐解過程中對土壤微生物群落有一定的影響，但黃花棘豆的腐解對土壤微生物群落結構有怎樣的影響還有待進一步的深入研究。

4 結論

綜上所述，本文通過黃花棘豆在土壤中的腐解過程研究了其在自然狀態(tài)下的化感作用，結果表明高濃度的黃花棘豆對紫花苜蓿和黑麥草的生長具有顯著性的抑制作用，其對兩種牧草光合作用的破壞作用有待進一步研究［25］。通過16SrDNA測序，比較了黃花棘豆根系與非根系土細菌群落組成，結果顯示兩組細菌群落在部分分類單元的比例上有較大差異。黃花棘豆可能通過化感物質的釋放，改變土壤中不同種類細菌的比例及某類基因的特異性表達，建立利己性的微生物群落，同時抑制病原菌的侵害，最終促進自身生長，并抑制其他共生種。因此，黃花棘豆在部分草原的大量滋生可能與其特定的土壤微生物環(huán)境更有利于其生長有關。本研究可為黃花棘豆的有效防控提供一定的理論依據。

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