宗迎迎，徐 浩，許 偉，顧玉明，祖茂衡，萬豪光，吳 康

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院介入科，江蘇徐州221002)

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。由于起病隱襲，早期無特異性臨床表現(xiàn)和體征，大多數(shù)患者在確診時(shí)已屬晚期，所以早期發(fā)現(xiàn)、早期治療對(duì)提高患者生存率至關(guān)重要。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是目前唯一廣泛應(yīng)用于檢測(cè)PHC的血清標(biāo)志物，但敏感性(40% ～65%)和特異性(76% ～96%)均不甚令人滿意[1]。有研究發(fā)現(xiàn) Dickkopf同源物1(Dickkopf-1，DKK1)、高爾基體糖蛋白73(Golgi protein 73，GP73)[2-3]是值得期待的PHC血清標(biāo)志物。我們通過檢測(cè)健康人及不同肝病患者DKK1、GP73和AFP表達(dá)水平，建立PHC診斷的統(tǒng)計(jì)模型即綜合預(yù)測(cè)模型，應(yīng)用Logistic回歸和受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析DKK1、GP73、AFP及其聯(lián)合預(yù)測(cè)因子在PHC診斷中的臨床意義。

材料和方法

一、研究對(duì)象

2013年8月至2014年7月在徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院共收集研究對(duì)象231例，男189例，女42例，年齡 20～79歲，其中健康對(duì)照(healthy control，HC)者50 名、慢性肝炎(chronic hepatitis，CH)患者50例、慢性肝硬化(liver cirrhosis，LC)患者50例、PHC患者81例。各組研究對(duì)象在年齡、性別上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HC人群來源于徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢正常并排除其他慢性疾病的健康者。肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)和腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及中華人民共和國衛(wèi)生部2011年制定的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中的肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。

二、試劑和方法

DKK1、GP73測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，試劑分別由美國Raybiotech公司和北京熱景生物技術(shù)有限公司提供，檢測(cè)均嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。血清AFP測(cè)定采用電化學(xué)發(fā)光免疫法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)，參考區(qū)間為0～20 ng/mL。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。GP73呈正態(tài)分布，用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法或Tamhane's T2法;DKK1、AFP呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25～P75)]表示，多組之間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。篩選合適的自變量(納入標(biāo)準(zhǔn)α ＜0.05，排除標(biāo)準(zhǔn)α ＞0.1)建立肝癌診斷的Logistic回歸模型，回歸模型的擬合度采用似然比檢驗(yàn)，回歸參數(shù)估計(jì)值采用Wald檢驗(yàn)。根據(jù)ROC曲線及曲線下面積(the area under Roc curve，AUC)評(píng)估聯(lián)合及單項(xiàng)診斷的敏感性和特異性，Z檢驗(yàn)比較AUC的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

一、各組血清DKK1、GP73和AFP檢測(cè)結(jié)果比較

PHC組DKK1、GP73和AFP水平均顯著高于CH組、LC組和HC組(P＜0.05)。見表1。

二、血清DKK1、GP73和AFP的ROC曲線分析

采用ROC曲線對(duì) GP73、DKK1和AFP的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，見圖1。ROC曲線確定GP73、DKK1和AFP診斷PHC的臨界值分別為192.97、4.48 和 20.00 ng/mL。GP73 的敏感性為 77.8%，特異性為86.7%;DKK1的敏感性為71.6%，特異性為90.0%;AFP的敏感性為58.0%，特異性為78.7%。GP73、DKK1、AFP 聯(lián)合檢測(cè)對(duì) PHC 的診斷敏感性為 95.1%，特異性為 72.0%。GP73 診斷PHC 的敏感性明顯優(yōu)于 AFP(χ2=7.25，P ＜0.01)，特異性兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.35，P=0.07);DKK1 診斷 PHC 的特異性優(yōu)于AFP(χ2=7.29，P ＜0.01)，敏感性兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.27，P=0.07)。GP73、DKK1、AFP三者聯(lián)合診斷PHC的敏感性均優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)(χ2=10.31，P=0.01;χ2=16.04，P ＜ 0.01;χ2=30.94，P ＜0.01)，而特異性明顯低于 GP73、DKK1(χ2=9.84，P ＜0.01;χ2=15.79，P ＜0.01)，與 AFP相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.79，P=0.18)。

表1 各組血清DKK1、GP73和AFP檢測(cè)結(jié)果的比較 (ng/mL)

圖1 GP73、DKK1、AFP和Logistic回歸模型檢測(cè)PHC的ROC曲線

三、PHC診斷模型的構(gòu)建

以肝病狀態(tài)(PHC組、非PHC組)為應(yīng)變量，血清DKK1、GP73、AFP測(cè)定結(jié)果為自變量，建立Logistic回歸模型。本研究模型中各參數(shù)的擬合結(jié)果見表2。因此得到的模型可表示為 Logit(Ⅱ)= －9.492+0.002×AFP+0.023×GP73+1.058×DKK1。

該模型經(jīng)過似然比檢驗(yàn)，此回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=160.06，P ＜0.01)。用 ROC 曲線法對(duì)上述模型進(jìn)行診斷價(jià)值分析，結(jié)果見圖1，AUC 為0.93，95%可信區(qū)間為 0.89 ～0.97，臨界值為0.57，敏感性和特異性分別為 87.7%和90.0%。

表2 AFP、DKK1、GP73聯(lián)合檢測(cè)PHC的Logistic模型擬合參數(shù)

四、DKK1、GP73、AFP及PHC診斷模型AUC比較

單獨(dú)用于PHC診斷，DKK1和GP73的AUC均明顯大于AFP(P均=0.01)，DKK1與GP73的AUC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.79);綜合AFP、DKK1、GP73診斷 PHC，Logistic回歸模型的AUC分別顯著大于 AFP、DKK1和 GP73(P均 ＜0.01)。見表3。

表3 AFP、DKK1、GP73及三者聯(lián)合診斷PHC的AUC比較

討 論

PHC是世界第5大常見癌癥，其致死率高居世界第3位[4]。而在我國，根據(jù)最新公布的2012年《中國腫瘤登記年報(bào)》，PHC的發(fā)病率居第4位，而病死率高居第2位[5]。PHC起病隱匿，早期多無明顯的癥狀、體征，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已為中晚期，如不予以積極治療，自然病程較短，總體5年生存率＜5%[6]。而早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療可顯著提高患者的5年生存率。AFP是目前診斷PHC最重要的腫瘤標(biāo)志物，已被廣泛用于PHC的普查、診斷、判斷治療效果和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，然而其敏感性和特異性均不令人滿意，肝硬化結(jié)節(jié)、脂肪浸潤(rùn)、不典型肝臟炎性病灶及罕見的肝臟良性病變等均可發(fā)生AFP升高，且AFP陰性或低滴度陽性肝癌亦無法與肝臟良性病變鑒別[7]。近年來，基因技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤免疫等方面的研究飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了一系列新的、潛在的腫瘤標(biāo)志物，其中DKK1、GP73被認(rèn)為是值得期待的血清標(biāo)志物。

DKK1是位于人類染色體10q11.2、編碼1個(gè)長(zhǎng)約266氨基酸、相對(duì)分子質(zhì)量為28.7×103的分泌型蛋白，其作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的拮抗劑，在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)DKK1在PHC患者中的表達(dá)高于HC者及 CH、LC 患者，與陳國棟等[9]及 SHEN 等[10]研究結(jié)果一致。最近 CANEPARO等[11]亦發(fā)現(xiàn)，DKK1可通過與細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素類蛋白多糖蛋白結(jié)合，激活非經(jīng)典的Wm/平面細(xì)胞極性(planar cell polority，PCP)通路，促進(jìn)了肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并且多項(xiàng)研究表明硫酸乙酰肝素類蛋白多糖蛋白在肝細(xì)胞癌中表達(dá)明顯上調(diào)[12]。目前有新的研究提出DKK1對(duì)PHC診斷的敏感性、特異性均優(yōu)于AFP[10]。在本研究中，DKK1以4.48 ng/mL為臨界值時(shí)，其敏感性為71.6%，特異性為90.0%，DKK1診斷PHC的特異性優(yōu)于AFP(P＜0.01)，而敏感性與AFP相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07)，考慮是DKK1高表達(dá)可能存在多種途徑所致，不僅由乙型肝炎病毒感染引起，但因本研究中丙型肝炎病毒和未合并病毒感染的肝癌病例偏少，不能排除檢驗(yàn)效能的影響，因此仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

GP73是一種Ⅱ型高爾基體跨膜蛋白，KLADNEY等[13]于2000年首先闡述了其在正常情況下主要由膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，而在肝細(xì)胞中表達(dá)很少甚至不表達(dá)。隨后，KLADNEY等[14]發(fā)現(xiàn)病毒(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒)感染和非病毒(酒精性及自身免疫性肝病)引起的急、慢性肝病患者血清中GP73表達(dá)上調(diào)。BLOCK等[15]于2005年首先提出，在肝癌患者血清中GP73水平顯著升高。本研究結(jié)果顯示PHC組GP73含量明顯高于CH和LC組，與施前鋒等[16]和吳巧萍等[17]的研究結(jié)果一致。而陳文莉等[18]的研究結(jié)果顯示肝癌、LC及肝炎患者間血清GP73水平無差異，還有一些研究認(rèn)為L(zhǎng)C患者血清GP73水平高于 PHC 患者[7，19-20]，與本研究結(jié)果相反，這種情況可能是參與這些研究的PHC和LC患者肝損傷的程度不同所致。以GP73＞192.97 ng/mL為臨界值時(shí)，其敏感性為77.8%，特異性為86.7%，作為診斷PHC的血清指標(biāo)，GP73的敏感性優(yōu)于AFP，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[10，16-17，21]一致。

本研究建立PHC診斷模型，應(yīng)用Logistic回歸模型的似然比檢驗(yàn)表明模型的擬合優(yōu)度較好，采用對(duì)模型預(yù)報(bào)能力判斷的ROC曲線對(duì)模型進(jìn)行分析，通過Logistic回歸擬合得到聯(lián)合預(yù)測(cè)因子，以聯(lián)合預(yù)測(cè)因子為診斷指標(biāo)分析其對(duì)PHC的診斷價(jià)值。聯(lián)合預(yù)測(cè)因子診斷PHC時(shí)的AUC高于GP73、DKK1或AFP單項(xiàng)檢測(cè)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上聯(lián)合預(yù)測(cè)因子的AUC與GP73、DKK1、AFP單項(xiàng)檢測(cè)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。診斷模型AUC 為 0.93(95%可信區(qū)間 0.89 ～0.97)，其敏感性和特異性分別為87.8%和90.0%。AUC越大，診斷的價(jià)值越大，AUC＞0.9時(shí)表示診斷有較高的準(zhǔn)確性[22]。

綜上所述，DKK1和GP73是新一代肝癌診斷標(biāo)志物，聯(lián)合檢測(cè)為診斷PHC提供了有效途徑，可用于PHC高危人群的普查和篩選。ROC曲線分析結(jié)合Logistic回歸簡(jiǎn)單、有效，可用于PHC多指標(biāo)聯(lián)合診斷的分析評(píng)價(jià)。本研究也存在一些不足之處:(1)本研究是一個(gè)單中心小樣本的研究;(2)本研究為非隨機(jī)對(duì)照研究，盡管在研究前對(duì)患者的基礎(chǔ)資料進(jìn)行了匹配，但難免會(huì)存在一些樣本誤差。因此，需要更大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究進(jìn)一步驗(yàn)證這些腫瘤標(biāo)志物對(duì)PHC的診斷價(jià)值。

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