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（北京出入境檢驗檢疫局，北京 100113）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型RT-LAMP檢測方法建立

蒲 靜，汪 琳，尹 羿，柏亞鐸，任 彤，張 偉，高志強，烏日古瑪拉，時培蛟，肖春芳

（北京出入境檢驗檢疫局，北京100113）

本研究針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型ORF6基因的6個區(qū)域，利用2對引物建立檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-LAMP快速檢測方法，該方法具有高靈敏度，高特異性的優(yōu)點，在2小時左右即可得出結果，其靈敏度與PRRSV熒光RT-PCR檢測方法相近，高于普通RT-PCR檢測方法。將滅活的豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型培養(yǎng)物作10倍系列稀釋，結果顯示建立的熒光RT-PCR的檢測極限可達10-7，RT-PCR檢測方法的檢測極限為10-5，RT-LAMP檢測方法達到10-8，表明建立的RT-LAMP檢測方法非常靈敏，可用于檢測豬組織樣本中的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；美洲型；RT-LAMP

豬繁殖和呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）以妊娠母豬流產，早產，產死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬和肥育豬的呼吸道癥狀為特征[1，2]。豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種單股正鏈的RNA病毒，可分為兩個基因型，即歐洲型和美洲型[3]。PRRSV 基因組長約15kb，具有9個開放閱讀框架（ORFs）。常用的分子生物學方法為普通RT-PCR和熒光RTPCR，熒光RT-PCR是國際上公認快速準確的技術之一，但存在設備相對昂貴的缺點[4-7]。 等溫擴增技術RT-LAMP不需要模板的熱變性，擴增效率高，具有不需要特殊儀器、快速、特異性強的特點，而且結果判定簡單。本研究針對美洲型PRRS病毒建立了RT-LAMP檢測技術[8-9]。并通過特異性和靈敏度評價，進而用于臨床樣本檢測，為現場檢測美洲型PRRS病毒提供一種快速可靠的方法[10]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

TRIZOL，購自Invitrogen公司；AMV 反轉錄酶，dNTP購自Promega 公司；Bst DNA 聚合酶購自NEB 公司；betaine購自Sigma 公司；SYBR Green I 購自Invitrogen 公司；HNB（hydroxynaphthol blue），分子式C20H11N2Na3O11S3，M＝620.47g/ Mol，購自Fluka公司；Taq DNA聚合酶和PCR相關試劑，購自Promega公司；PRRS病毒美洲型熒光RT-PCR檢測試劑盒，本實驗室研制；RNA酶抑制劑，購自Promega公司；無水乙醇，分析純，-20 ℃ 預冷；75%乙醇，用新開啟的分析純無水乙醇和DEPC 水（符合GB 6682－92 要求）配制，-20 ℃預冷。

臺式冷凍高速離心機（離心速度可達12 000 r/ min）；臺式電子天平；常規(guī)PCR儀；熒光PCR檢測儀（ABI 7900HT，Roche 1.1）；離心機（離心速度3 000 r/min）。

1.2 滅活病毒及核酸

檢測方法研究中用病毒株及其來源如表1所列。

表1 各種病毒種類

1.3 病毒RNA提取

向加有600μL裂解液的滅菌離心管中加入待測樣本200μL，用吸頭反復抽吸混勻；再加入200μL氯仿，混勻器上振蕩混勻5s或顛倒混勻15次（不宜過于強烈，以免產生乳化層）；12000g離心 15min；另取滅菌離心管，加入600μL異丙醇（－20℃預冷），并加入上述離心后的上層液相（注意不要吸出中間層，該層富含DNA和蛋白質），顛倒混勻；12000g離心15min；輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，吸干液體；加入600μL 75%乙醇（-20℃預冷），顛倒洗滌；12000g離心10min；輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量吸干液體；離心5s，將管底部少量液體用微量加樣器吸干。室溫干燥5min；干燥后于沉淀中加11μL DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA（即為所需RNA）。

1.4 引物設計

為確保探針的保守性和特異性，我們針對目前已知的3個不同亞群的豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸[11]，選取ORF6基因編碼區(qū)特定序列作為靶區(qū)域，應用DNAMAN在多重序列比對的基礎上，設計引物（圖1，表2）。引物FIP和BIP針對的2個擴增區(qū)域之間用TTTT進行連接，以便于擴增時成環(huán)。

1.5 引物篩選

將上述引物對進行試驗。根據采用的反應體系（表3），豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型07-14提取RNA后，將RNA以1：104稀釋后，進行RT-LAMP檢測，反應參數為60℃/60min，80℃/15min。

1.6 RT-LAMP反應體系的建立與優(yōu)化

1.6.1 反應物濃度優(yōu)化

MgSO4、betaine、dNTP的濃度以及反應時間和溫度對LAMP反應效率有一定影響，通過逐一優(yōu)化，確定反應體系和條件。

1.6.2 反應溫度和時間的優(yōu)化

對反應溫度和時間都進行了優(yōu)化試驗，以期達到最佳擴增效率，主要比較了以下幾種循環(huán)條件的擴增效率。

方法A - 60℃：60min，80℃ 15min；

方法B - 60℃：90min，80℃ 15min；

方法C - 60℃：120min，80℃ 15min；

方法D - 62℃：120min，80℃ 15min；

方法E - 50℃：15min，60℃：120min，80℃ 15min。

1.7 靈敏度試驗

將豬繁殖與呼吸綜合征病毒07-14核酸作10-1～10-8稀釋，分別用RT-LAMP，普通RT-PCR和熒光RT-PCR檢測，比較方法的靈敏度。

圖1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型3個不同亞群的的序列比對和引物設計

表2 研究過程中涉及引物名稱、序列

表3 RT-LAMP反應體系

1.8 特異性試驗

用所建立的方法對歐洲型PRRS病毒LV核酸、豬偽狂犬病病毒核酸、豬瘟病毒C株核酸和豬鏈球菌2型ZY株核酸，分別進行檢測，驗證方法的特異性。

1.9 重復性試驗

連續(xù)3次分別用建立的RT-LAMP檢 測 方 法 10-5、10-6、10-7稀 釋 病 毒07-14核酸的進行重復性試驗，驗證方法的可重復性和穩(wěn)定性。

1.10 快速顯色研究

在建立RT-LAMP檢測方法基礎上，分別將SYBR Green I 和HNB兩種染色液加入反應體系，比較顯色情況。SYBR Green I購買后直接使用；HNB為粉末，稱量0.946g，用DEPC水定容于50mL離心管中。取6管1.5mL離心管，每管加入900μL DEPC水，再分別加入100μL 30mmol/L HNB；配成3mmol/L HNB溶液。

1.11 臨床樣品檢測

2006—2007年某地區(qū)數個規(guī)?；i場采集的病料（各種內臟和肌肉組織）49份應用建立的RT-LAMP方法進行檢測，并與熒光RT-PCR和常規(guī)RT-PCR檢測方法進行比較。

2 結果

2.1 引物篩選結果

采用上述條件，篩選出能檢出所用3株美洲型病毒核酸，且擴增穩(wěn)定的引物對：PRRS2-F3，PRRS2-B3，PRRS2-FIP，PRRS2-BIP。

2.2 反應體系優(yōu)化結果

按照GB/T19438.1所敘方法提取病毒RNA。由于MgSO4，betaine，dNTP的濃度以及反應時間和溫度對LAMP反應效率有一定影響，通過逐一優(yōu)化，確定了如下反應體系和條件（表4）。

圖2 引物篩選試驗結果

表4 建立的RT-LAMP反應體系

2.3 反應溫度和時間優(yōu)化

采用5種條件對相同的反應體系進行擴增，效率相近，因此選擇效果最好的等溫方法，即以方法C作為等溫擴增時的反應條件。

2.4 靈敏度試驗

將病毒07-14核酸作10-1～10-8稀釋，應用建立的RT-LAMP檢測，顯示該方法的靈敏度達到10-8（圖3）。用建立的方法與熒光定量RT-PCR方法和常規(guī)RT-PCR方法進行比較，表明建立的方法靈敏度與熒光定量RT-PCR方法相近，但明顯高于常規(guī)RT-PCR檢測方法（圖6）。

圖3 RT-LAMP對病毒07-14核酸檢測靈敏度

圖4 反應結束后，陽性擴增可見明顯的混濁（左側2管），陰性反應清亮（右側1管）

圖5 反應結束后，加入SYBR Green I進行染色的結果

圖6 RT-LAMP與熒光定量RT-PCR方法和常規(guī)RT-PCR方法的比較

圖7 建立的RT-LAMP的特異性試驗結果

圖8 HNB染色結果

2.5特異性試驗

用所建立的方法對歐洲型PRRS病毒LV核酸、豬偽狂犬病病毒核酸、豬瘟病毒C株核酸和豬鏈球菌2型ZY株核酸分別進行檢測，驗證方法的特異性。結果顯示本法特異性良好，無交叉反應（圖7）。

2.6 重復性試驗結果

連續(xù)3次分別用建立的RT-LAMP檢測方法10-5，10-6，10-7稀釋病毒07-14核酸的進行重復性試驗，以驗證方法的可重復性和穩(wěn)定性。結果顯示3個稀釋度的病毒核酸均為陽性，重復性好。

2.7 快速顯色研究

在建立RT-LAMP檢測方法基礎上，分別將SYBR Green I 和HNB兩種染色液加入反應體系，比較顯色情況。結果顯示SYBR Green I在反應前加入反應體系影響擴增結果，且顯色明顯程度不如HNB。而HNB在反應前加入反應體系不影響擴增效果（圖8）。

2.8 臨床樣品檢測結果

2006—2007年某地區(qū)數個規(guī)?；i場采集的病料（各種內臟和肌肉組織）49份應用建立的RT-LAMP方法進行檢測，并與熒光RTPCR和常規(guī)RT-PCR檢測方法進行比較。結果顯示RT-LAMP與熒光RTPCR結果完全一致，符合率100%，檢出率高于普通RT-PCR檢測結果（表5）

表5 49份臨床樣品的檢測結果

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征于1987年首先出現于美國[12]，20多年來特別是2006年發(fā)生于我國的高致病性PRRS，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失而引起了科學界的關注[13-15]。

PRRS 的診斷方法有多種[16]，往往依據臨床癥狀和病理變化只可做出初步診斷，所以還應該根據實驗室診斷技術加以確診。對于病原檢測，目前常用方法為病毒分離鑒定、抗原捕獲檢測和分子生物學檢測方法[17-20]。有報道用定量TaqMan RT-PCR 方法檢測PRRSV，通過與其它方法比較發(fā)現，在省時、易用性、敏感性及特異性上都有很不錯的表現，而且不僅能夠減少交叉污染的風險，還能區(qū)分不同的毒株[21-23]。我們通過運用建立的方法對豬瘟病毒核酸、偽狂犬病毒核酸以及豬鏈球菌2型核酸進行檢測，無交叉反應，表明特異性良好。試驗中還發(fā)現LAMP由于產物量大，開蓋檢測很容易發(fā)生氣溶膠污染，因此需要更為嚴格的實驗室管理措施，盡量做到不開蓋檢測。

本研究中，應用建立的方法對49份臨床樣本進行了檢測，結果顯示建立的RT-LAMP檢測方法與熒光RT-PCR試驗結果完全一致。

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Development of an RT-LAMP Assay for Detection of American Type Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus（PRRSV）

Pu Jing，Wang Ling，Ying Yi，Bo Yaduo，Zhang Wei，Gao Zhiqiang，Wurigumala，Shi Peijiao，Xiao Chunfang（Beijing Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100113）

Two pairs of primers targeting six regions of American-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF6 gene，and RT-LAMP assay was established for the rapid detection of porcine reproductive and respiratory virus with high sensitivity and specifi city. It could be fi nished in about 2 hours. The sensitivity of the assay was similar to PRRSV fluorescent RT-PCR，and higher than the normal RT-PCR. The inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus culture was serially diluted in 10-folds，and tested with PRRSV fl uorescent RT-PCR，RTLAMP assay and normal RT-PCR. The result showed that the fl uorescence RT-PCR detection limit was up to 10-7，the normal RT-PCR detection limit was 10-5，and the RT-LAMP detection limit was 10-8，indicating RT-LAMP assay was very sensitive. The assay could be used for rapid detection of the American-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus in various pig tissue samples.

porcine reproductive and respiratory syndrome；American- type virus；RT-LAMP

S852．651

：A

：1005-944X（2015）02-0057-06

國家質檢總局科技計劃項目（2013IK027）資助

：蒲靜