周 宇，唐連飛，朱事康，朱中武，佟鐵鑄，禹思宇，林志雄，劉 星，陳燕忠，羅卓軍

（1.惠州出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東惠州 516006；2.湖南出入境檢驗檢疫局，湖南長沙 410004；3.廣東出入境檢驗檢疫局，廣東廣州 510623）

豬博卡病毒的基因分型

周 宇1，唐連飛2，朱事康1，朱中武2，佟鐵鑄1，禹思宇2，林志雄3，劉 星1，陳燕忠1，羅卓軍1

（1.惠州出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東惠州516006；2.湖南出入境檢驗檢疫局，湖南長沙410004；3.廣東出入境檢驗檢疫局，廣東廣州510623）

為了解豬博卡病毒（PBoV）的遺傳進化規(guī)律，研究可行的 PBoV 基因分型方法，本研究利用 GenBank中登錄的 29條 PBoV 和2條本實驗室測得的全基因組序列信息，采用生物信息學軟件進行基因組序列分析。結(jié)果顯示，分別以NS1 基因、NP1 基因和 VP1 基因編碼氨基酸構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，PBoV 均被劃分為 3 個基因群，但三種氨基酸序列繪制的進化樹存在差異；基因群內(nèi)各病毒株的氨基酸序列同源性較高，而各基因群之間病毒株的氨基酸序列同源性非常低，基因組結(jié)構(gòu)差異較大。

豬博卡病毒；遺傳進化分析；基因分型

豬博卡病毒（porcine Bocavirus，PBoV）為細小病毒科細小病毒亞科博卡病毒屬成員，基因組為單鏈線狀 DNA，基因組約 5.0 kb，含有 3 個開放閱讀框（ORFs），編碼 2 個非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1和 NP1，以及 2個結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白 VP1和VP2[1]。其中 VP1/VP2存在部分重疊，是病毒的主要抗原蛋白。目前已經(jīng)在多種動物（包括人）體內(nèi)檢測到博卡病毒[2]，并且PBoV 各株間基因組大小差異較大。2009 年瑞典研究人員首先在患有仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征的病豬中獲得一段1879 bp的核苷酸序列，該序列與 HBoV 序列相似，包括完整的 NP1 基因和部分 VP1/VP2 基因，因此暫時將其命名為豬類博卡病毒（Porcine boca-like virus，PBo-likeV）[3]。隨后，各國在發(fā)病或健康豬的樣品中獲得了 PBoV 的全長或接近全長基因組序列，證明了 PBoV 確實在豬體內(nèi)普遍存在。目前在 PBoV的檢測方法、流行病學、全基因擴增等方面已經(jīng)取得了較大進展[4，5]，但在基因分型、病毒分離、致病性等方面的研究還比較薄弱。最初根據(jù)該病毒發(fā)現(xiàn)的先后將PBoV分為 5個基因型[6，7]，國內(nèi)也有學者將其分為7個基因表型（PBoV1-5、PBoLV、PPV4）[11]。還有一些研究人員在獲得 PBoV 全基因組序列后，并未進行 PBoV 基因分型。目前對PboV的基因分型方法的建議主要是2013年國際病毒分類委員會（ICTV）建議的博卡病毒分類標準，建議以NS1基因編碼的氨基酸同源性為依據(jù)，將氨基酸同源性＞85%劃分為同一種群，氨基酸差異＞15%的劃分為不同種群，將豬博卡病毒分為4個種群。也有一些學者認為博卡病毒的分型應(yīng)該以VP1基因為依據(jù)，Kapoor等[7]基于對HBoV中大量VP1基因進行系統(tǒng)進化分析提出了新的HBoV分類標準：病毒間VP1氨基酸差異＞8%且核苷酸差異＞10%時歸為不同種;VP1氨基酸差異＞1.5%且核苷酸差異＞5%時歸為不同基因型；覃紹敏等[9]通過基因序列比較和基因進化樹分析，提出將PboV劃分為PBoV1-3三個基因型。通過對以上觀點的綜合考慮，本研究參考 GenBank 中登錄的所有 PBoV 全基因組序列（包括3個完整 ORFs）和本實驗室測得的2株P(guān)boV的全基因序列，采用生物信息學軟件進行各基因編碼的氨基酸序列同源性和遺傳進化分析，研究并討論 PboV可行的基因型分類方法。

1 材料和方法

本實驗室測得的兩株P(guān)BoV 全基因組序列命名為GD4（KJ755665）和GD18（KJ755666），再從GenBank上獲取29條PboV的全基因組序列信息，序列包括國內(nèi)全部毒株，美洲、歐洲、非洲部分不同基因型毒株?；趪H病毒分類委員會（ICTV）根據(jù)氨基酸序列相似性對細小病毒進行分類的原則，截取每條序列完整的 ORFs 部分（NS1、NP1、VP1/VP2），采用 DNAStar 生物信息學軟件翻譯成氨基酸序列并通過 Clustal W算法進行同源性分析，采用MEGA5.1繪制系統(tǒng)遺傳進化樹，并引入了一條外群序列HM031134（豬細小病毒4型），對得到的可信樹進行分析。引用的基因登錄號為：HQ223038、HM053693、HM053694、 HM031134、JN831651、HQ291308、HQ291309、JF429834、JF429835、JF429836、JF512472、JF512473、JF713715、JF713714、JX854557、KC473563、KF206165、KF206155、KF206157、KF206167、KF206154、KF206161、KF206162、KF206166、NC-023673、KF025390、KF025394、KF206156、JN681175和JN621325。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸遺傳進化分析

將 29條 PBoV 的NS1 編碼氨基酸、NP1 編碼氨基酸、VP1/VP2 編碼氨基酸的進行序列相似性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1、2、3）。結(jié)果顯示選取NS1 編碼氨基酸、NP1編碼氨基酸 和 VP1編碼氨基酸所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹均分為2個大分支，參照外群基因發(fā)現(xiàn)，兩個平行的大分支集中了較多的毒株序列；次一級分支均為3個（除去bootstrap 值小于60%的小分支）較大的分支，將三個大分支分別命名為G1群、G2群、G3群，但是各分支的位置卻不同，以HQ291308株（“☆”標注）為例，以VP1/VP2 編碼氨基酸構(gòu)建進化樹時其與其它3個毒株處于一個大的獨立分支上（圖1）；以NS1 編碼氨基酸、NP1編碼氨基酸構(gòu)建進化樹時，HQ291308株卻與另一個分支同處于一個大分支上，而不是獨立的分支（圖2、3）。因此，VP1/VP2編碼氨基酸和NS1編碼氨基酸、NP1編碼氨基酸在進化關(guān)系上存在很大差異，可能來自于不同的祖先；G1群和G2群包含的毒株較多，并且存在一些小的分支，這些小分支在 3 個系統(tǒng)進化樹中存在一定差異性，而且有些bootstrap 值較低，再進一步劃分還需要更多數(shù)量的基因序列。覃紹敏等[9]和Yang等[13]經(jīng)過基因序列和遺傳進化分析提出可以考慮將PboV劃分為PBoV1、PBoV2和 PBoV3三個基因群。本研究認為從進化關(guān)系觀察分為3個群也是可行的，但以不同編碼氨基酸為依據(jù)進行分類在進化關(guān)系上不同；如圖所示，所有序列明顯分為兩個大分支，根據(jù)NS1和NP1的系統(tǒng)進化樹G2群和G3群處于同一分支，而根據(jù)VP1/VP2繪制的系統(tǒng)進化樹G1群和G2群處于同一個分支，因此推測豬博卡病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1/VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，NP1在進化關(guān)系上存在差異，尤其是G3群病毒的結(jié)構(gòu)蛋白處于獨立進化分支，而非結(jié)構(gòu)蛋白與G2群病毒關(guān)系密切。

圖1 VP1/VP2 氨基酸進化樹

圖2 NP1氨基酸進化樹

2.2 氨基酸同源性分析

根據(jù)2.1 PBoV的基因分群情況，分別進行PBoV 基因群內(nèi)和群間氨基酸序列同源性分析（圖4、5、6）。表 1結(jié)果顯示，以 NS1、NP1、VP1/VP2編碼氨基酸序列進行比較，基因群內(nèi)的氨基酸同源性均較高，G1群內(nèi)同源性最高為 98.8%，G2群內(nèi)同源性最高為 98.6 %，G3 群內(nèi)同源性最高為99.5 %；而基因群間的氨基酸同源性非常低，G1 群和G2 群之間最高為 43.6 %，最低為 31.1 %，G1群和G3群之間最高為42.4 %，最低僅為 25.1%，G2群 和G3群之間最高為 48.4 %，最低37.9%。由此表明PBoV 各株之間的氨基酸序列具有多樣性，基因群內(nèi)的病毒株具有較高的保守性，而不同基因群的病毒株間差異較大；G1 群和G2 群病毒株VP1 基因編碼氨基酸序列同源性為 38.2%～41.5 %，G1群和G3 群同源性 為 29.4%～36.8 %，G2 群和G3 群同源性為44.3%～48.4 %，均低于50 %；而各群內(nèi)病毒株的VP1/VP2 基因編碼氨基酸序列同源性最低為73.3%，群間氨基酸序列相似性較低，群內(nèi)氨基酸序列相似性較高，如果以VP1/VP2或NS1 基因編碼氨基酸序列同源性高低為依據(jù)進行基因分型是可行的。PBoV 各基因編碼氨基酸序列同源性分析結(jié)果與之前的氨基酸序列進化分群結(jié)果相一致。從表中可以看出NS1的群間氨基酸同源性高于其余兩種蛋白，均在36%以上，滿足國際病毒分類委員會（ICTV）中關(guān)于病毒分屬的要求。目前G3群只有4條全基因序列，在進行氨基酸同源性比對時發(fā)現(xiàn)一個特殊的毒株HQ291308，該毒株的NP1，VP1/VP2與其它3個毒株的的相關(guān)氨基酸序列同源性很高，在97.6～99.5%之間，但是NS1與其它3個毒株的相關(guān)氨基酸序列同源性最高只有81.0%。按照ICTV的分類方法將其分為一個獨立的Ungulate bocaparvovirus 3型，但是在系統(tǒng)進化樹上，該毒株并不處于一個獨立分支（見進化樹“☆”標注），還需要更多的序列進行研究。

圖3 NS1氨基酸進化樹

表 1 PBoV 編碼氨基酸同源性分析結(jié)果

圖4 NS1氨基酸同源性

圖5 VP1/VP2 氨基酸同源性

圖6 NP1 氨基酸同源性

3 討論

2013年國際病毒分類委員會（ICTV）對博卡病毒的分類進行了調(diào)整，之前建議將NS1基因序列同源性＞95%劃分為同一種群，隨著博卡病毒全基因序列的不斷發(fā)布，建議以NS1氨基酸相似性＞85%為同一種群進行分類。并將豬博卡病毒分為Ungulate bocaparvovirus 2（包括HM053693、HM053694、HQ291309），Ungulate bocaparvovirus 3（HQ223038），Ungulate bocaparvovirus 4（HQ291308），Ungulate bocaparvovirus 5（JF429834、JF429835、JF429836）4個種群。本研究通過對氨基酸遺傳進化和同源性進行分析，發(fā)現(xiàn)同種群豬博卡病毒的同源性較高，在進化分支上處于同一分支，對其進行基因分型具有可行性。但G1群和G3群的毒株多樣性顯著，G1群內(nèi)毒株NS1同源性在74.7～98.8%之間，結(jié)合ICTV的以NS1氨基酸相似性＞85%為同一種群的分類方法進一步劃分比較合適。目前已經(jīng)有KF206154，JN831651，JF512473，JN621325和 KF025394，JN681175兩個新的種群，可以命名為Ungulate bocaparvovirus 6和Ungulate bocaparvovirus 7。

一些學者認為VP1/VP2能夠在很大程度上影響病毒的組織嗜性及潛在致病性，應(yīng)該以編碼VP1/VP2的核苷酸序列相似性高低作為分類標準[12]，可以考慮將VP1/VP2作為基因分型的首選基因[9]。觀察3個系統(tǒng)進化樹和相似性比較發(fā)現(xiàn)以NS1為依據(jù)和以VP1/VP2為依據(jù)進行分群在進化關(guān)系上存在不同，但是得到的結(jié)果一致，G1和G2群內(nèi)包含的毒株一致；不一致之處在于G3群中的HQ291308株，以NS1為依據(jù)，按照氨基酸序列相似性＞85.0%劃分為同一種群進行劃分，它應(yīng)該屬于獨立種群。但如果以VP1/VP2為依據(jù)，它與HQ223038同源性高達98.4%，它們應(yīng)該屬于同一個種群。因此病毒的分類方法還需要不斷的補充完善。但為做到豬博卡病毒基因分型研究的一致性，應(yīng)該按照ICTV的統(tǒng)一標準，根據(jù)NS1氨基酸相似性進行分類。

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Studies on Genotyping of Porcine Bocaviruses

Zhou Yu1，Tang Lianfei2，Zhu Shikang1，Zhu Zhongwu2，Tong Tiezhun1，Yu Siyu2，Lin Zhixiong3，Liu Xing1，Chen Yanzhong1，Luo Zhuojun1
（1.Huizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huizhou，Guangdong 516001；2.Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changsha，Hunan 410004；3. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510623）

To analyze the genomic characteristics and classify the genotypes of porcine Bocavirus（PBoV），the complete genomic sequences of 29 PBoVs available in GenBank and 2 PboVs detected by our laboratory were analyzed for the homology of NS1，NP1，VP1 amino acid sequences by bioinformatics software. The results showed that PBoV could be divided into three groups based on phylogenetic tree established according to PBoV NS1，NP1，VP1 amino acid sequences，but there were also some noticeable differences among them：the viruses in the same group shared higher sequence identity and those in different groups shared lower sequence identity.

porcine Bocavirus（PboV）；phylogenetic analysis；genotyping

S852.651

：A

：1005-944X（2015）02-0063-06

國家質(zhì)檢總局項目（2014IK243）