劉 華，錢昌銀，詹松鶴，朱良強(qiáng)

（1.安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 230096；2.合肥市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，安徽合肥 230096）

應(yīng)用Kappa法檢驗(yàn)IHA和ELISA在檢測(cè)豬瘟抗體中的一致性

劉 華1，錢昌銀2，詹松鶴1，朱良強(qiáng)1

（1.安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 230096；2.合肥市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，安徽合肥 230096）

[目的] 比較IHA和 ELISA 2種基層使用較廣泛的豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性。[方法]用產(chǎn)品A（IHA）和產(chǎn)品B（ELISA）對(duì)237份豬血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，分別計(jì)算陽(yáng)性率、陽(yáng)性一致性、陰性一致性、符合率，并進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)。[結(jié)果] 產(chǎn)品B檢測(cè)的陽(yáng)性率（73.8%）高于A（67.1%），且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。2種試劑盒共同檢出128份豬瘟抗體陽(yáng)性和31份陰性，陽(yáng)性一致性為80.5%（95%置信區(qū)間：74.3%-86.7%），陰性一致性為39.7%（95%置信區(qū)間：28.9%-50.6%），符合率67.1%（95%置信區(qū)間：61.1%-73.1%）；Kappa 值為0.214（95%置信區(qū)間：0.088-0.339）。[結(jié)論] 2種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率有差異，結(jié)果一致性強(qiáng)度為弱。

豬瘟；抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；正向間接血凝試驗(yàn)；Kappa檢驗(yàn)

豬瘟是由豬瘟病毒感染引起的豬急性、熱性、高致死性傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大，是我國(guó)規(guī)定強(qiáng)制免疫的重大動(dòng)物疫病之一，為科學(xué)評(píng)價(jià)其免疫效果，每年要求對(duì)其進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)。豬瘟抗體檢測(cè)方法較多，正向間接血凝試驗(yàn)由于操作簡(jiǎn)單、不需要特殊設(shè)備，在基層被廣泛采用；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）能迅速檢測(cè)大量樣品，而且還具有敏感、特異等特點(diǎn)[1]。為比較兩種方法的一致性，筆者對(duì)相同的豬血清樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 豬血清

237份豬血清，為本實(shí)驗(yàn)室保存的部分春季集中監(jiān)測(cè)樣品。

1.2 檢測(cè)試劑

豬瘟間接血凝抗體檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：2014070105）；豬瘟抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒（IDEXX，批號(hào)：49-40182）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 產(chǎn)品A（IHA法）。在96孔微量反應(yīng)板中每孔加入50μL稀釋液；取待檢血清加入第1孔，混勻，吸出50L轉(zhuǎn)入第2孔，混勻后吸出50μL至第3孔，依次倍比稀釋至第12孔，最后吸出的50L棄去。依照此法稀釋其余血清和陽(yáng)性對(duì)照；陰性對(duì)照血清依上述方法稀釋到第3孔，5～6孔為稀釋液對(duì)照。稀釋后，各孔加入血凝抗原25μL，震蕩混勻后覆膜，室溫靜置1.5～2h觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)為：以出現(xiàn)50%紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)達(dá)1：16的為抗體陽(yáng)性。

1.3.2 產(chǎn)品B（ELISA法）。在ELISA反應(yīng)板上每孔加入50μL樣品稀釋液，對(duì)照孔分別加入50μL陽(yáng)性血清和陰性血清，其余各孔加50μL待檢血清。振蕩混勻后覆膜，室溫靜置2h或過夜；充分甩去反應(yīng)板中的液體，并用稀釋后的洗滌液洗板3次，最后一次拍干；加入100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的豬瘟病毒的酶標(biāo)抗體加入各孔，覆膜室溫孵育30min，洗板3次后，每孔加入100μL底物溶液，室溫避光孵育10min，每孔加入100μL終止液，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值。判定標(biāo)準(zhǔn)為：據(jù)OD450nm值計(jì)算阻斷率，阻斷率大于或等于40%為陽(yáng)性，小于或等于30%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；結(jié)果一致性進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)。Kappa值＜0，一致性強(qiáng)度極差；0～0.2，微弱；0.21～0.4，弱；0.41～0.6，中度；0.61～0.8，高度；0.81～1.0，極強(qiáng)[2]。

2 結(jié)果

IHA和ELISA同時(shí)檢測(cè)237份豬血清樣本的結(jié)果比較見表1。

表1 2種方法檢測(cè)豬瘟抗體的結(jié)果比較

兩種試劑盒共同檢出128份陽(yáng)性，陽(yáng)性率54.0%。IHA單獨(dú)檢出159份陽(yáng)性，陽(yáng)性率67.1%。ELISA單獨(dú)檢出175份陽(yáng)性，陽(yáng)性率73.8%，略高于IHA（χ2=11.11，p＜0.01）。二者的陽(yáng)性結(jié)果一致性為80.5%（95%置信區(qū)間：74.3%-86.7%），陰性結(jié)果一致性為39.7%（95%置信區(qū)間：28.9%-50.6%），總體樣本結(jié)果的一致率為67.1%（95%置信區(qū)間：61.1%-73.1%）。經(jīng)Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值為0.214（95%置信區(qū)間：0.088-0.339），表明兩種產(chǎn)品的一致性為弱。

3 分析與討論

在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室工作中，如何選擇豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒往往困惑著檢測(cè)人員。判斷試驗(yàn)或試劑好壞的標(biāo)準(zhǔn)通常有兩個(gè)指標(biāo)，即敏感性（Se）和特異性（Sp）。國(guó)內(nèi)一般參考農(nóng)業(yè)部第 683 號(hào)公告有關(guān)規(guī)定進(jìn)行試劑盒敏感性和特異性的評(píng)價(jià)[3]，但基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室無(wú)法獲取金標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)血清，因此通過敏感性和特異性判斷試劑的好壞存在困難。Kappa一致性檢驗(yàn)方法是Cohen在1960年首先提出的，旨在評(píng)估不同檢測(cè)方法的一致性，近年來(lái)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、流行病學(xué)及臨床資料可靠性考察等方面的應(yīng)用較為廣泛[4-6]，但在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中應(yīng)用極少[7]。Kappa值無(wú)法判定哪個(gè)試劑盒或方法較好，但Kappa值越大，表明兩種結(jié)果可靠程度越高[4]。本次試驗(yàn)的結(jié)果一致性為弱，提示IHA和ELISA至少有一種結(jié)果不可靠。IHA和ELISA試驗(yàn)各有其優(yōu)劣勢(shì)，因此建議基層在開展豬瘟抗體檢測(cè)時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室儀器和經(jīng)費(fèi)配套的情況和結(jié)果可靠性慎重選擇。

應(yīng)用Kappa一致性檢驗(yàn)分析不同豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性，比國(guó)內(nèi)同類研究更加科學(xué)[8-11]，為科學(xué)選擇試劑提供了重要的參考依據(jù)。另外，在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室工作中，還常遇到評(píng)估兩種檢測(cè)方法、兩名檢驗(yàn)人員、兩種設(shè)備檢測(cè)結(jié)果的符合程度及用同一種方法進(jìn)行多次測(cè)定的結(jié)果能否重現(xiàn)的問題，這些均可以用Kappa一致性檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，因而應(yīng)用范圍較廣泛。筆者認(rèn)為，在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作中，應(yīng)重視和推廣Kappa一致性檢驗(yàn)，為評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果提供更加科學(xué)的依據(jù)。

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Liu Hua1，Qian Changyin2，Zhan Songhe1，Zhu Liangqiang1
（1.Anhui Center for Animal Disease Control and Prevention，Hefei，Anhui 230096; 2.Hefei Center for Animal Disease Control and Prevention，Hefei，Anhui 230096）

Application of Kappa-test for Evaluation of IHA and ELISA in CSFV Antibody Detection

[Objective]To compare the consistency between the 2 CSFV antibody kits（IHA and ELISA）widely used in veterinary labs at grassroots level in China. [Method]237 swine serum samples were tested by kit A（IHA）and kit B（ELISA）. The positive rates，positive and negative consistence rates，coincidence rate were calculated separately，and the consistency was evaluated by Kappa test. [Results]The positive rate of kit B（73.8%）was higher than kit A（67.1%）and there was a statistically signifi cant difference（p＜0.01）.128 positive and 31 negative were detected by the 2 kits together，the positive consistency rate was 80.5%（95%CI=74.3%-86.7%）and the negative consistency rate was 39.7%（95%CI=28.9%-50.6%），the coincidence rate was 67.1%（95%CI=61.1%-73.1%）.The Kappa value was 0.214（95%CI= 0.088-0.339）. [Conclusion]The results showed that there was a signifi cant difference between the two testing positive rates and a weak consistency between the two kits.

classical swine fever；antibody；ELISA；IHA；Kappa-test

S852.651

：A

：1005-944X（2015）02-0069-03

朱良強(qiáng)