，，

（中國檢驗檢疫科學研究院 動物檢疫研究所，北京 100029）

四種核酸染料對用LAMP方法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的影響

袁向芬，吳紹強，林祥梅

（中國檢驗檢疫科學研究院 動物檢疫研究所，北京 100029）

本研究旨在建立一種基于顏色變化的北美洲型豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）RT-LAMP檢測方法及結果判定方法，方便LAMP技術的現(xiàn)場檢測應用。根據(jù)GenBank中美洲型PRRSV的保守序列設計一套LAMP引物，對反應進行優(yōu)化后建立了PRRSV LAMP檢測方法。對比Dye63、鈣黃綠素（Calcein）、SYBR Green I和Picogreen 4種核酸染料對于LAMP反應的適用性。結果顯示，只有Calcein、Dye63適于LAMP反應前加入，但對擴增效率均產(chǎn)生一定抑制，造成反應時間延遲：Calcein的延遲作用更強（約10min），Dye63延遲作用較?。s5min）。加入Dye63的LAMP反應靈敏度為2×101拷貝，而加入Calcein的靈敏度要低10倍。經(jīng)多功能酶標儀對熒光強度的檢測，含Dye63的反應陰陽性差異明顯，可用于LAMP反應結果的判定。據(jù)此建立的基于新型核酸染料Dye63的PRRSV RT-LAMP檢測方法操作簡單、方便、直觀，可大大減少環(huán)境污染造成的假陽性。Dye63有望成為繼Calcein之后，可用于LAMP反應前加入，反應后閉管判定的一種新核酸染料，方便LAMP檢測技術現(xiàn)場應用。

PRRSV；環(huán)介導等溫擴增；檢測方法；核酸染料；比較；結果判定

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種傳染病[1，2]，病毒分為歐洲型和北美型兩種基因型，上世紀90年代以后，PRRSV就已經(jīng)在世界上所有養(yǎng)豬國家廣泛流行[3，4]，我國目前出現(xiàn)的疫情主要為北美型PRRSV感染，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。因此，加強對該疫病的檢驗檢疫，建立快速、高效、簡便的檢測方法是臨床檢疫的迫切需要。

隨著分子生物學的發(fā)展和傳統(tǒng)核酸擴增技術的不斷改進，2000年，日本榮研化學株式會社的研究人員Notomi研發(fā)了一種新的核酸擴增技術，即環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplifi -cation，LAMP）[5]。該技術依賴于能夠識別靶序列上6個特異性區(qū)域的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速、高特異地擴增靶序列，近年來已有較多文獻報道了該技術成功應用于多種病原體的檢測。

LAMP擴增反應結果判定目前主要有三種方法：濁度檢測、凝膠電泳檢測或核酸染料檢測。然而，由于LAMP擴增效率較高，電泳、酶切等開蓋操作極易引起實驗環(huán)境的污染，一般建議采用閉管操作，而沉淀法在無儀器輔助時僅憑肉眼判定易發(fā)生誤判的情況，染料法則由于易辨別、方便快捷、靈敏度高等優(yōu)點得到口岸、臨床動物疫病快速診斷的青睞。

本研究通過對Dye63、SYBR Green I、Picogreen、Calcein 4種染料在LAMP結果判定中的使用情況進行分析，期望篩選并建立一種快速便捷的PRRSV RT-LAMP方法及其染料判定方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器核酸染料Dye63（10，000×）為本實驗室研制；SYBR Green I（10，000×）、Picogreen（10，000×）均購自Invitrogen公司；Calcein、LAMP擴增反應試劑盒及RT-LAMP擴增反應試劑盒均為日本榮研化學株式會社研制產(chǎn)品。

實時濁度儀Loopamp LA-320c；多功能酶標儀EnVision等。

1.2 陽性質(zhì)粒及病毒材料包含PRRSV一段保守序列的陽性質(zhì)粒TPRRS376為本實驗制備保存；PRRSV活疫苗株（CH-1R株）、CSFV兔化弱毒疫苗株（HCLV株）均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存并提供；豬偽狂犬病病毒（PrV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV-H弱毒株）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV-CV777弱毒株）、豬輪狀病毒（PRV-NX株）均為本實驗室保存的滅活毒株。

1.3 方法

1.3.1 PRRSV LAMP檢測方法的建立。根據(jù)GenBank中PRRSV的保守序列設計一套引物（表1），并對反應溫度、引物濃度等條件進行優(yōu)化，建立PRRSV的LAMP檢測方法。

表1 PRRSV LAMP檢測的引物

1.3.2 染料篩選及使用濃度確定。Calcein、Dye63、SYBR Green、Picogreen 4種核酸染料中，只有鈣黃綠素（Calcein）是已商品化，可于LAMP反應前加入的染料，其使用量參照說明書。此外，經(jīng)過一系列前期試驗發(fā)現(xiàn)，將Dye63和SYBR Green I終濃度控制在4×左右，Picogreen終濃度控制在40×左右時，陰陽性可表現(xiàn)出較為明顯的顏色差異。在此基礎上進行進一步研究。

以不使用環(huán)引物的PRRSV LAMP反應為基礎，以實驗室制備保存的陽性質(zhì)粒為模板，按表2所示將不同量的染料分別加入反應液中，于實時濁度儀LA-320c中進行反應，并觀察濁度變化，反應完成后于紫外光照射下觀察反應液顏色變化。最后綜合染料的抑制作用大小和顏色變化程度確定染料最佳使用量。

表 2 染料最佳使用量的確定

1.3.3 染料對LAMP反應靈敏度的影響。將陽性質(zhì)粒模板進行10倍系列稀釋（1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷 貝 / μL）后備用。按照篩選出來的染料最佳使用量加入反應體系中進行靈敏度試驗。與不加染料的正常反應進行比較，觀察染料的加入對LAMP反應靈敏度的影響。

1.3.4 基于染料的PRRSV RT-LAMP檢測方法的建立。在PRRSV LAMP反應體系基礎上，加入反轉錄步驟，結合最佳染料及其使用量，最終建立基于染料的一步法PRRSV RT-LAMP快速檢測法及其判定方法。

1.3.5 PRRSV RT-LAMP檢測方法敏感性及特異性試驗。按照Trizol法提取PRRSV疫苗毒RNA并對其進行10倍系列稀釋，同樣方法分別提取CSFV、TGEV、PEDV、PRV的RNA，置-80℃保存?zhèn)溆谩rV、PCV2 DNA的提取采用Qiagen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒進行。依照優(yōu)化后的反應條件，分別對系列稀釋的PRRSV RNA及各病毒RNA進行RT-LAMP擴增。擴增完成后，將反應液置365nm紫外光下，觀察各管的顏色變化，以確定反應的敏感性及特異性。同時，作為對比，用PRRSV熒光RT-PCR試劑盒對系列稀釋后的RNA樣品進行檢測。

2 結果

2.1 PRRSV LAMP檢測方法的建立

以LAMP DNA擴增試劑盒為基礎，經(jīng)過對溫度、引物濃度等條件進行優(yōu)化后，建立了PRRSV的LAMP檢測方法，并確定其反應體系（25μL）中包含：PRRSV-FIP和PRRSV-BIP各50pmol，PRRSV- F3和 PRRSV-P3各 5pmol，PRRSV-FLP和PRRSV-BLP各20pmol，核酸DNA 2μL。反應程序確定為：63℃恒溫擴增60min；80℃酶滅活5min。

2.2 染料篩選及最佳使用量的確定

反應前加入不同量的4種染料，反應后觀察實時濁度曲線及顏色變化。研究表明，熒光染料加入量越大，溶液顏色越明顯，陰陽性反應的顏色差異也越大，但相對于反應的抑制作用也越明顯。試驗發(fā)現(xiàn)，4種染料中，Dye63對反應的抑制作用最小，當染料終濃度為2×時，擴增時間與正常LAMP反應相比僅延后5min左右，對濁度曲線基本無影響且反應后365nm光線下肉眼觀察可區(qū)分陰陽性；當染料濃度增加至4×、6×時，反應時間進一步延后，濁度曲線也不似正常LAMP反應平滑，最高濁度值降至0.4～0.6之間（圖1-A）。加入染料Calcein的反應，反應時間與正常LAMP反應相比延后10min左右，其他方面無明顯影響且反應完成后在紫外線照射下肉眼觀察陰陽性差異明顯（圖1-B）。而Picogreen和SYBR Green對反應的抑制作用最大，完全抑制了反應的進行，無擴增。以上結果表明，Dye63與商品化的Calcein相比對LAMP反應的抑制作用更小，可作為一種新的LAMP結果判定染料進行進一步研究。

圖1染料的篩選及使用量的確定

2.3 核酸染料對PRRSV LAMP反應靈敏度的影響

圖 2 染料對LAMP反應靈敏度的影響

圖3 應用不同染料時LAMP反應的靈敏度比較

將10倍系列稀釋的陽性模板分別加入含2× Dye63和25μM Calcein的反應液中進行反應，對比兩種染料的加入對反應靈敏度的影響。結果如圖2所示，兩種染料均使反應時間較正常反應延長，其中，加入Dye63的LAMP反應濁度曲線更為平滑，與正常反應相比靈敏度相同，均為2×101拷貝，而加入Calcein的LAMP反應靈敏度下降10倍，為2×102拷貝。反應完成后，通過多功能酶標儀對反應管熒光強度進行檢測，結果顯示，陽性孔熒光強度明顯高于陰性孔（圖3-A）。在365nm紫外光照射下，由5位實驗員通過肉眼觀察反應管顏色（圖3-B），均可進行快速判定，兩種染料均可呈現(xiàn)足夠的熒光色差供肉眼辨別，陽性反應顏色呈草綠色熒光，陰性反應呈橘紅色。另外，試驗結果顯示，加入Calcein的LAMP反應最高濁度值由原來的0.5左右上升至0.7左右（圖2），推測其原因可能是體系中加入Calcein后，導致沉淀更易沉降，因而導致反應管內(nèi)部濁度累積增加所致。

2.4 基于染料的PRRSV RT-LAMP檢測方法的建立

最終確定RT-LAMP反應體系（25μL） 為：PRRSV-FIP和PRRSVBIP各50pmol、PRRSV- F3和PRRSVP3各 5pmol、PRRSV-FLP和 PRRSVBLP各 20pmol、2×Reaction Mix 12.5μL（Tris-HCl（pH 8.8）20 mM、KCl 10mM、MgSO48mM、（NH4）2SO4 10mM、Tween 20 0.1%、betaine 0.8 M、dNTPs 5.6mM、酶Mix 1.0μL、核酸RNA 2μL、核酸染料Dye63 2×。反應程序為：63℃恒溫水浴鍋中擴增60min；80℃酶滅活5min。反應完成后閉管判定顏色變化結果（圖3）。

2.5 PRRSV RT-LAMP檢測方法的敏感性及特異性

靈敏度試驗顯示，所建立的RT-LAMP方法與熒光RT-PCR檢測方法相比較，擁有相同靈敏度，均可檢測到稀釋至10-4的RNA；特異性試驗顯示，未與其它病毒發(fā)生交叉反應（圖4）。可見，本方法具有良好的靈敏度與特異性。

圖4 PRRSV RT-LAMP敏感性及特異性分析

3 討論

本文通過對4種核酸染料的對比研究，篩選到一種可用于LAMP反應前加入，而對LAMP結果判定沒有顯著影響的新染料Dye63，并在此基礎上建立了檢測PRRSV用的一步法RT-LAMP檢測方法，該方法具有良好的敏感性與特異性，且實驗操作、反應條件及判定方法均便捷快速，為LAMP檢測方法現(xiàn)場應用提供新的技術儲備。

環(huán)介導等溫擴增技術的優(yōu)點在于：反應過程不用反復升溫降溫，在田間、口岸或一些設備不足的地方，利用簡單的恒溫設備即可進行；反應效率極高，單個目的基因可迅速擴增至109拷貝數(shù)；反應時間快速，檢測時間最低可降至30min左右。另外，其結果判定方法也較為快捷，常用的有瓊脂糖凝膠電泳法、濁度法和染料法三種，其中，染料法在便捷性、準確性、靈敏性等方面表現(xiàn)較優(yōu)，獲得廣泛的關注及應用。2008年Tomita篩選到一種鎂離子指示劑-鈣黃綠素，可于反應前加入試劑中，反應結束后直接根據(jù)顏色即可判別陰陽性。該方法的原理是先以錳離子抑制鈣黃綠素的熒光，隨著陽性反應的進行，產(chǎn)生大量的焦磷酸根，與鈣黃綠素競爭錳離子形成白色沉淀，鈣黃綠素失去錳離子的抑制作用后，便會接受鎂離子并在紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光，溶液則由原本的橘紅色轉為蘋果綠色[21]。

本研究通過對比Calcein和Dye63、SYBR Green、Picogreen 4種染料的使用效果，篩選出一種新的，反應前即可加入試劑中的核酸染料Dye63，該染料的分子結構目前還處于技術保密中，因此它的作用原理還有待進一步了解。但通過一系列的試驗發(fā)現(xiàn)，Dye63在終濃度為2×時使用效果較佳，既可使陰陽性反應產(chǎn)生顏色變化，又不會對反應時間、靈敏度造成顯著影響，有望成為繼Calcein以后可在LAMP反應前加入，反應后進行結果判定的一種新的染料。而SYBR Green和Picogreen由于抑制作用較大而僅適于反應后加入?；谌玖戏ǖ腖AMP技術仍有三點需要注意：首先，反應時間與正常LAMP反應相比會出現(xiàn)延遲現(xiàn)象，且反應的濁度曲線可能不似正常LAMP反應平滑，可能與加入染料影響了模板與各反應組分的相互作用有關；其次，當反應中不包含環(huán)引物時，染料的抑制作用更為顯著，而包含環(huán)引物的反應則顯示較低的抑制作用，可能是由于加入環(huán)引物大大提高了反應效率，從而緩解了染料的抑制作用；另外，高擴增率帶來的污染問題應值得注意，由于靈敏度高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前假陽性問題較嚴重，因此最好不要將反應后的管子打開。

LAMP技術自2000年面世以來，經(jīng)歷了十多年發(fā)展歷程，已經(jīng)日趨完善，該技術的主要發(fā)展方向趨于病毒、細菌、寄生蟲等病原微生物或疫病的現(xiàn)場快速篩查應用。雖然LAMP技術發(fā)展至今仍有一些缺點，但縱觀其發(fā)展歷程已有了很大進步：反應模板從DNA擴展到RNA[22，23]，反應速度在環(huán)引物的添加下大幅度提高，反應從單重擴展到雙重[24]，產(chǎn)物的檢測更是由單純的觀察沉淀演變到加入染料[20，21]，目前，用于LAMP反應前加入的核酸染料主要為Calcein，本研究結果將使得染料的選擇更加多樣化。本方法的建立使得基于LAMP技術的檢疫工作更加快速、便捷。相信在不久的將來，LAMP技術通過不斷的完善與發(fā)展，會逐漸成為更適合于臨床和基層應用的一種技術，而且也會逐漸成為核酸研究的一種重要手段。

[1] Allende R，Laegreid W W，Kutish G F，et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus：description of persistence in individual pigs upon experimental infection[J]. J Virol，2000，74（22）：10834-10837.

[2] Israrul H A，Byungjoon K，F(xiàn)ernando A O，et al. Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity，antigenicity，and ability to induce neutralizing antibodies[J]. J Virol，2006，80（8）：3994-4004.

[3] Mardassi H，Mounir S，Dea S. Identification of major differences in the nucleocapsid protein genes of a Québec strain and European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. J gen Virol，1994，75：681-685.

[4] Meng X J，Paul P S，Halburl P G. Molecular cloning and nucleotide sequencing of the 3′-terminal genomic RNA of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. J gen Virol，1994，75：1795-1801.

[5] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al. Loopmediated isothermal amplification of DNA [J]. Nucleic Acids Res，2000，28：E63.

[6] Tomita N，Mori Y，Kanda H，et al. Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）of gene sequences and simple visual detection of products[J]. Nature Protocols，2008，3：877-882.

[7] Zhang J，Zhu J，Ren H，et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplifi cation[J]. Clin Microbiol，2013，51（10）：3250-3256.

[8] Shirato K，Yano T，Senba S，et al. Detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification（RTLAMP）[J]. Virol J，2014，11：139. http：//www.virologyj. com/content/11/1/139.

[9] Iseki H，Alhassan A，Ohta N，et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplifi cation（mLAMP）method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites[J]. J Microbiol Methods，2007，71：281-287.

[10] Goto M，Honda E，Ogura A，et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplifi cation reaction by using hydroxynaphthol blue[J]. BioTechniques，2009，46：167-172.

Effects of Four Nucleic Acid Dyes on Loop-Mediated Isothermal Amplifi cation Assay for Detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Yuan Xiangfen，Wu Shaoqiang，Lin Xiangmei
（Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029，China）

The objective of the study is to establish a loop-mediated isothermal amplifi cation assay（LAMP）for rapid detection of PRRSV and its result determination method based on nucleic acid dye in order to make the LAMP assay more convenient and fast in fi eld application. According to the sequences published in GenBank，a set of primers were designed targeting the conserved region of PRRSV. Through optimizing the LAMP primers and reaction conditions，a LAMP assay for detection of PRRSV was established. Four nucleic acid dyes were compared for their applicability to LAMP. The result showed only Calcein and Dye63 in the four dyes could be used before the LAMP reaction but with certain inhibition to the amplifi cation effi ciency，resulting in 10 minutes reaction delay with Calcein and 5 minutes reaction delay with Dye63. In addition，the detection limit of the LAMP with Dye63 was ten times higher than with Calcein. After the reaction，the fl uorescence intensity was detected by the Microplate Reader and observed with naked eye. The results showed that the negative and positive reaction presented enough differences and Dye63 was suitable for LAMP result determination. RT-LAMP was developed based on Dye63 for detection of PRRSV with simplicity，convenience，sensitivity and direct vision. And Dye63 was expected to be a new dye used in LAMP after Calcein.

PRRSV；loop-mediated isothermal amplifi cation（LAMP)；detection；nucleic acid dye；comparison；determination

S852.651

：A

：1005-944X（2015）02-0072-06

質(zhì)檢公益性行業(yè)專項（201210018）；國家科技支撐計劃課題（2013BAD12B00）

林祥梅