姚 瑤，李 蕾，2，劉楠楠，陳香燕，曹明奮，徐志霞＊

（1.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)院，海南 ?？?71158；2.海南省熱帶動(dòng)植物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口571158）

木麻黃（Casuarina equisetifolia）為雙子葉植物綱木麻黃科木麻黃屬植物，原產(chǎn)于澳大利亞和波利西亞等地［1］。常綠喬木，生長迅速，抗風(fēng)性強(qiáng)，耐鹽堿、貧瘠、干旱土壤。在海南省現(xiàn)有海防林中木麻黃是主要的海防樹種，其面積達(dá)到5萬hm2［2］，這些天然屏障優(yōu)化了沿海地區(qū)人民的生活環(huán)境。但由于木麻黃林樹種單一，人工林群落結(jié)構(gòu)簡單，海南許多地方的木麻黃林木枯梢、斷梢，病蟲害嚴(yán)重，出現(xiàn)了自然衰退現(xiàn)象。木麻黃林出現(xiàn)衰退，林分更新困難的一個(gè)重要原因是木麻黃能夠分泌化感物質(zhì)抑制其自身生長［3-5］。前期已經(jīng)分析了不同林齡木麻黃林地土壤理化性質(zhì)和生化活性以及木麻黃的浸提液對(duì)青皮生長的影響，同時(shí)也完成了木麻黃乙醚浸提液的分離與鑒定［6-11］。研究表明，木麻黃分泌的具有化感效應(yīng)的物質(zhì)殘留于土壤中還會(huì)影響下一代木麻黃生長，從而導(dǎo)致木麻黃二次更新存在障礙。而這種化感效應(yīng)與化感物質(zhì)的產(chǎn)生部位、化感物質(zhì)的積累有關(guān)，會(huì)隨著木麻黃林齡的變化發(fā)生相應(yīng)的變化。為此，對(duì)不同林齡木麻黃根、根際土壤及凋落物中的物質(zhì)進(jìn)行了提取與分離，并用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)其組分進(jìn)行測(cè)定，為木麻黃化感作用的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在海南省?？谑徐`山海岸和桂林洋海岸的木麻黃海防林中，按林齡劃分為幼齡林（林齡5～8a）、中齡林（林齡15～20a）和成熟林（林齡30a及以上）3種林地。分別采集各林齡林地中凋落物、20～50cm的側(cè)根及根際土壤樣本。

1.2 提取方法

按1kg樣品（凋落物、根、土壤）3L蒸餾水的比例進(jìn)行浸泡，常溫下浸泡48h并經(jīng)常翻動(dòng)，用紗布初濾后得到濾液。將所得濾液過0.45μm微孔濾膜，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并結(jié)合冷凍干燥儀除去水分。所得樣品分2組，分別加入1mL正己烷和1mL甲醇溶液萃取，最后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。

1.3 GC-MS測(cè)定

檢測(cè)儀器為GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Thermo Finnigan120150-T230L）。色譜柱為 HP-5MS毛細(xì)管柱，固定相為（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷。用電子轟擊源轟擊，電壓為70eV，掃描范圍m／z 30～450amu，掃描速度0.4s，掃描全程，離子源的溫度為250℃。毛細(xì)管柱的規(guī)格30m×0.01 mm×0.25mm；進(jìn)樣口溫度280℃，柱溫120℃（3 min，以15℃·min-1程序升溫至250℃后，保持3 min；載氣為 He，流量1mL·min-1，進(jìn)樣量1μL。通過面積歸一化法對(duì)鑒定的樣品進(jìn)行分析，檢索數(shù)據(jù)庫為 NIST 08MS Library and AMDIS。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同林齡木麻黃不同部位浸提液中GC-MS分析結(jié)果

對(duì)不同林齡木麻黃不同部位浸提液（正己烷、甲醇萃?。┛傠x子流圖（圖略）中的各色譜峰通過計(jì)算機(jī)自動(dòng)在Willey等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中查找，對(duì)混合物中的組分進(jìn)行了鑒定和峰面積歸一化計(jì)算各組分相對(duì)百分含量。

2.1.1 不同林齡木麻黃不同部位浸提液的2種萃取液檢測(cè)結(jié)果比較 本試驗(yàn)分別采用甲醇和正己烷有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，通過對(duì)GC-MS的結(jié)果鑒定分析，由2種萃取液處理后檢出100多種物質(zhì)，除去一些烷類后相對(duì)含量超過0.1%的物質(zhì)如表1～表6所示。其中酯類檢測(cè)出14種，酮類檢測(cè)出11種，酚類檢測(cè)出6種，酸類檢測(cè)出3種，醇類檢測(cè)出8種，還有一些吡啶、烯烴等物質(zhì)。其中采用正己烷進(jìn)行萃取得到的物質(zhì)種類與含量比用甲醇萃取要少。由甲醇作為萃取液檢測(cè)出的物質(zhì)多為酮類、醇類、酚類，正己烷萃取液中檢測(cè)出的物質(zhì)多為烷類、醇類。

表1 不同林齡木麻黃根的正己烷萃取液中檢測(cè)出物質(zhì)的相對(duì)含量Table 1 The n-hexane extraction of roots of the C.equisetifolia with different ages %

表2 不同林齡木麻黃根的甲醇萃取液中檢測(cè)出物質(zhì)的相對(duì)含量Table 2 The methanol extract of roots of the C.equisetifolia with different ages %

2.2 不同林齡木麻黃不同部位浸提液中共有物質(zhì)的分析

表3 不同林齡木麻黃凋落物的正己烷萃取液中檢測(cè)出物質(zhì)的相對(duì)含量Table 3 The n-hexane extract of litter under the C.equisetifolia with different ages %

除酚類和醇類，試驗(yàn)結(jié)果表明在不同林齡木麻黃的部分樣品中檢測(cè)出一定含量的3，5-二羥基-4，7-二甲氧基黃酮、7，9-二叔丁基-1-氧雜螺（4，5）癸-6，9-二烯-2，8-二酮、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、二苯砜。

表4 不同林齡木麻黃凋落物的甲醇萃取液中檢測(cè)出物質(zhì)的相對(duì)含量Table 4 The methanol extract of litter under the C.equisetifolia with different ages %

表5 不同林齡木麻黃土壤的正己烷萃取液中檢測(cè)出物質(zhì)的相對(duì)含量Table 5 The n-hexane extract of soil under the C.equisetifolia with different ages %

表6 不同林齡木麻黃土壤的甲醇萃取液中檢測(cè)出物質(zhì)的相對(duì)含量Table 6 The methanol extract of soil under the C.equisetifolia with different ages %

2.3 不同林齡木麻黃不同部位浸提液中特有物質(zhì)的分析

在不同林齡木麻黃樣品中鑒定出的特有物質(zhì)主要有52種。在木麻黃的根系及凋落物中均鑒定出25種，其中根系樣品中相對(duì)含量較高的主要有9，9，10-三甲基-9，10-二氫蒽、2-（苯基乙炔基）-吡啶、4-丁氧-1-正丁醇、2-三甲基硅基-1，3-二噻吩等。這幾種物質(zhì)皆在中齡林中檢測(cè)到，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能與植物體內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化以及中齡林中特有微生物的作用有關(guān)。木麻黃凋落物樣品中相對(duì)含量較高的主要有2-丙基十一烷基亞硫酸酯、蒽，9，10-二氫9，9，10三甲基、吡啶、己二酸二辛酯等。木麻黃土壤樣品中檢測(cè)出2種，分別為（Z）-4-硝基-α-（對(duì)硝基苯基）肉桂酸和β-甲基d-呋喃糖苷。

3 結(jié)論與討論

GC-MS技術(shù)應(yīng)用廣泛，具有需樣量小、靈敏度高，能對(duì)待測(cè)組分的功能團(tuán)進(jìn)行有效鑒定等優(yōu)點(diǎn)。李艷賓等利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析出棉稈腐解物的化感成分［12］。曾任森等經(jīng)運(yùn)用GC-MS測(cè)定出蜂蟆菊中的5，22-二烯-3-豆甾醇乙酸脂、十六烯酸甲酯和十八烯酸甲酯3個(gè)化合物的混合物，并鑒定其具有較弱的化感作用［13］。本文通過GC-MS技術(shù)對(duì)不同林齡木麻黃的水浸提液進(jìn)行鑒定分析，檢測(cè)出酸、酯、烷、醛、酮、酰胺及酚類等有機(jī)化合物。對(duì)這些化合物進(jìn)行整理分析，發(fā)現(xiàn)不同林齡木麻黃浸提液中共有的物質(zhì)有7種，主要為2，4-二叔丁基苯酚。目前，對(duì)酚酸類物質(zhì)的化感作用研究較多，秦波［14］等人的研究表明2，4-二叔丁基苯酚對(duì)稗草、水稻、萵苣種子的萌發(fā)以及幼苗生長的綜合抑制作用活性很強(qiáng)。王明道［15］等人通過GC-MS從地黃組織中分離鑒定出2，4-二叔丁基苯酚，并通過驗(yàn)證性試驗(yàn)證明該物質(zhì)是地黃抑制芝麻生長發(fā)育的主要化感物質(zhì)。吳鳳芝［16］等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度的酚酸會(huì)破壞植物葉綠體、線粒體和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，會(huì)破壞根系細(xì)胞核及貯藏組織結(jié)構(gòu)。Roshchi-na［17］等人研究報(bào)道一些多酚類化合物能抑制受體植物SOD和CAT酶活性，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧增多，啟動(dòng)膜脂過氧化，進(jìn)而產(chǎn)生化感作用，抑制植物對(duì)養(yǎng)分的吸收。除2，4-二叔丁基苯酚外，還檢測(cè)出醇類、酮類及酯類等6種共有物質(zhì)。而不同林齡木麻黃浸提液中特有的物質(zhì)檢測(cè)出52種（根系中含有25種、土壤中含有2種、凋落物中含有25種）。

從不同林齡不同部位的浸提液中物質(zhì)的種類數(shù)量和其相對(duì)百分含量來看，中齡林木麻黃凋落物中檢測(cè)出物質(zhì)最為豐富，而在木麻黃中齡林的其他部位浸提液中物質(zhì)種類也是相對(duì)比較多的。這些物質(zhì)的相對(duì)含量較高，說明可能對(duì)木麻黃的自身生長和代謝密切相關(guān)，可能是影響其衰退的潛在因素。它們的相對(duì)含量在不同林齡不同部位的浸提液中是變化的，這與物質(zhì)分泌途徑、微生物作用以及木麻黃自身生長需要有關(guān)，其中微生物的作用是非常重要的。李小容［8］等對(duì)海南島不同林齡的木麻黃林地土壤微生物的功能多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其多樣性是隨林齡的增加而增高的。而不同林齡木麻黃林地的土壤具有特有的微生物，這也是不同林齡木麻黃林地土壤中檢測(cè)出物質(zhì)的種類和相對(duì)含量差別的原來之一。

目前研究數(shù)據(jù)顯示，3種林齡木麻黃根系、根際土壤，凋落物的水浸提液中檢測(cè)到的物質(zhì)已有部分有報(bào)道其對(duì)植物生長有一定的化感效應(yīng)，而有部分物質(zhì)尚未見報(bào)道，但是這幾十種物質(zhì)究竟是否對(duì)木麻黃產(chǎn)生自毒作用和作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

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