王 帥 王鳳榮

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

·研究報告·

心絞痛貼膏穴位貼敷預(yù)處理對急性心肌梗死大鼠血清心肌酶及TNF-α、IL-6的影響*

王 帥 王鳳榮△

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

目的觀察“心絞痛貼膏”穴位貼敷預(yù)處理對急性心梗大鼠的干預(yù)效應(yīng)及可能的作用機制。方法健康Wistar大鼠55只隨機分為正常組、模型組、對照組和治療組，正常組 10只，模型組、對照組和治療組每組15只。在清潔級實驗室以普通飼料飼養(yǎng)。對照組于胸前區(qū)貼硝酸甘油貼膜0.3 mg，治療組予心絞痛貼膏穴位貼敷于心俞、膻中、神闕、后三里穴（每穴0.1 g），每日1次，每穴1貼，維持4~6 h，療程10 d。模型組、對照組、治療組均每日2 mg/kg多點腹腔注射異丙腎上腺素（ISO）10 d。第10日于實驗結(jié)束時，查各組大鼠心電圖，以ST段明顯上抬或下移為造模成功的初步判斷標(biāo)準(zhǔn)，取腹主動脈光鏡下觀察心肌病理學(xué)形態(tài)，檢測大鼠肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）的含量。結(jié)果病理結(jié)果顯示，對照組和治療組心肌細(xì)胞損傷壞死較模型組輕，但也可見少量斷裂、缺損及空白區(qū)著色不均勻出現(xiàn)。模型組心肌細(xì)胞壞死嚴(yán)重。治療組和對照組的心肌酶學(xué)水平、TNF-α、IL-6表達顯著低于模型組（P＜0.01）。結(jié)論心絞痛貼膏穴位貼敷預(yù)處理能夠減輕AMI大鼠心肌損傷壞死程度，并可能通過抑制大鼠TNF-α、IL-6的表達減少炎癥細(xì)胞浸潤，從而起到改善心肌缺血的作用。

心絞痛貼膏 急性心肌梗死 心肌酶學(xué) 腫瘤壞死因子 白介素6

急性心肌梗死（AMI）是嚴(yán)重威脅人類健康的心血管系統(tǒng)疾病的急危重癥，其死亡率高，且常引發(fā)心力衰竭、心律失常等嚴(yán)重并發(fā)癥，直接導(dǎo)致患者生存質(zhì)量下降，經(jīng)濟負(fù)擔(dān)顯著增加。藥物治療、介入治療、外科搭橋能迅速改善血供、緩解心絞痛發(fā)作，方法較為成熟。但中藥穴位貼敷療法做為一種冠心病急性心肌缺血輔助治療方式，在臨床中也得到了廣泛認(rèn)可和應(yīng)用，是融合中醫(yī)整體觀念、經(jīng)絡(luò)腧穴理論，集中藥的藥理作用和穴位刺激為一體，是“內(nèi)病外治”的具體體現(xiàn)。臨床發(fā)現(xiàn)，中藥心絞痛貼膏穴位貼敷具有良好的改善心絞痛的作用。因此，本研究主要通過觀察心絞痛貼膏穴位貼敷預(yù)處理對AMI大鼠的干預(yù)作用，對其可能的作用機制進行初步探討?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠55只，體質(zhì)量（250±50）g，購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。動物許可證號：SCXK-（軍）2007-004。

1.2 動物分組 將健康Wistar大鼠55只按隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、模型組、對照組和治療組，正常組10只，模型組、對照組和治療組每組15只。在清潔級實驗室飼養(yǎng)，以普通飼料喂養(yǎng)10 d。

1.3 實驗藥物 心絞痛貼膏藥物組成：川芎45 g，丹參45 g，薄荷腦25 g，麝香1.0 g，蘇合香20 g，檀香8 g，小茴香15 g，冰片10 g，制乳香（燈芯制）20 g，制沒藥（燈芯制）20 g，香附20 g，延胡索20 g，生姜汁10 g。生姜汁為鮮姜直接榨汁過濾所得，每貼含生藥量0.1 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供。硝酸甘油貼片（廣州白云山制藥股份有限公司生產(chǎn)），每貼含硝酸甘油5 mg。

1.4 主要試劑 熒光定量PCR引物購自TaKaRa寶生物工程有限公司；熒光RT-PCR試劑由北京全氏金生物技術(shù)有限公司提供；異丙腎上腺素從遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院購買；水合氯醛由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供；透射電鏡試劑2.5%戊二醛、1%鋨酸、環(huán)氧樹脂EPON812由中國醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供；免疫組化一抗、二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 主要儀器及設(shè)備 JEM-100CX型透射電子顯微鏡 （日本電子公司），LKBⅤ型超薄切片機 （瑞典LKB公司）；石蠟切片機（萊卡），奧林巴斯BX51顯微鏡；貝克曼全自動生化儀（上海醫(yī)用儀器設(shè)備廠）；心電圖機（GE公司MAC1200ST）；精密輪轉(zhuǎn)切片機，RM2135，德國LEICA；系統(tǒng)生物顯微鏡，BX50F4，日本OLYPUS；漂烘處理儀，ZMN-6802，常州市華利電子公司；電熱恒溫干燥箱，GZX-DH.400-S-Ⅱ，上海躍進醫(yī)療儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱，101-0A，天津泰斯特儀器有限公司；超純水機，Milli-Q，美國MILLIPORE；電冰箱，BCD-205F，HAIER。

1.6 實驗方法 模型組、對照組、治療組均每日2 mg/kg多點腹腔注射異丙腎上腺素（ISO）10 d。第10日實驗結(jié)束時，予3.3 mL/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉。將麻醉后大鼠仰位固定于鼠板上，將針狀電極插入大鼠四肢皮下，以50 mm/s的走紙速度，靈敏度2記錄Ⅱ?qū)?lián)的心電圖，出現(xiàn)以下陽性為心肌缺血，表示造模成功：J點上升或下降≥0.1 mV；T波低平（下降＞50%）倒置；T波高聳超過同導(dǎo)聯(lián)的R波的1/2；心律不齊、心動過速、早搏或其他心律失常。大鼠心電圖改變具備以上條件之一者即可判斷為心肌缺血陽性。對照組于胸前區(qū)貼硝酸甘油貼膜0.3 mg，治療組于心俞、膻中、神闕、后三里穴貼敷心絞痛貼膏（每穴0.1 g）。貼敷時間為每日6 h，共10 d。第10日將各組存活動物用水合氯醛皮下注射麻醉（藥量300 mg/kg），麻醉成功后查心電圖，對各組動物從腹主動脈采血、取心臟。

1.7 觀察指標(biāo) 一般情況：每日觀察動物進食和行為變化，定期稱體質(zhì)量。心電圖檢測：各組動物入組時及用藥第10日將動物麻醉后查心電圖，觀察ST段抬高或下移水平及心律變化。光鏡病理觀察：實驗結(jié)束時，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取出腹主動脈，光鏡下HE染色病理觀察。免疫組化法測定腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL-6）水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以（±s）表示，各組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way Anoay），采用LSD法作組間的多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 使用ISO后有部分動物陸續(xù)死亡，其中模型組死亡4只，對照組死亡3只，治療組死亡2只。符合AMI死亡率高的特點。查心電圖示ST段無變化的模型組1只，對照組1只，治療組2只。心電圖示心律失常的對照組1只，治療組1只。剔除上述動物，只保留ST段明顯上抬或下移的動物。

2.2 各組大鼠光鏡病理結(jié)果正常組：心肌細(xì)胞排列緊湊規(guī)整，閏盤、橫紋清晰，橫縱切面形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，心肌細(xì)胞核位于心肌細(xì)胞中央，形態(tài)、大小正常，肌原纖維排列有序，無斷裂及缺損，無空白區(qū)（見圖1）。模型組：心肌細(xì)胞交織成網(wǎng)，看不到橫紋，心肌細(xì)胞核、心肌纖維排列紊亂，可見斷裂及缺失，心肌細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)空白區(qū)，異染色質(zhì)呈現(xiàn)團塊狀，相鄰細(xì)胞閏盤間隙增寬（見圖2）。對照組：心肌細(xì)胞排列較規(guī)整，可見到橫紋，大部分心肌細(xì)胞核形態(tài)、大小基本正常，位于心肌細(xì)胞邊緣，肌原纖維排列較有序，仍可見斷裂、缺損及空白區(qū)著色不均勻（見圖3）。治療組：心肌細(xì)胞排列較規(guī)整，可見橫紋，閏盤清晰，心肌細(xì)胞核仍固縮呈圓形，位于心肌細(xì)胞邊緣，肌原纖維排列較有序，仍可見有斷裂、缺損及空白區(qū)（見圖4）。

圖1 正常組（×10）

圖2 模型組（×10）

圖3 對照組（×10）

圖4 治療組（×10）

2.3 各組大鼠心肌酶學(xué)指標(biāo)比較 見表1。模型組、對照組和治療組肌酸肌酶（CK）水平均較正常組高，與正常組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。對照組和治療組CK水平較模型組低（P＜0.01）；對照組和治療組CK水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。模型組、對照組肌酸肌酶同工酶 （CK-MB）水平較正常組高 （P＜0.01）。治療組CK-MB水平較正常組高（P＜0.05）。對照組、治療組CK-MB較模型組低 （P＜0.05或P＜0.01）；治療組CK-MB水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組乳酶脫氫酶（LDH）水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠ST段抬高或下移水平、CK、CK-MB、LDH水平比較（±s）

表1 各組大鼠ST段抬高或下移水平、CK、CK-MB、LDH水平比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n S T段抬高或下移（m V） C K（I U / L） C K -M B（I U / L） L D H（I U / L）正常組 1 0模型組 1 5對照組 1 5 0 ± 0 6 0 7 ± 3 4 7 . 5 2 3 3 1 0 . 9 0 ± 1 9 0 . 4 9 6 3 0 9 ± 1 9 3 . 1 1 9 0 . 4 5 ± 0 . 1 6**1 9 3 3 . 6 0 ± 4 0 4 . 3 5 4**9 3 5 . 6 0 ± 1 8 4 . 7 7 3**5 2 3 . 3 ± 1 3 8 . 9 9 6 0 . 1 7 ± 0 . 0 8**△△1 2 1 7 . 3 0 ± 3 7 9 . 4 6 7**△△6 8 2 . 1 0 ± 1 7 0 . 9 9 7*△5 1 5 . 1 ± 1 9 1 . 8 3 4治療組 1 5 0 . 1 7 ± 0 . 0 9**△△1 1 8 4 . 1 0 ± 2 5 4 . 6 2 9**△△6 1 2 . 9 0 ± 1 7 0 . 7 6 7*△△5 3 1 . 7 ± 2 5 1 . 8 3 8

2.4 各組大鼠 TNF-α、IL-6積分光密度水平比較見表2，圖5~12。模型組、對照組TNF-α較正常組高，對照組和治療組TNF-α低于模型組（P＜0.05），治療組低于對照組，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），治療組與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組、對照組、治療組IL-6較正常組高（P＜0.05），對照組和治療組IL-6低于模型組（P＜0.05），治療組與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠TNF-α、IL-6積分光密度比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠TNF-α、IL-6積分光密度比較（pg/mL，±s）

組別 n T N F -α I L -6正常組 1 0 8 . 6 2 3 7 ± 6 . 3 2 6 1 . 8 5 8 5 ± 1 . 7 8 8 1模型組 1 5 2 3 . 4 6 2 8 ± 1 . 0 2 2 6*4 . 8 2 7 9 ± 2 . 6 0 9 4*對照組 1 5 1 5 . 9 6 1 3 ± 1 . 3 4 8 5*△3 . 8 4 1 4 ± 1 . 9 1 9 5*△治療組 1 5 8 . 1 5 8 7 ± 3 . 2 0 0 2*△3 . 6 3 1 7 ± 1 . 9 0 7 9*△

圖5 正常組TNF-α（×20）

圖6 模型組TNF-α（×20）

圖7 對照組TNF-α（×20）

圖8 治療組TNF-α（×20）

圖9 正常組IL-6（×20）

圖10 模型組IL-6（×20）

圖11 對照組IL-6（×20）

圖12 治療組IL-6（×20）

3 討 論

穴位貼敷療法是現(xiàn)代中藥透皮給藥的主要方式之一，藥物借由經(jīng)絡(luò)的傳輸作用將有效成分輸送且作用于所系臟腑，調(diào)節(jié)人體臟腑功能，達到預(yù)防和治療疾病的目的，這也成為了“病在內(nèi)者可取之于外”的理論基礎(chǔ)。

本研究選取的心俞、膻中穴均為心、心包經(jīng)俞募配穴，主治心痛、胸悶等心疾，為治療心臟疾病的要穴；膻中為心包募穴，八會穴之氣穴，利上焦、寬胸膈、降氣通絡(luò)主治胸悶、心痛等胸中氣機不暢的病證。俞募相配，有疏通心、心包經(jīng)氣血作用，為治心之要穴；氣海為肓之原穴，主治虛脫乏力等氣虛之證；足三里為足陽明經(jīng)之合穴，主治虛勞諸癥。配合中藥外敷，共奏活血化瘀，育陰潛陽、養(yǎng)心益氣，通經(jīng)活絡(luò)之功。川芎為方中君藥，辛香走竄而行氣，活血祛瘀以止血，上行頭目而祛風(fēng)，下入血海以調(diào)經(jīng)。丹參祛瘀止痛、清心除煩、養(yǎng)血安神；薄荷清利頭目；麝香開竅醒神、活血散結(jié)；蘇合香開竅、止痛；冰片通諸竅；乳香、沒藥用于一切氣滯血瘀之痛證，諸藥共奏活血止痛、溫通心絡(luò)、芳香開竅之功?，F(xiàn)代研究亦證實，川芎中所含有的川芎嗪、阿魏酸鈉可擴張冠狀動脈，增進冠脈流量，能降低血小板表面活性，抑制血小板聚集，抗血栓形成，改善心臟微循環(huán)并降低心肌耗氧量。緩解心絞痛，并具有抗血栓形成作用。丹參能擴張冠狀動脈，增加冠脈流量，減輕心肌缺血的損傷程度，加快心肌缺血損傷的恢復(fù)，縮小心肌梗死范圍，降低血液黏稠度，抑制血小板聚集和黏附性，抗血栓形成。冰片具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛作用，對AMI的麻醉犬產(chǎn)生與冠心蘇合丸類似的作用，能使冠狀竇血流量回升，減慢心率，降低心肌氧耗量，提示冰片有利于冠脈痙攣的防治，并可減輕缺血引起的心肌損傷。蘇合香提取物能減慢心率、改善冠脈流量和降低心肌耗氧，抗血小板聚集。高社光等［1］觀察到，麝香通痹膏貼敷膻中、內(nèi)關(guān)穴對130例不同類型的冠心病心絞痛患者的心絞痛、心電圖有明顯改善作用。戴居云等［2］在65例冠心病患者中觀察了丹參益心帖貼敷心俞、膻中等穴對心絞痛、心悸、胸悶、氣短等臨床癥狀和心電圖的作用，并以硝酸甘油貼敷、口服復(fù)方丹參片作為對照，結(jié)果表明，上述藥物穴位貼敷均可緩解心絞痛，改善上述臨床癥狀和缺血性心電圖。

冠狀動脈粥樣斑塊破裂形成血栓是AMI的主要病理基礎(chǔ)，雖然對動脈粥樣硬化（AS）的病因及發(fā)病機制目前仍未完全闡明，但脂質(zhì)代謝異常、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其功能異常、血管平滑肌細(xì)胞增生、遷移和表型改變是AMI等AS產(chǎn)生的重要因素。本研究僅圍繞AMI過程中的炎癥機制，探討心絞痛貼膏外治法防治AMI的作用機制。TNF-α是重要的炎性因子，TNF-α作為IL-6的上游激活物，誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，IL-6進一步參與炎癥反應(yīng)。IL-6不僅參與AMI后的炎癥反應(yīng)，還有強大的增加血小板作用，是促凝因子，而且直接影響C反應(yīng)蛋白水平，加重炎癥反應(yīng)［3］。另外，TNF-α和IL-6還通過干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，使炎癥細(xì)胞滲透到血管外，向受損心肌聚集［4］。本研究結(jié)果顯示，治療組和對照組CK、CK-MB水平較模型組低，提示心絞痛貼膏和硝酸甘油貼具有較好的降低CK、CK-MB作用，模型組TNF-α和IL-6較正常組高，符合AMI后TNF-α和IL-6的改變，對照組和治療組TNF-α和IL-6低于模型組，且治療組TNF-α低于對照組。研究表明，心絞痛貼膏與硝酸甘油貼改善AMI心肌酶學(xué)作用相近，但在降低TNF-α水平及抑制IL-6方面優(yōu)于硝酸甘油貼，或作用與其相當(dāng)，尤其以早期用藥效果為佳。穴位貼敷防治急性心肌缺血的機理可能與抑制主動脈炎性因子的表達有關(guān)，至于局部穴位貼敷抑制動脈粥樣硬化、降低血脂的具體作用機制還需要深入研究。

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［2］ 戴居云，王子芳，李鼎.丹芪益心帖治療冠心病心絞痛臨床療效觀察［J］.中國針灸，1997，17（10）：588.

［3］ Souza JR，Oliveira RT，Blotta MH，et al.Serum levels of interl eukin-6（IL-6），int erleu kin-18 （IL-18）and C-reactive protein（CRP）in patient swith type-2 diabetes and acut ecoronary syndrome without ST-segment elevation［J］.Arq Bras Cardiol，2008，90（2）：86-90.

［4］ Min N，Paul L，Peter L.Inflammatory cy tokines and postmyocardial infarction remodeling［J］.Circ Res，2004，94：1543-1545.

Experimental Study on the Influence of Angina Pectoris Patch Acupoint Application Pretreatment on A-cute Myocardial Infarction in Rats in Serum Myocardial Enzyme，TNF-α，and IL-6

WANG Shuai，WANG Fengrong. Hospital Affiliated to Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning Shenyang 110032，China

Objectives：To discuss the effect of angina pectoris patch sticking preconditioning on acute myocardial infarction in rats and its possible mechanism.Methods：55 healthy Wistar rats were randomly divided into the normal group，model group，control group and treatment group，10 rats in the normal group，15 rats in the model group，control group and treatment group，fed with normal diet in a clean laboratory.The control group patched nitroglycerin 0.3 mg on the chest area，while the treatment group were treated with angina pectoris plaster acupoint application in Xinshu，Tanzhong，Shenque，after three points（each point 0.1 g），once a day，every point 1 sticker，maintaining 6 h.The treatment lasted for10 days.The model group，the control group，the treatment group received daily multipoint intraperitoneal injection of isoproterenol（ISO）2 mg/kg for 10 days.On the tenth day at the end of experiment，the ECG of the rat was examined，and the success of modeling was preliminary judged by ST segment elevation or depression，and the myocardial pathological morphology of abdominal aorta was observed under light microscope to observe，detecting the content of rat CK，CK-MB，LDH，TNF-alpha，IL-6.Results：The pathological results showed that myocardial cell damage and necrosis of the treatment group and the control group was lighter than that of the model group，but a small amount of fault was obvious，and defect and blank region coloring appeared.Myocardial cell necrosis in the Model group was serious.The myocardial enzyme levels of TNF-alpha，IL-6 of the treatment group and control group were significantly lower than those of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Angina plaster acupoint application of pretreatment can reduce the degree of necrosis of myocardial injury in AMI rats，and may inhibit the TNF-alpha，the expression of IL-6 of the rat，reducing the infiltration of inflammatory cells，so as to improve myocardial ischemia.

Angina plaster；Acute myocardial infarction；Myocardial enzyme；Tumor necrosis factor；Interleukin 6

文獻標(biāo)志碼： 文章編號：1004-745X（2015）06-0974-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.013

2015-03-20）

遼寧省科技計劃項目（20100225034）

△通信作者（電子郵箱：wfr925@126.com）