陳興泳 汪銀洲 汪效松 雷惠新 唐榮華 張 旭＊

（1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福建省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 福州350001；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 武漢430030）

神經(jīng)炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一［1］，最近研究表明免疫蛋白酶體與中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［2］。本研究利用SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，探討免疫蛋白酶體LMP2和LMP7與神經(jīng)炎癥反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性，初步了解免疫蛋白酶體在局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用。

材料和方法

1.主要儀器和試劑

MCAO線栓（北京沙東生物技術(shù)公司，中國），CM1900型冰凍切片機(jī)（Leica，德國），組織熒光顯微鏡（Olympus，日本），Soniprep 150超聲波細(xì)胞破碎儀（Sanyo，日本），Millpore PVDF膜（Millpore，美國），Mini Trans－Blot型電轉(zhuǎn) 設(shè) 備 （Bio－Rad，美國），PBS（武漢博士德生物有限公司，中國），10%封閉用山羊血清（KPL，美國），哺乳動(dòng)物組織蛋白裂解液（Pierce，美國），ECL發(fā)光液（Millpore，美國），rabbit anti－LMP2，rabbit anti－LMP7 （均購買 Abcam，Cambridge，UK），mouse anti－Neu N，mouse anti－OX－42 （Millipore，美 國），goat anti－IL－1β，goat anti－TNF－α（R＆D Systems，Inc.美 國），mouse anti－GFAP，NF－κB p65 mouse（Cell Signaling Technology，美國），mouse monoclonal anti－βactin （Proteintech Group Inc.，美 國），F(xiàn)ITC－goat anti－rabbit IgG antibodies，Alexa Fluor?555 conjugated goat anti－mouse IgG （H＋L），F(xiàn)（ab＇）2 Fragment，F(xiàn)ITC－donkey anti－rabbit IgG，Cy3－donkey anti－goat IgG），horseradish peroxidase－conjugated goat anti－mouse IgG （EarthOx，美 國） ，horseradish peroxidase－conjugated goat anti－rabbit IgG antibodies（Cell Signaling Technology，美國），horseradish peroxidase－conjugated rabbit anti－goat IgG antibodies（Invitrogen，美國），DAPI（Sigma，美國）。

2.動(dòng)物分組和大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型構(gòu)建

Sprague－Dawley（SD）大鼠，體重250 g左右，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分為：假手術(shù)組（shamoperated group）（簡(jiǎn)稱sham 組）、腦梗死組（middle cerebral artery occlusion，MCAO）（簡(jiǎn)稱mcao組），每組10只。參照Longa［3］方法建立腦缺血1 h再灌注時(shí)間72 h的MCAO模型，具體步驟簡(jiǎn)要闡述如下：10%水合氯醛腹腔注射麻醉（350 mg／kg），術(shù)中維持體溫37℃左右。將大鼠仰臥位固定在手術(shù)板上，消毒皮膚，鋪蓋無菌洞巾，取頸部正中切口約2.5 cm；鈍性分離筋膜、肌肉，小心分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈在靠近頸總動(dòng)脈分叉處，隨后在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端靠近頸總動(dòng)脈分叉處1.5 cm處結(jié)扎頸總動(dòng)脈。用眼科剪將距離頸總動(dòng)脈分叉處1 cm的頸總動(dòng)脈剪一小口，插入線栓（直徑約為0.204 mm的尼龍線，頭端打磨呈球形且用多聚賴氨酸包被），放開頸內(nèi)動(dòng)脈微動(dòng)脈夾。將線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈輕柔插入長度自頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處約18－20 mm，阻斷大腦中動(dòng)脈的血流。固定線栓，縫合肌肉、皮膚，注意保溫。再灌注：缺血60 min后不完全拔出線栓，恢復(fù)血流。模型成功判斷標(biāo)準(zhǔn)采用Longa［3］0－4級(jí)評(píng)分法，1分≤神經(jīng)功能缺損評(píng)分≤3分的大鼠選入組。假手術(shù)組大鼠給予類似手術(shù)操作，插入線栓長度為10 mm，不阻塞大腦中動(dòng)脈。

3.組織免疫熒光染色方法

將時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)大鼠用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉后，灌注4%多聚甲醛，充分暴露并剝離腦組織，取自額極起4－11 mm之間的腦組織，置于4%多聚甲醛于4℃冰箱固定24－48 h。將固定好的腦組織依次放入20%、30%蔗糖（含體積比4%丙三醇）脫水直至沉底。在Leica冰凍切片機(jī)內(nèi)用OTC膠包埋腦組織，自前段大約視交叉水平開始，行10 μm厚連續(xù)冠狀切片，使切片貼在玻片上。用0.01 mol／L PBS振蕩清洗3次，每次5 min。含0.25%Trixton－100的0.01 mol／L PBS透膜。微波抗原修復(fù)，正常山羊血清或者1%BSA（依據(jù)抗體不同）室溫下封閉 1 h。 分 別 滴 加 下 列 一 抗：rabbit anti－LMP7（1∶500），rabbit anti－LMP2（1∶500），mouse anti－NeuN（1∶400），mouse anti－GFAP（1∶1000），mouse anti－OX－42（1∶300），mouse NF－κB p65（1∶50），goat anti－TNF－α（1∶500），goat anti－IL－1β（1∶500），放在濕盒中4℃孵育過夜。次日取出切片放入0.01 mol／L PBS振蕩清洗，滴加相匹配的下列熒光二抗：FITC－goat anti－rabbit IgG antibodies（1∶200），Alexa Fluor？倕555 conjugated goat anti－mouse IgG（H＋L），F(xiàn)（ab＇）2 Fragment（1∶1000），F(xiàn)ITC－donkey antirabbit IgG（1∶100），Cy3－donkey anti－goat IgG（1∶100），室溫避光孵育1 h。滴加DAPI（1∶1000）復(fù)染。滴加抗熒光淬滅劑Pro Long?Gold，蓋玻片封片，避光儲(chǔ)存于濕盒。熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)／發(fā)射波長為488／525 nm的FITC呈綠色熒光，激發(fā)／發(fā)射波長為550／565 nm的Cy3、Alexa Fluor?555呈紅色熒光。陰性對(duì)照以100μl PBS代替一抗，其余處理步驟同上。參照參考文獻(xiàn)［4］方法統(tǒng)計(jì)400×視野下熒光陽性細(xì)胞，每張切片取3個(gè)互不重疊部位，每個(gè)標(biāo)本取3張切片，用Image－Pro Plus軟件分析，取平均值。

4.Western blot

將凍于液氮中的缺血周圍組織和假手術(shù)組腦組織按照1∶3（wt／vol）加入哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞裂解液，同時(shí)加入體積比100∶1的蛋白酶抑制劑，于冰上用充分研磨和超聲裂解，在4℃低溫離心機(jī)15000 r／min離心30 min，取上清液置于另一1.5 ml離心管中，BCA法蛋白定量。每道30μg蛋白上樣，在10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，依相對(duì)分子質(zhì)量大小切取條帶，室溫下封閉1 h。然后分別加入TBST稀釋的一抗，4℃孵育過夜（＞12 h）。次日，洗膜后分別加入相對(duì)應(yīng)的二抗，室溫下孵育1－2 h。各指標(biāo)一抗稀釋倍數(shù)、二抗稀釋倍數(shù) 如 下：rabbit anti－LMP7（1∶1000），rabbit anti－LMP2（1∶2500），mouse NF－κB p65（1∶500），goat anti－TNF－α（1∶5000），rabbit anti－IL－1β（1∶1000），mouse monoclonal anti－β－actin （1∶3500），horseradish peroxidase－conjugated goat anti－mouse IgG（1∶6000），horseradish peroxidase－conjugated goat anti－rabbit IgG antibodies（1∶3000），horseradish peroxidase－conjugated rabbit anti－goat IgG antibodies（1∶3000）。ECL顯色。曝光，顯影，定影，掃描圖片。用Image J軟件進(jìn)行分析，每個(gè)蛋白條帶都有一個(gè)光密度值。將各組的目的蛋白光密度值除以β－actin光密度值，即各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較選用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.局灶性腦缺血再灌注后免疫蛋白酶體LMP2表達(dá)變化

免疫熒光顯示，MCAO組缺血側(cè)皮層LMP2熒光陽性細(xì)胞數(shù)量和強(qiáng)度明顯高于假手術(shù)組；LMP2表達(dá)彌散分布在胞漿、核周和核內(nèi)（圖1A）；LMP2陽性細(xì)胞大部分與GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞共定位，小部分與OX42陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞／巨噬細(xì)胞共定位，個(gè)別NEUN陽性的神經(jīng)元似乎與LMP2熒光陽性細(xì)胞具有共定位（圖1B－D）。Western blot結(jié)果表明：與假手術(shù)組比較，mcao組梗死側(cè)皮層和基底節(jié)區(qū)LMP2蛋白水平升高，約為假手術(shù)組的7倍（圖1E）（P＜0.001）。

2.局灶性腦缺血再灌注后免疫蛋白酶體LMP7表達(dá)變化

免疫熒光顯示，假手術(shù)組大鼠皮層只有極個(gè)別微弱的LMP7熒光陽性細(xì)胞，mcao組缺血側(cè)皮層LMP7熒光陽性細(xì)胞數(shù)量和強(qiáng)度顯著地高于假手術(shù)組，LMP7表達(dá)彌散分布在胞漿、核周和核內(nèi)（圖2A）。LMP7陽性的細(xì)胞大部分與OX42陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞／巨噬細(xì)胞共定位，少部分與GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，與NEUN陽性的神經(jīng)元無明顯共定位（圖2B－D）。Western blot結(jié)果表明：與假手術(shù)組比較，mcao組梗死側(cè)皮層和基底節(jié)區(qū)LMP7蛋白水平升高，約為假手術(shù)組的9倍（圖2E）（P＜0.001）。

3.局灶性腦缺血再灌注后NF－κB的變化及與免疫蛋白酶體的關(guān)系

Mcao組梗死側(cè)皮層和基底節(jié)區(qū)NF－κB蛋白表達(dá)升高，約為假手術(shù)組的5倍（圖3A）（P＜0.001）。免疫熒光雙標(biāo)顯示NF－κB與LMP2、LMP7有部分的共定位（圖3B）。

4.局灶性腦缺血再灌注后IL－1β的變化及與免疫蛋白酶體的關(guān)系

Mcao組梗死側(cè)皮層和基底節(jié)區(qū)IL－1β蛋白表達(dá)升高，大約是假手術(shù)組的6倍（P＜0.001，圖4A）。免疫熒光雙標(biāo)顯示IL－1β分別與 LMP2、LMP7具有一定程度的共定位（圖4B）。

5.局灶性腦缺血再灌注后TNF－α的變化及與免疫蛋白酶體的關(guān)系

Mcao組梗死側(cè)皮層和基底節(jié)區(qū)TNF－α蛋白表達(dá)升高，大約是假手術(shù)組的4倍（P＜0.001，圖5A）。免疫熒光雙標(biāo)顯示TNF－α分別與LMP2、LMP7具有一定程度的共定位（圖5B）。

討 論

研究利用SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)：①局灶性腦缺血再灌注后可誘導(dǎo)上調(diào)LMP2和LMP7表達(dá)，尤其在梗死灶周邊的皮層和紋狀體區(qū)；②腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞、活化的小膠質(zhì)細(xì)胞／巨噬細(xì)胞分別是LMP2和LMP7最主要的細(xì)胞來源；③LMP2和LMP7與核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB、炎癥因子TNF－α、IL－1β具有一定程度上的細(xì)胞共定位；④腦缺血再灌注后LMP2和LMP7蛋白表達(dá)與NF－κB、TNF－α、IL－1β的蛋白表達(dá)趨勢(shì)具有一致性。因此，推測(cè)免疫蛋白酶體可能參與缺血性腦卒中后神經(jīng)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)，在腦缺血再灌注損傷中起著重要的作用。

20S蛋白酶體組成性表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，又稱組成性20S蛋白酶體或者標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶體，其結(jié)構(gòu)不是一成不變的，在IFN－γ［5］、缺血［6］、氧化應(yīng)激［7］、炎癥反應(yīng)［8］等刺激誘導(dǎo)下，其β亞單位的β1、β2和β5可相應(yīng)被 LMP2（β1i）、MECL－1（β2i）和 LMP7（β5i）取代，組裝成新的20 S蛋白酶體，因?yàn)長MP2、MECL－1和LMP7能夠增強(qiáng)蛋白酶體產(chǎn)生與主要組織相容性抗原（MHC－1）相結(jié)合多肽的能力，新形成的蛋白酶體又稱免疫蛋白酶體。最近研究表明免疫蛋白酶體與中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞，甚至神經(jīng)元在各種因素刺激后可表達(dá)免疫蛋白酶體，這與其功能相適應(yīng)的。對(duì)急性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，免疫蛋白酶體LMP2、LMP7和MECL1不僅在外周器官組織肝臟、脾臟表達(dá)增多，而且腦內(nèi)表達(dá)也上調(diào)［2］?；蚯贸齃MP7不僅降低了腦LMP2和MECL1蛋白表達(dá)，而且明顯緩解顱內(nèi)感染癥狀，這提示LMP7是免疫蛋白酶體功能完整性重要部分，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［2］。本研究觀察到局灶性腦缺血再灌注后梗死灶周邊腦組織存在炎癥反應(yīng)特征，炎癥因子IL－1β、TNF－α上調(diào)表達(dá)。更進(jìn)一步，本研究發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血再灌注后誘導(dǎo)免疫蛋白酶體上調(diào)表達(dá)，LMP2主要來源于GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而LMP7大部分來源于OX42陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞／巨噬細(xì)胞，這些結(jié)果表明免疫炎癥相關(guān)的細(xì)胞是免疫蛋白酶體LMP2和LMP7的最主要來源細(xì)胞。另有研究發(fā)現(xiàn)C57BL／6小鼠短暫性腦缺血再灌注后LMP2和LMP7表達(dá)定位于NEUN陽性的神經(jīng)元。而在肌萎縮側(cè)索硬化大鼠模型中，LMP7主要表達(dá)在GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和CD68陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞，少量與NEUN陽性的神經(jīng)元共定位。可見，目前對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫蛋白酶體表達(dá)的細(xì)胞來源還缺乏一致性，研究的差異可能與各自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、模型設(shè)計(jì)和相關(guān)抗體不同有關(guān)。

卒中后神經(jīng)炎癥加重了腦缺血再灌注繼發(fā)腦損害，這涉及許多復(fù)雜的病理生理機(jī)制，其中可能通過活化炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子如NF－κB釋放出一系列炎癥物質(zhì)如IL－1β和TNF－α、粘附分子、趨化因子、各種基質(zhì)金屬蛋白酶等介導(dǎo)“血管神經(jīng)單元”損傷［9］。既往研究表明免疫蛋白酶體與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后腦免疫炎癥相關(guān)細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞和活化小膠質(zhì)細(xì)胞是免疫蛋白酶體LMP2和LMP7的最主要來源細(xì)胞，而且，LMP2和LMP7分別與 NF－κB、IL－1β和 TNF－α不僅具有一定程度上細(xì)胞來源共定位，而且在蛋白水平變化上也具有相似的時(shí)間相關(guān)性變化趨勢(shì)。這些結(jié)果高度提示免疫蛋白酶體可能通過調(diào)控NF－κB的活化從而影響NF－κB通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。既往卒中動(dòng)物模型研究表明［11］，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑如PS519具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，降低梗死體積，改善卒中預(yù)后，機(jī)制包括抑制炎癥細(xì)胞的活化和浸潤、下調(diào)炎癥基因轉(zhuǎn)錄和炎癥因子產(chǎn)生［12］。然而，廣譜的蛋白酶抑制劑如 MLN519／PS519，在抑制炎癥基因同時(shí)也抑制了一些保護(hù)性基因作用。例如，NF－κB在缺血性卒中具有雙重作用，抑制NF－κB活性減少炎癥因子產(chǎn)生同時(shí)也下調(diào)了某些抗凋亡基因表達(dá)［13］，持續(xù)抑制蛋白酶體活性，可能導(dǎo)致免疫功能持續(xù)低下，也不利于卒中的康復(fù)［14］。研究推測(cè)如果有一種針對(duì)免疫蛋白酶體LMP7或者LMP2的高度特異選擇性蛋白酶抑制劑能夠運(yùn)用于卒中治療，取得確切的神經(jīng)保護(hù)作用而無明顯的副作用，這將為卒中患者帶來福音。

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圖 版 說 明

圖1 MCAO大鼠腦免疫蛋白酶體LMP2表達(dá)和細(xì)胞定位。標(biāo)尺＝50μm

圖2 MCAO大鼠腦免疫蛋白酶體LMP7表達(dá)和細(xì)胞定位。

標(biāo)尺＝50μm

圖3 MCAO大鼠腦NF－κB表達(dá)和細(xì)胞定位。標(biāo)尺＝50μm

圖4 MCAO大鼠腦IL－1β表達(dá)和細(xì)胞定位。標(biāo)尺＝50μm

圖5 MCAO大鼠腦TNF－α表達(dá)和細(xì)胞定位。標(biāo)尺＝50μm

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression and cellular localization of LMP2 in the brains of MCAO rats.Scale bar＝50μm。

Fig.2 Expression and cellular localization of LMP7 in the brains of MCAO rats.Scale bar＝50μm。

Fig.3 Expression and cellular localization of NF－κB in the brains of MCAO rats.Scale bar＝50μm。

Fig.4 Expression and cellular localization of IL－1βin the brains of MCAO rats.Scale bar＝50μm。

Fig.5 Expression and cellular localization of TNF－αin the brains of MCAO rats.Scale bar＝50μm。