王萱 易寰 劉佳 李敏 彭福華

基礎(chǔ)研究論著

慢病毒介導(dǎo)BTLA轉(zhuǎn)染未成熟樹突狀細(xì)胞的研究

王萱 易寰 劉佳 李敏 彭福華

目的 探討構(gòu)建攜帶B和T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA）基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染未成熟樹突狀細(xì)胞（DC）的可行性。方法根據(jù)GeneBank公布的小鼠BTLA的mRNA序列構(gòu)建ORF慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，合成BTLA基因的重組慢病毒載體。原代分離培養(yǎng)CL57／BL小鼠骨髓來源的未成熟DC，用包含BTLA基因的重組慢病毒載體以感染復(fù)數(shù)為15轉(zhuǎn)染至未成熟DC。采用免疫熒光、反轉(zhuǎn)錄PCR檢測BTLA基因的表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建有活性的慢病毒載體LPP-Mm26645-Lv203-400，慢病毒滴度為3.25×109TU／ml。以重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染未成熟DC 96 h后在熒光倒置顯微鏡下可觀察到被感染的陽性細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄PCR檢測到感染的DC中BTLA基因的表達(dá)量比未感染的DC的表達(dá)量高（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功。結(jié)論構(gòu)建攜帶BTLA基因的慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染BTLA至小鼠骨髓來源的未成熟DC。

B和T淋巴細(xì)胞衰減因子；慢病毒；樹突狀細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)染

B和T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA）是免疫球蛋白超家族的一員，是CD28家族被發(fā)現(xiàn)的第3個抑制性分子，與相應(yīng)受體皰疹病毒侵入介質(zhì)（HVEM）結(jié)合提供抗原特異性T淋巴細(xì)胞活化的第二信號，在免疫反應(yīng)早期階段發(fā)揮重要的協(xié)同抑制作用［1］。樹突狀細(xì)胞（DC）是體內(nèi)最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞（APC），在免疫系統(tǒng)中起中心調(diào)節(jié)作用［2］。DC不同表型對T淋巴細(xì)胞接受抗原刺激的反應(yīng)狀態(tài)有決定性作用，未成熟DC因缺乏共刺激分子表達(dá)，不能提供T淋巴細(xì)胞活化必需的第二信號，往往導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞無能或凋亡，誘導(dǎo)免疫耐受，因此成為近年來研究的熱點(diǎn)［3］。未成熟DC誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受并維持其耐受狀態(tài)，對自身免疫性疾病和移植后排斥反應(yīng)的預(yù)防和治療具有重要意義，但是單純的DC治療難以達(dá)到理想效果［4］。BTLA負(fù)性共刺激分子修飾未成熟DC，抑制T淋巴細(xì)胞的活化過程，可增強(qiáng)免疫耐受。在本研究中，我們構(gòu)建了BTLA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染未成熟DC，以探討此法轉(zhuǎn)染BTLA至未成熟DC的可行性，從而為進(jìn)一步研究BTLA修飾的未成熟DC的免疫耐受作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料與動物

含葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基，含L-谷氨酰胺和25mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）的RPMI1640培養(yǎng)基、NQBB胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、IL-4（IL-4Pepro Tech）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF Pepro Tech）、小鼠抗小鼠MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD11c單克隆抗體（eBioscience）。6周雌性CL57／BL小鼠。

二、方 法

采用實(shí)時PCR（qPCR）測定重組慢病毒載體滴度。采用免疫熒光、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測未成熟DC上BTLA基因的表達(dá)情況。

1.慢病毒載體LPP-Mm26645-Lv203-400的構(gòu)建與活性檢測

根據(jù)GeneBank公布的小鼠BTLA的mRNA （NM＿001037719.2），委托廣州GeneCopoeia公司合成引物，構(gòu)建ORF慢病毒表達(dá)質(zhì)粒LV-BTLA并構(gòu)建慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400，采用qPCR測定慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400滴度。用此慢病毒感染H1299細(xì)胞，培養(yǎng)48 h。使用熒光顯微鏡進(jìn)行增強(qiáng)型綠色熒光蛋白觀察，有綠色熒光表示慢病毒有活性。將慢病毒液凍存于－80℃。

2.小鼠骨髓源性未成熟DC的分離培養(yǎng)與流式檢測

2.1 DC的分離培養(yǎng)

頸椎脫臼處死CL57／BL小鼠，用無菌手術(shù)取出股骨、脛骨，剪去骨兩端，吸取PRMI1640培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗、10 ng／μl的IL-4、10 ng／μl的GM-CSF）反復(fù)沖洗骨髓腔，將骨髓細(xì)胞沖至培養(yǎng)基中，反復(fù)吹打培養(yǎng)基，得到骨髓細(xì)胞懸液。收集骨髓細(xì)胞懸液至15 ml離心管后離心（1 500 rpm，5 min），棄上清液收集骨髓細(xì)胞沉淀。以適量RPMI1640培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞后以每孔1.5 ml將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞板中，水平輕搖后將細(xì)胞板放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)第4日進(jìn)行半量換液。

2.2 DC的收集與流式檢測

培養(yǎng)DC的第6日，于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況并拍照。收集細(xì)胞懸液至15 ml離心管后離心（1 000 rpm，8 min），收集細(xì)胞沉淀后以適量RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。取部分細(xì)胞與PE-Cy5.5標(biāo)記的CD11c、FITC標(biāo)記的CD80、PE標(biāo)記的CD86、APC標(biāo)記的MHC-Ⅱ分子在4℃反應(yīng)30 min，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次后用流式細(xì)胞儀檢測。

3.重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染DC

按上述方法培養(yǎng)的DC培養(yǎng)至第5日，收集DC并接種于12孔細(xì)胞板，每個孔內(nèi)接種3×104個DC，鋪板時細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為600 μl，水平輕搖后將細(xì)胞板放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。24 h后取出構(gòu)建的慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400液并稀釋至0.5× 108TU／mL，進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合度約為70%，以感染復(fù)數(shù)為15分別加入重組慢病毒LPPMm26645-Lv203-400，補(bǔ)充完全RPMI1640培養(yǎng)基至終體積1 ml，加入Polybrene維持其終濃度于5 μg／ml，水平輕搖后將細(xì)胞板放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。隔日補(bǔ)充新鮮RPMI1640培養(yǎng)基。96 h后使用熒光顯微鏡進(jìn)行綠色熒光蛋白觀察，有綠色熒光者為BTLA基因表達(dá)陽性。未感染慢病毒的DC為對照組（DCN）。

4.RT-PCR檢測BTLA在DC中的表達(dá)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中基因BTLA-F、BTLA-R、GAPDH-F、GAPDH-R的序列分別設(shè)計合成的引物序列，收集重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染的DC，提取RNA，以DNaseI消化，電泳檢測RNA完整性，反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），進(jìn)行RT-PCR檢測。

5.重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染的DC的表型檢測

取重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染成功的DC與PE-Cy5.5標(biāo)記的CD11c、FITC標(biāo)記的CD80、PE標(biāo)記的CD86、APC標(biāo)記的MHC-Ⅱ分子在4℃反應(yīng)30 min，經(jīng)PBS沖洗2次后用流式細(xì)胞儀檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，計量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、慢病毒載體LPP-Mm26645-Lv203-400的構(gòu)建、滴度與活性檢測

重組慢病毒顆粒由高純度ORF表達(dá)質(zhì)粒（基因：BTLA、啟動子：CMV、C-flag標(biāo)簽）、Endo-Fectin-LentiTM和Titer BoostTMreagents生成，并在Lenti-PacTMHIV packaging mix（Cat＃：HPK-LvTR-20）作用下被包裝于293Ta細(xì)胞（Cat＃：CLv-PK-01）中，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，qPCR檢測本次病毒制備的滴度為3.25×109TU／ml。1 μl的LPPMm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞，3 d后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖1，重組慢病毒LPPMm26645-Lv203-400活性正常。

圖1 重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞3 d后熒光顯微鏡觀察（×250）

二、體外培養(yǎng)DC的光鏡觀察與流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

CL57／BL小鼠的骨髓細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)瓶底部可見半貼壁細(xì)胞，細(xì)胞呈圓形。培養(yǎng)第4日，細(xì)胞形態(tài)逐漸由圓形變?yōu)椴灰?guī)則形，個別細(xì)胞形成突起，可見細(xì)胞聚集現(xiàn)象，以粒細(xì)胞集落居多，集落由3～4個細(xì)胞組成，其后細(xì)胞直徑逐漸增大，集落中的細(xì)胞數(shù)可達(dá)8～9個。換液時傾去的培養(yǎng)基中的懸浮細(xì)胞主要為T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片及少量單核細(xì)胞和DC。培養(yǎng)第6日，細(xì)胞集落繼續(xù)增多，可見細(xì)胞逐漸呈懸浮狀態(tài)。收集培養(yǎng)5 d后（第6日）的DC進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，CD11c、CD86、CD80、MHC-Ⅱ是鑒別DC的主要標(biāo)志物，其陽性表達(dá)率分別為73.59%、94.45%、47.84%、39.74%，為未成熟DC的表現(xiàn)。

三、重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染DC結(jié)果

重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400以感染復(fù)數(shù)為15轉(zhuǎn)染培養(yǎng)5 d后的DC，96 h后在熒光倒置顯微鏡下可觀察到被感染的陽性細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)（圖2）。在光鏡下觀察DC呈類圓形，部分細(xì)胞可見突起，細(xì)胞體積增加不明顯，大量DC呈懸浮狀態(tài)（圖3）。

四、RT-PCR檢測BTLA的表達(dá)

電泳檢測RNA完整，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用得到cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，基因表達(dá)情況見圖4，與對照組相比，轉(zhuǎn)染BTLA基因的慢病毒載體的DC上BTLA基因表達(dá)量明顯提高。

五、轉(zhuǎn)染BTLA基因的慢病毒載體的DC的表型鑒定

收集重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染96 h后的DC，流式細(xì)胞儀檢測CD11c--PE-Cy5.5、CD80--FITC、CD86--PE、MHC-Ⅱ-APC的陽性表達(dá)率分別為83.14%、89.06%、38.9%、41.28%，仍為未成熟DC的表現(xiàn)。

討 論

免疫抑制是當(dāng)前治療自身免疫性疾病和移植后排斥反應(yīng)的主要有效方法。特異性阻斷某些免疫反應(yīng)而非全面地抑制免疫顯得尤為重要，近年來已有大量關(guān)于DC與T淋巴細(xì)胞作為配受體相互反應(yīng)的研究［1］?？乖禺愋訲淋巴細(xì)胞的活化需要兩個信號，第一信號來自于APC主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-抗原肽復(fù)合物與T淋巴細(xì)胞受體-CD3復(fù)合物，第二信號由APC表面的共刺激分子與T淋巴細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合作用產(chǎn)生。BTLA是重要的負(fù)性抑制共刺激分子，包含免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）。當(dāng)BTLA與其配體HVEM結(jié)合，ITIM磷酸化，激活酪氨酸蛋白酶SHP-1和SHP-2，則會對T淋巴細(xì)胞增殖活化起抑制作用［5］。目前有研究表明，在一些自身免疫性疾病模型中，缺失BTLA-HVEM信號會引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。BTLA基因敲除鼠誘導(dǎo)出的實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓膜炎模型的發(fā)病率更高，病情更嚴(yán)重［6］。DC作為體內(nèi)最強(qiáng)的APC，在免疫系統(tǒng)中起中心調(diào)節(jié)作用。Melton等［2］的研究表明DC對抗原的傳遞及其提呈的抗原肽的周轉(zhuǎn)均可影響實(shí)驗(yàn)性自身免疫性疾病的結(jié)局。未成熟DC可以通過多種機(jī)制誘導(dǎo)對T淋巴細(xì)胞特異性抗原的耐受，但是單純的DC并不能完全抑制免疫反應(yīng)。

圖2 重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染DC 96 h后熒光顯微鏡觀察（×250）

圖3 重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染DC 96 h后倒置顯微鏡觀察

圖4 RT-PCR檢測感染的DC及DCN中BTLA基因表達(dá)與DCN組比較，*為P＜0.05

慢病毒表達(dá)載體可以包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，可以將外源基因有效整合到宿主染色體，從而達(dá)到持久性表達(dá)的目的，并且具有無插入致突變性、轉(zhuǎn)染率高、免疫反應(yīng)小的特點(diǎn)。BTLA低表達(dá)于未成熟DC，故本研究根據(jù)Gene-Bank公布的小鼠BTLA的mRNA構(gòu)建含有外源基因的重組載體，將測序正確、不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒與復(fù)能基共轉(zhuǎn)染而得到高質(zhì)量的病毒液LPPMm26645-Lv203-400液，并將其以感染復(fù)數(shù)為15轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)至第6日的未成熟DC，經(jīng)檢測證實(shí)未成熟DC有BTLA基因表達(dá)［7］。未成熟DC表面幾乎不表達(dá)BTLA，但本研究以慢病毒介導(dǎo)的BTLA成功轉(zhuǎn)染了DC，提高了未成熟DC上BTLA的表達(dá)量，而且感染的未成熟DC的表型并無變化。因此，構(gòu)建攜帶BTLA基因的慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染BTLA至小鼠骨髓來源的未成熟DC，這為研究BTLA修飾的未成熟DC的免疫耐受作用甚至將其用于治療自身免疫性疾病或移植后排斥反應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

致謝：感謝中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院余新炳教授為本研究提供了技術(shù)性幫助。

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Study of immature dendritic cells transfected with lentiviral-mediated B and T lymphocyte attenuator

Wang Xuan，Yi Huan，Liu Jia，Li Min，Peng Fuhua.Department of Neurology，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China

Objective To construct lentiviral vector expressing B and T lymphocyte attenuator（BTLA）gene and evaluate the feasibility of transfecting immature dendritic cells by this vector.Methods According to the mRNA sequence of mouse BTLA published by GeneBank，the ORF lentiviral plasmid was constructed and the recombinant lentiviral vector expressing BTLA was synthesized.Immature dendritic cells were subjected to primary isolation and culture from C57BL／6 mouse bone marrow.Immature dendritic cells were transfected with recombinant lentivial vector expressing BTLA at a multiplicity of infection of 15.The expression level of BTLA was assessed by immunofluorescence and RT-PCR.Results The lentiviral vector LPPMm26645-Lv203-400 was successfully constructed at a titer of 3.25×109TU／ml.At 96 h after immature dendritic cells transfected by the lentiviral vector LPP-Mm26645-Lv203-400，positive cells expressing green fluorescent protein were observed under inverted fluorescent microscope.The expression level of BTLA in the transfected immature dendritic cells was significantly higher compared with that in the non-transfected cells（P＜0.05），indicating the successful transfection.Conclusion The lentiviral vector expressing BTLA gene can be successfully transfected into the mouse marrow-derived immature dendritic cells.

B and T lymphocyte attenuator；Lentivirus；Dendritic cell；Transfection

2015-07-15）

（本文編輯：洪悅民）

10.3969／j.issn.0253-9802.2015.12.004

國家自然科學(xué)基金（81271327）；廣東省科技計劃項(xiàng)目（2011B03I8O0015）

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

，彭福華，E-mail：pfh93＠163.com