曾涵楊陽 李小娟 白希（新能源材料化學(xué)實驗室,新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,烏魯木齊830054）

磁性納米粒子復(fù)合物固定漆酶電極作為酶燃料電池陰極和氧電化學(xué)傳感器的性能研究

曾涵*楊陽 李小娟 白希
（新能源材料化學(xué)實驗室,新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,烏魯木齊830054）

以鄰苯二甲酰化殼聚糖和磁性Fe3O4納米粒子納米復(fù)合物為載體,通過吸附方式固定漆酶分子,并將固酶復(fù)合物滴涂在電極表面室溫干燥得到固定漆酶基電極,采用循環(huán)伏安法、線性掃描伏安法和計時電流法測試了此電極作為酶燃料電池陰極的催化氧還原性能和作為氧電化學(xué)傳感器的使用性能。實驗結(jié)果表明,電極在不含電子中介體的溶液中出現(xiàn)一對表征酶活性中心T1與導(dǎo)電基體之間直接單電子準(zhǔn)可逆遷移的氧化還原峰信號（中值電位是798 mV,非常接近漆酶活性中心T1的式電位780 mV）,導(dǎo)電酶分子表面濃度為1.5×10-9mol/cm2,電子遷移速率0.05 s-1,氧還原起始電位930 mV,單位時間內(nèi)底物轉(zhuǎn)化頻率0.3個/s。最佳檢測條件下,此電極在氧氣濃度2.6～33.9μmol/L的范圍內(nèi),穩(wěn)態(tài)催化電流與氧氣濃度能保持良好的線性關(guān)系,對氧檢出限為0.86μmol/L,,靈敏度17.2μA·L/μmol,米氏常數(shù)KM=131.1μmol/L。此電極具有良好的重現(xiàn)性和長期使用性,在pH=4.4時具有最大的催化活力。

鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?；磁性Fe3O4納米粒子；漆酶；酶燃料電池陰極；電化學(xué)傳感器

1 引 言

酶燃料電池由于具有催化選擇性和能量轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點,是極有發(fā)展前景的能量轉(zhuǎn)化裝置之一[1],目前,制約酶基燃料電池性能的關(guān)鍵因素是陰極電催化還原過程[2],提高酶-電極間直接電子遷移速率是改善固酶陰極性能的關(guān)鍵[3,4]。漆酶（Laccase,Lac）因具有較高的氧化還原式電位被認(rèn)為是最適宜的電化學(xué)催化劑[5,6],但因其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜不利于電子在導(dǎo)電基體和酶活性中心之間發(fā)生直接遷移,引入媒介體會降低電極的能量輸出,而且電極催化底物反應(yīng)的長期穩(wěn)定性和生物相容性也較低[7]。目前,已有多種方法可實現(xiàn)Lac分子和電極之間的直接電子遷移[8,9],但對固酶載體結(jié)構(gòu)、形貌以及酶基電極構(gòu)筑方法等因素對酶基電極催化氧還原動力學(xué)的影響缺乏系統(tǒng)的討論,已有文獻(xiàn)報道也缺乏對酶催化過程動力學(xué)的定量分析,更重要的是這些電極沒有表現(xiàn)出酶與電極之間直接電子遷移的電化學(xué)信號[8,9],不利于分析固酶電極催化動力學(xué)機(jī)制。

磁性納米粒子具有易制備、導(dǎo)電性能好、粒徑和粒子表面官能團(tuán)結(jié)構(gòu)可控,以及易于磁性分離等優(yōu)點,常作為固酶載體[10,11]。目前的固酶磁性納米粒子修飾電極多數(shù)需要對市售電極進(jìn)行改裝或自制[10],而且磁性納米粒子固酶電極由于引入化學(xué)試劑對酶活性中心空間構(gòu)型的影響,導(dǎo)致電極催化性能受到極大影響[11]。殼聚糖及其衍生物對Lac具有較好的生物相容性和良好的成膜性[7,12],但殼聚糖及其衍生物不導(dǎo)電,不適合單獨作為電極表面的固酶載體。文獻(xiàn)[13,14]表明,具有芳香性環(huán)狀結(jié)構(gòu)的分子可接近Lac活性中心T1,利于酶性中心-導(dǎo)電基體之間的直接電子遷移,因此將含有芳環(huán)結(jié)構(gòu)的殼聚糖衍生物與磁性納米粒子機(jī)械共混,就有可能獲得制備簡單、性能穩(wěn)定且可實現(xiàn)酶-電極間有效電子遷移的固酶電極。

通過將鄰苯二甲?；瘹ぞ厶桥c磁性Fe3O4納米粒子機(jī)械共混制備力學(xué)性能良好的磁性納米粒子復(fù)合物,進(jìn)一步制備了固定Lac的磁性納米粒子復(fù)合物修飾電極,測試了其作為酶燃料電池陰極的直接電化學(xué)行為和催化氧還原性能,檢測了其作為氧電化學(xué)傳感器的性能。本研究結(jié)果不僅有利于了解酶活性中心在在催化過程中所起的作用和發(fā)生的變化,還為合成高性能的“人工酶”提供有價值的參考。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

2K15型高速離心機(jī)（德國Sigma公司）,BRUKER EQUINDX-55型紅外光譜儀（德國BRUKER公司,KBr壓片）,Analyst 800型原子吸收光譜儀（美國Perkin-Elmer公司）,U-2810型紫外可見分光光度計（日本島津公司）,JSM-6700F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司,加速電壓：0.5～30 kV）, CHI-1140A型電化學(xué)分析儀（上海辰華公司）,AFMSRCE型旋轉(zhuǎn)圓盤電極系統(tǒng)（美國Pine公司）。實驗采用三電極體系：玻碳電極（GCE,直徑5mm,天津艾達(dá)恒晟工貿(mào)有限公司）,Ag/AgCl（飽和KCl）電極作為參比電極,對電極為鉑絲電極。玻碳電極使用前先以1.0和0.5μm氧化鋁粉漿拋光,再用丙酮和三次重蒸水超聲清洗各2次。如無特殊說明,所有電極電位均為相對于NHE（標(biāo)準(zhǔn)氫參比電極）而言。

云芝漆酶（Lac,源自Trametes Versicolor,Mw68000）,2,2′-聯(lián)氮-雙-（-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）-二胺鹽（ABTS,純度98.5％）,購自Sigma公司；殼聚糖（CTS,脫乙酰度≥90％,Mw250000）,購自上海升耀生物技術(shù)有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）。所有溶液均用Milli-Q超純水配制。N2,O2（優(yōu)級純,南京特氣公司）。

2.2 固定漆酶鄰苯二甲酰化殼聚糖-Fe3O4磁性納米粒子復(fù)合物修飾電極的構(gòu)筑

鄰苯二甲?；瘹ぞ厶堑闹苽溥^程簡述如下：稱取CTS 2.0016 g,鄰苯二甲酸酐0.9201 g,向兩者的混合物中加入100 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）,超聲共混30min。混合物在N2氣氛下于150℃油浴中磁力攪拌4 h。冷卻,將反應(yīng)混合物浸泡在冰水混合物中至出現(xiàn)沉淀,使固液分層。由于鄰苯二甲酸酐可溶解于醇,所以采用乙醇為抽提劑,在索氏提取器中油浴90℃抽提20 h。抽提余下的淺黃色固體殘渣,再用乙醇沖洗2次后,置于干燥箱中真空（0.1 MPa,40℃）干燥過夜,得到的淺黃色固體即為精制過的鄰苯二甲酰接枝殼聚糖（PHCTS）；磁性Fe3O4納米粒子按照文獻(xiàn)[15]方法制備。

稱取100mg PHCTS、150 mg磁性Fe3O4納米粒子,加入50 mL DMF中,磁力攪拌6 h得到分散良好的懸濁液,隨后加入0.5 g Lac,在4℃下繼續(xù)磁力攪拌8 h,6000 r/min離心15min,使用永磁鐵分離出底部沉積物,上層液相即為制備的固酶復(fù)合物。以0.2 mol/L PBS潤洗沉積物2～3次,合并上清液與潤洗液,測定納米復(fù)合物固定的Lac量。分別移取20μL固酶復(fù)合物和同樣體積的未固定Lac的磁性納米粒子復(fù)合物滴涂到預(yù)處理的玻碳電極表面,室溫下自然干燥得到的電極分別記為Lac/PHCTSFe3O4/GC和PHCTS-Fe3O4/GCE電極。

2.3 固酶電極的表征

修飾GCE的固酶磁性納米粒子復(fù)合物的形貌以掃描電鏡（SEM）表征。樣品制備系固定/未固定Lac的磁性納米粒子復(fù)合物分散液（pH=6.0的PBS緩沖液為分散劑）滴涂在銅網(wǎng)基底上,真空干燥制得。

紫外-可見（UV-vis）光譜表征：游離Lac的紫外可見吸收光譜用溶解于PBS中50mg/mL的Lac溶液測定；分別移取2.2節(jié)中制備的固定/未固定Lac的磁性納米粒子復(fù)合物200μL,均勻地涂覆在銦錫氧化物（ITO）玻璃片上,干燥后插入比色槽中,測定UV-vis光譜。

采用石墨爐原子吸收法[16]測定固酶載體磁性Fe3O4納米粒子復(fù)合物對Lac的擔(dān)載量（mg/g）。電極的活性表面積按照文獻(xiàn)[2]的方法標(biāo)定,實驗測定PHCTS-Fe3O4/GCE的實際活性表面積為0.30 cm2。

2.4 固酶電極的直接電化學(xué)及催化氧還原性能

以循環(huán)伏安法（CV）或線性掃描伏安法（LSV）研究Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE的直接電化學(xué)行為及催化氧還原性能。以Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE作為工作電極,不含底物的PBS緩沖液（pH 4.4）作為電解質(zhì)溶液。實驗中,先向溶液中鼓泡通入N2除氧至少30min,測試過程中電解液上方通入N2,使溶液保持氮氣氣氛。在氧還原實驗前,先向PBS緩沖液中鼓泡通入高純O2至少15min,使溶液為氧氣飽和,實驗中還不斷向電解液上方通入O2,使溶液上方維持氧氣氣氛,所有測定均在25.0℃±0.4℃下進(jìn)行。以極限擴(kuò)散電流時電位處的電流差|iOxygen-iNitrogen|表征固酶電極的催化氧還原活力。

2.5 固酶電極作為氧電化學(xué)傳感器的性能

采用計時電流法（CA）評估Lac/PHCTS-Fe3O4/GC對氧氣的傳感性能。計時電流曲線系固酶電極在含有一系列不同O2濃度的PBS溶液中（pH=4.4）于恒定電壓下記錄響應(yīng)催化還原電流-時間關(guān)系曲線而得到,這一系列不同O2濃度的PBS溶液是向為N2氣飽和的PBS溶液中加入不同體積的空氣飽和PBS溶液而制得（為空氣飽和的PBS中氧氣濃度約為2.6×10-4mol/dm3）,氧還原電位參考文獻(xiàn)[7]方法,以出現(xiàn)極限擴(kuò)散電流的電位作為工作電位。

圖1 CTS（a）和PHCTS（b）的FTIR譜圖Fig.1 FTIR spectra of chitosan（CTS）（a）and phthaloyl chitosan（PHCTS）（b）

3 結(jié)果與討論

3.1 固酶磁性納米粒子復(fù)合物的形貌和結(jié)構(gòu)表征

圖1為CTS和PHCTS的傅里葉變換紅外光譜圖（FTIR）。從圖1b可見,PHCTS在1711 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰是芳香酰胺的 CO振動的吸收峰,由于環(huán)狀酰亞胺結(jié)構(gòu)的存在,相鄰兩個羰基相互作用會使此吸收峰裂分,在高頻區(qū)1777 cm-1附近還出現(xiàn)了一個吸收峰；721 cm-1的特征吸收峰對應(yīng)于苯環(huán)面內(nèi)CH搖擺振動；而CTS（圖1a）的特征吸收峰則與文獻(xiàn)[15]一致。從圖2的紫外可見吸收光譜可見,PHCTS-Fe3O4復(fù)合物在測試的波長范圍內(nèi)無吸收峰,而固定Lac的磁性納米粒子復(fù)合物在605 nm附近出現(xiàn)一個與游離Lac活性位T1吸收峰相近的吸收峰,對應(yīng)于Lac活性中心T1氧化態(tài)銅離子的d-d配位躍遷[5]。這一現(xiàn)象表明,制備的磁性納米粒子復(fù)合物固定的Lac較好地保持了游離酶T1活性中心氧化態(tài)銅中心離子的原有配位構(gòu)型及其價態(tài)。由PHCTS-Fe3O4磁性納米粒子復(fù)合物固酶前后的SEM照片（圖3）可見,包覆在納米粒子表面的PHCTS聚集成團(tuán)簇,表面疏松多孔的形貌利于誘陷Lac而且利于氧氣在復(fù)合物中擴(kuò)散（圖3a）。而固酶前后復(fù)合物的形貌有較大區(qū)別（圖3b）,球形團(tuán)簇結(jié)構(gòu)在復(fù)合物固酶后部分消失,出現(xiàn)了具有一定排布方向的層狀結(jié)構(gòu)。推測這種定向的層狀結(jié)構(gòu)的形成與文獻(xiàn)[13,14]的結(jié)果類似,是由于部分酶分子依靠酶分子活性中心T1附近疏水結(jié)合位與PHCTS的芳環(huán)之間的相互作用,按一定方向排列成相互平行的層狀結(jié)構(gòu)。

圖2 游離漆酶（Lac）的PBS（pH=6.0）溶液、Lac/PHCTS-Fe3O4以及PHCTS-Fe3O4磁性納米粒子復(fù)合物的UV-Vis譜圖Fig.2 UV-vis absorption spectra of free laccase （Lac）in PBS（pH=6.0）,Lac/PHCTS-Fe3O4and magnetic nano-particle composite of PHCTS-Fe3O4

圖3 PHCTS-Fe3O4磁性納米粒子復(fù)合物未固酶（a）和固酶（b）的SEM照片F(xiàn)ig.3 SEM images of PHCTS-Fe3O4magnetic nanoparticle composite without Lac（a）and with Lac（b）

原子吸收法測定結(jié)果表明,此磁性納米粒子復(fù)合物與傳統(tǒng)的固酶載體（如介孔硅微球[17]以及多孔納米金粒子[18]）相比,具有更高的Lac擔(dān)載量（210.2 mg/g）,更低的固酶百分率（10.5％）。

3.2 電化學(xué)方法表征固酶電極作為酶燃料電池陰極的性能

3.2.1 固酶電極的直接電化學(xué)由Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE在N2飽和的PBS（pH=4.4）中的CV曲線（圖4）可見,未固酶磁性納米粒子復(fù)合物修飾電極在掃描電位范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)任何氧化還原峰,而固定Lac電極則分別在855和741 mV處出現(xiàn)了一對較為對稱的氧化峰和還原峰,ip,a/ip,c=1.6,峰峰電位差為114 mV,中值電位是798 mV,非常接近漆酶活性中心T1的式電位（780 mV）,表明Lac活性中心T1與電極之間發(fā)生了直接電子遷移[5]。圖5是Lac/PHCTS-Fe3O4/GC在無氧PBS中以不同掃速獲得的CV曲線,附圖為對應(yīng)的陰陽極峰電流與掃描速率之間關(guān)系的擬合曲線。從圖5可見,固酶電極在不含任何底物的溶液中掃描獲得的CV曲線上出現(xiàn)一對還原峰和氧化峰（分別位于750 mV和850 mV附近）,ip,a/ip,c數(shù)值為1.2～1.6；氧化還原峰峰電位差為102～114 mV。由圖5插圖還可見,在測定的掃描速率范圍內(nèi),掃描速率-峰電流之間保持良好的線性關(guān)系,表明酶-導(dǎo)電基體之間的直接電子遷移為表面控制的單電子準(zhǔn)可逆過程。根據(jù)不同掃速所得CV曲線中積分所得氧化還原峰面積與掃速之比,求算電極表面固定的實現(xiàn)直接電子遷移的酶分子表面濃度Γ*：

圖 4 Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE在氮氣飽和的 PBS （pH=4.4）中以10 mV/s掃描獲得的CV曲線Fig.4 CV curves of Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE recorded in nitrogen gas saturated PBS（pH=4.4）at a scan rate of10 mV/s

圖5 Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE電極靜態(tài)下在不含底物的無氧PBS（pH=4.4）中以不同掃描速率得到的CVs,插圖為對應(yīng)的陰極,陽極峰電流與掃描速率關(guān)系擬合曲線Fig.5 CV curves of Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE electrode in deaerated PBS（pH=4.4）without any substrate recorded at variable scan rates when electrode in static status,inset：fitted curves of corresponding cathodic, anodic peak currents versus scan rates

式中,Q為酶活性中心得失電子的平均電量（扣除雙層充電電量）；Z為活性中心發(fā)生直接電子遷移時得失電子數(shù),參照文獻(xiàn)[18],設(shè)定Z=1。由此可以估測Γ*為1.5×10-9mol/cm2,這個數(shù)值是理論上酶分子在電極表面緊密單分子層排列的表面濃度（4.64× 10-12mol/cm2）[18]的近325倍,比文獻(xiàn)[18]報道的實現(xiàn)直接電子遷移的納米多孔金固定漆酶在GCE電極表面的覆蓋率（2.1×10-11mol/cm2）高的多。

3.2.2 固酶電極催化氧還原性能圖6是Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE電極分別在氧氣（實線）和無氧（虛線）PBS（pH=4.4）中負(fù)向掃描速率為10 mV/s條件下獲得的LSV曲線。相對于無氧條件,固酶電極在氧氣飽和溶液中負(fù)掃得到的還原電流在930mV處開始急劇增加,在760 mV附近出現(xiàn)了一個還原峰,峰電位接近于Lac活性中心T3的式電位（約 780 mV）[5,6]。固酶電極的氧還原起始電位較此pH條件下氧可逆還原式電位970 mV只低了40 mV；相對于未固酶電極的氧還原起始電位（約450 mV,圖未給出）,氧還原超電勢降低了約520 mV。利用獲得的穩(wěn)態(tài)催化還原電流（以500 mV時為準(zhǔn)）密度j=28.4μA/cm2,結(jié)合前述估算的固酶分子表面濃度,由公式：j=nkcΓF（kc為表觀電催化氧還原反應(yīng)速率常數(shù)；n為氧還原反應(yīng)得失電子數(shù),設(shè)定為4）可以估算出此電極上固定Lac實現(xiàn)直接電子遷移的速率常數(shù)為0.05 s-1。

固酶電極具有較好的力學(xué)穩(wěn)定性,與文獻(xiàn)[19]報道的氧化還原水凝膠固酶電極不同,此電極即便在電極轉(zhuǎn)速高達(dá)4000 r/min時,穩(wěn)態(tài)催化氧還原電流密度可達(dá)87.7μA/cm2（圖7）,而且電極表面無明顯的破損,修飾層中的酶分子也未泄漏到溶液中（石墨爐原子吸收法檢測出溶液中的Cu2+）。圖7是磁性納米粒子復(fù)合物固酶電極在氧氣飽和PBS中以相同掃速不同轉(zhuǎn)速掃描獲得的LSV曲線,可以看出：盡管電極旋轉(zhuǎn)速度從0 r/min改變到了4000 r/min,但是氧還原起始電位及還原峰電位或極限催化電流對應(yīng)電位未發(fā)生明顯改變,說明改變轉(zhuǎn)速并沒有改變催化反應(yīng)機(jī)制。此電極與文獻(xiàn)[20]報道的固酶電極類似,電極轉(zhuǎn)速增大促進(jìn)了氧氣在電極表面修飾層中傳質(zhì)過程,導(dǎo)致催化極限電流的增加。按照文獻(xiàn)[21]方法,可估算出固酶電極單位時間轉(zhuǎn)化氧分子的頻率為0.3個/s,而氧氣在電極表面固酶磁性納米粒子復(fù)合物修飾層中擴(kuò)散速率為6.4×10-8cm2/s,明顯低于溶液中氧分子擴(kuò)散速率1.7×10-5cm2/s[20]。

圖6 Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE電極靜態(tài)下分別在無氧和氧氣飽和的PBS（pH 4.4）中靜止?fàn)顟B(tài)時以10 mV/s負(fù)向掃描得到的LSVsFig.6 Linear scanning voltammograms（LSVs） of Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE in static mode recorded in deaerated and oxygen saturated PBS（pH 4.4）at a scan rate of10 mV/s and negatively scanning

圖 7 Lac/PHCTS-Fe3O4/GC在氧氣飽和 PBS （pH 4.4）中于不同電極旋轉(zhuǎn)速度下掃描所得的LSVsFig.7 LSVs of Lac/PHCTS-Fe3O4/GC recorded in oxygen saturated PBS（pH 4.4）at a scan rate of 10 mV/s with variable rotating rates of electrode

3.2.3 固酶電極催化性能的重現(xiàn)性、長期使用性、熱穩(wěn)定性及pH耐受性將制備的3個固酶電極在圖6條件下掃描獲得LSV曲線進(jìn)行對比（圖略）,發(fā)現(xiàn)3個固酶電極的氧還原LSV曲線基本重合,表明此固酶電極具有良好的催化性能重現(xiàn)性。由固定Lac電極催化氧還原性能（以500 mV時穩(wěn)態(tài)催化電流密度為準(zhǔn)）與電極儲存時間的關(guān)系曲線（圖8）可知,儲存7 d后,催化性能可以保持為初始值的約96.5％；超過10 d后,電極催化氧還原性能下降迅速；儲存21 d后,電極催化性能仍然可以保留初始值的約52％。圖9為固酶電極在氧氣飽和的不同pH 值PBS溶液中以相同掃速（10 mV/s）測定的穩(wěn)態(tài)催化電流密度-pH關(guān)系曲線及相同掃速（10 mV/s）、相同pH（4.4）時測定的穩(wěn)態(tài)催化電流密度-溫度關(guān)系曲線,可以看出,固定Lac電極催化氧還原性能與游離Lac類似[12],最佳值pH 4.4；在55℃之前,隨著溫度升高,穩(wěn)態(tài)催化電流密度線性升高,超過55℃后,輸出功率急劇下降,與文獻(xiàn)[19]報道固酶電極的催化電流密度-溫度關(guān)系非常相似。根據(jù)圖9數(shù)據(jù)可以估算出電池催化反應(yīng)的表觀活化能約為28.5 kJ/mol,而酶變性的活化能約為47.1 kJ/mol。

圖8 Lac/PHCTS-Fe3O4/GC催化氧還原性能的長期穩(wěn)定性,實驗條件如圖6所示Fig.8 Long-term stability of Lac/PHCTS-Fe3O4/GC in catalytic effect on oxygen reduction reaction,test conditions as Fig.6 demonstrated

3.3 固酶電極作為氧電化學(xué)傳感器的性能評估

圖10為Lac/PHCTS-Fe3O4/GC在不含任何電子中介體的無氧PBS（pH=4.4）中,緩慢加入不同體積空氣飽和PBS（pH=4.4）時產(chǎn)生的響應(yīng)電流與時間關(guān)系曲線,插圖則是固酶電極對氧氣的響應(yīng)穩(wěn)態(tài)催化電流倒數(shù)與底物氧分子濃度倒數(shù)之間的關(guān)系校正曲線。從圖10及插圖可見,固酶電極在無中介體存在時對氧分子響應(yīng)迅速,此電極在氧氣濃度2.6～33.9μmol/L范圍內(nèi),穩(wěn)態(tài)催化電流與氧氣濃度均能保持良好的線性關(guān)系。這一固酶電極具有高靈敏度（為17.2μA·L/μmol,這一數(shù)值遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)[7]報道的固定Lac電極在擴(kuò)散型電子中介體存在時對氧分子的靈敏度27.3μA·L/mmol）。

圖9 Lac/PHCTS-Fe3O4/GC催化氧還原能力的pH耐受性和熱穩(wěn)定性Fig.9 pH endurance and thermal stability of Lac/PHCTS-Fe3O4/GCE in catalytic effect on oxygen reduction reaction

圖10 計時電流法表征Lac/PHCTS-Fe3O4/GC處于靜態(tài)時作為電化學(xué)傳感器對氧傳感的性能,插圖為對應(yīng)的極限催化電流-氧氣濃度關(guān)系曲線Fig.10 Performance for oxygen detection of Lac/PHCTS-Fe3O4/GC as electrochemical sensor characterized by chronoamperometricmeasurements,electrode is stationary, inset is calibration curve of the limited catalytic current on the concentration of O2

本研究制備的固酶電極對氧的檢出限為0.86μmol/L,遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)[7]報道的固酶電極（7.8μmol/L）；對氧氣的親和力（KM=131.1μmol/L）遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)[7]報道（KM=3.22mmol/L）。根據(jù)圖10還可以粗略計算出歸一化的酶催化氧還原表觀速率常數(shù)為140 s-1,結(jié)合前述擴(kuò)散速率2.1×10-7s-1,酶-電極間直接電子遷移的速率0.05 s-1,分子內(nèi)電子遷移速率1000 s-1[4],以及整個催化循環(huán)的氧分子轉(zhuǎn)化速率0.3個/s,整個固酶電極催化過程受限于酶分子活性中心-導(dǎo)電基體之間的直接電子遷移過程。

4 結(jié)論

由鄰苯二甲?；瘹ぞ厶呛痛判訤e3O4納米粒子共混所得復(fù)合物作為載體化學(xué)吸附Lac可制備得到固酶電極。在沒有任何外加電子中介體情況下,可以實現(xiàn)酶與導(dǎo)電基體之間的直接電子遷移,且具有較良好的催化氧還原性能；這種電極由于制備簡易,性能良好,適宜作為在線環(huán)境監(jiān)測的電化學(xué)傳感器和葡萄糖/乙醇-空氣/氧氣酶燃料電池的陰極使用。

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（Received 26 April2015；accepted 21 July 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.21363024）

Performance of Laccase-entrapped M agnetic Nano-particle Com posite M odified Electrode as Biocathode in Enzymatic Biofuel Cell and Elecrochem ical Sensor for Oxygen Detection

ZENG Han*,YANG Yang,LIXiao-Juan,BAIXi
（Laboratory ofNew Energy Materials Chemistry,Chemistry and Chemical Engineering Academy, XinJiang Normal University,Urumuqi830054,China）

A nano-composite of phthalated Chitosan and magnetic ferroferric oxide nano-particlewas prepared by mechanically mixing as method,and laccase was then adsorbed on the composite ot obtain immobilized laccase.Then the composite with laccase was dripped onto the surface of glassy carbon electrode and dried in air under room temperature to prepare laccase-immobilized biocathode.Catalytic effect in oxygen reduction reaction and performance of oxygen electrochemical sensor of this laccase-based electrode were systematically investigated by cyclic voltammetry,linear scanning voltammetry and chronoamperometry.Experimental results indicated that directelectron transfer between enzyme active centre T1 in laccase and conductivematrix ccould be achieved in solution without any electron relay,characterized with one-electron quasi-reversible redox reaction signal（Equilibrium potential：798 mV,very close to the formal potential of T1 centre in laccase 780 mV）.Italso featured with surface coverage of1.5×10-9mol/cm2conductive enzymemolecules,electron relay rate of0.05 s-1,onset potential for oxygen reduction of930mV,substrate turn-over frequency of0.3 dioxygen molecules/s.Linear relationship in steady catalytic current of laccase-based electrode versus oxygen concentration was found within the oxygen concentration range of2.6-33.9μmol/L under optimal conditions.This electrode as oxygen electrochemical sensor showed a low detection limit of0.86μmol/L,high sensitivity （17.2μA·L/μmol）,and Michaelis-Menten constant KM=131.1μmol/L.Further tests confirmed its excellent reproducibility and long-term usability in catalytic function towards oxygen reduction,with optimal pH=4.4.

Phthaloyl chitosan；Magnetic ferroferric oxide nanoparticle；Laccase；Biocathode in enzymatic biofuel cell；Electrochemical sensor

10.11895/j.issn.0253-3820.150337

2015-04-26收稿；2015-07-21接受

本文系國家自然科學(xué)基金（No.21363024）,新疆維吾爾自治區(qū)2013年度高?？蒲杏媱澢嗄杲處熍嘤椖浚∟o.XJEDU2013S29）和新疆師范大學(xué)博士科研啟動基金項目（No.XJNUBS1228）資助

E-mail：zenghan1289@163.com