衛(wèi)文強，吳 潤，劉 磊

(1 甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2 河南大學 醫(yī)學院，河南 開封 475004)

4味中草藥的體外抗TGEV試驗

衛(wèi)文強1,2，吳 潤1，劉 磊1

(1 甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2 河南大學 醫(yī)學院，河南 開封 475004)

【目的】 探討黃芪、黃芩、大黃、金錢草體外對豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的抑制作用?！痉椒ā?采用傳統(tǒng)的水提法制備黃芪、黃芩、大黃、金錢草等中藥的提取液，測定其對PK-15細胞的最大安全質量濃度。采用細胞病變觀察法確定4味中草藥對TGEV致PK-15細胞病變的抑制作用，并通過MTT法計算藥物的最小抗病毒質量濃度和抑制指數?！窘Y果】 黃芪、黃芩、大黃、金錢草的最大安全質量濃度分別為50，12.50，6.25和6.25 mg/mL。黃芩、黃芪能抑制TGEV對PK-15細胞的吸附，抑制指數分別為8和4；大黃、金錢草能直接滅活TGEV病毒，抑制指數均為8?！窘Y論】 黃芩、黃芪、大黃、金錢草體外對TGEV均有抑制作用。

中草藥；抗病毒；細胞病變；MTT法

豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種以嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為特征的高度接觸性、急性胃腸道傳染病。TGEV屬于冠狀病毒屬的RNA病毒，與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、人SARS冠狀病毒(SARS-CoV)等有較高的同源性。某些化學藥物雖對TGEV有一定的抑制作用，但同時對宿主細胞有一定的毒性，故迫切需要開發(fā)抗TGEV效果明顯、副作用小、價格低廉的藥物[1-3]。

用中草藥抗TGEV病毒具有安全、低毒、高效、價廉等優(yōu)勢。龔國清等[4]研究表明，木犀草素能抑制TGEV吸附、復制，并可直接殺死病毒。雷用東等[5]研究表明，接骨木花色苷具有抗TGEV的作用。Lau等[6]研究表明，魚腥草通過抑制3CLpro的活性及依賴RNA的RNA多聚酶活性，提高CD4+、CD8+數量，從而起到抗TGEV的作用。姜成剛等[7]研究顯示，板藍根、魚腥草、敗醬草體外均有抗TGEV的效果，且“魚腥草+敗醬草”組合抗病毒的效果既比單藥強，也比其他組合的效果明顯。Kim等[8]研究表明，黃連、升麻、苦楝皮、黃柏、苦參體外能抑制PEDV復制。甘草酸能抑制多種DNA、RNA病毒，具有抗SARS-CoV的活性[9]。肉桂的原花青素和丁醇提取物也具有抗SARS-CoV的作用[10]。由于TGEV和PEDV、SARS-CoV具有較高的核酸序列同源性，都是冠狀病毒屬的成員，因此在治療上可以互相借鑒。甘肅省中草藥資源豐富，為了篩選有效抗TGEV的藥物，本試驗挑選臨床或相關試驗證明有抗病毒活性的中草藥黃芪、黃芩、大黃、金錢草，通過細胞病變抑制法結合MTT法體外檢測這些藥物的抗TGEV效果，以期為TGE的治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒和細胞 豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)株，為甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院微生物與免疫學教研室保存的疫苗分離株。PK-15細胞，由蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 試驗藥物 大黃、黃芪、黃芩、金錢草等，購自蘭州安泰堂醫(yī)藥公司，由甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院楊致禮教授鑒定。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清和3-(4,6-二甲基噻唑-2-x1)-2,5-乙苯基-四唑溴鹽(MTT)。細胞生長液為含體積分數10%胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、50 μg/mL卡那霉素、pH 7.2的DMEM培養(yǎng)液；細胞維持液含體積分數2%胎牛血清，其他成分同細胞生長液。

1.1.4 主要儀器和設備 純水儀，CO2恒溫培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，96孔細胞培養(yǎng)板，酶標儀等。

1.2 方 法

1.2.1 TGEV的增殖及毒力測定 將1 mL TGEV毒液接種于PK-15細胞(3×106個/瓶)，37 ℃孵育1 h，向細胞培養(yǎng)瓶加入4 mL含體積分數2%胎牛血清(FBS)和5 μg/mL胰酶的DMEM，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細胞病變(CPE)。如果無明顯CPE，則培養(yǎng)5 d后，將細胞反復凍融3次，5 000 r/min離心10 min后收獲細胞上清再對PK-15細胞進行盲傳，直至產生明顯的CPE。將病變細胞反復凍融3次，收集病毒液置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用Reed-Muench法[11]計算病毒滴度。

1.2.2 中草藥提取液的制備 中草藥提取液采用傳統(tǒng)的水提法制備。將一定質量的中草藥用水洗凈后，加入10倍體積的去離子水煎煮提取0.5 h，將提取液2 000 r/min離心5 min，去除可能存在的較大雜質，115 ℃高壓滅菌20～30 min。藥液終質量濃度控制在100 mg/mL(以生藥計)，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 中草藥提取液的稀釋及安全質量濃度的測定 將中草藥提取液用細胞維持液稀釋成50，25，12.5，6.25和3.175 mg/mL備用。將PK-15細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，待長成單層后，吸棄培養(yǎng)液，用細胞維持液洗一遍，試驗孔分別加入各質量濃度藥物100 μL，細胞對照組加細胞維持液100 μL，每個質量濃度重復4孔。將細胞培養(yǎng)板置濕盤，于37 ℃、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，期間每天觀察細胞形態(tài)及單層完好程度。與對照組細胞相比，細胞無形態(tài)改變且單層完整的最大藥物質量濃度為受試藥物的最大安全質量濃度(TC0)。

1.2.4 4味中草藥抗TGEV試驗 (1)對TGEV吸附細胞的阻斷作用。將各稀釋度的中草藥(黃芪：50～3.13 mg/mL；黃芩、大黃、金錢草：6.25～0.39 mg/mL)0.1 mL分別加入到長滿單層PK-15細胞的96孔細胞培養(yǎng)板上，每個質量濃度重復4孔，培養(yǎng)2 h，棄掉藥物，用細胞維持液洗滌1次，各孔再加入0.1 mL TGEV病毒液(100 TCID50)，37 ℃孵育1 h，棄病毒液，補充細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)96 h。試驗同時設病毒對照組(只加病毒)和細胞對照組(只加細胞維持液)。

(2) 對TGEV的直接滅活作用。將0.1 mL各稀釋度的中草藥(黃芪：50～3.13 mg/mL；黃芩、大黃、金錢草：6.25～0.39 mg/mL)分別與等體積的TGEV病毒液(100 TCID50)混合作用2 h，然后將混合液加入長滿單層PK-15細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃吸附1 h，棄混合液，補充細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)96 h，每個質量濃度重復4孔。試驗同時設病毒對照組和細胞對照組。

1.2.5 結果觀察 (1)中草藥對TGEV致CPE的影響。對于上述處理的細胞每隔24 h在倒置顯微鏡下觀察，比較藥物處理組與病毒對照組細胞病變的差異，96 h后，能抑制TGEV產生CPE的中草藥，進行下面的MTT試驗。

(2)MTT試驗。向96孔細胞培養(yǎng)板的各孔加入5 mg/mL的MTT 100 μL，37 ℃孵育4 h，小心地將每孔液體吸棄，再分別加入100 μL 酸化異丙醇，振蕩器上振蕩5 min，使沉淀完全溶解。使用酶標儀在波長630 nm測各孔的吸光值(OD630)，采用SPSS 12.0軟件進行t檢驗，比較病毒對照組與加藥組OD630的差異顯著性，求出藥物的最小有效質量濃度，以抑制指數為指標評定藥效。

抑制指數=安全質量濃度/最小有效質量濃度。

2 結果與分析

2.1 TGEV致PK-15細胞CPE的形態(tài)學觀察

正常的PK-15細胞形態(tài)為不規(guī)則的三角形(圖1-A)。使用含體積分數2% FBS和5 μg/mL胰酶的DMEM培養(yǎng)基，TGEV在PK-15細胞盲傳4代后開始產生CPE，表現(xiàn)為細胞變圓、聚堆，細胞多數脫落、崩解死亡(圖1-B)。Reed-Muench法測得病毒滴度為10-2.5TCID50/0.1 mL。

圖1 TGEV對PK-15細胞的致病變作用A.對照組PK-15細胞；B.TGEV感染48 h后的PK-15細胞

2.2 4味中草藥最大安全質量濃度的確定

不同藥物在不同質量濃度下對PK-15細胞的毒性不同。試驗結果表明，黃芪在質量濃度為50 mg/mL時，PK-15細胞仍然長勢良好，甚至超過了低質量濃度時的細胞狀態(tài)，說明黃芪對PK-15細胞沒有毒性，反而能促進細胞的生長。黃芩、大黃、金錢草的最大安全質量濃度分別為12.50，6.25和6.25 mg/mL。

2.3 4味中草藥對TGEV致CPE的影響

藥物與TGEV加入細胞作用后，每天觀察藥物對TGEV致CPE的影響，結果見圖2。

圖2 4味中草藥對TGEV致PK-15細胞CPE的影響(×200) 藥物和病毒作用后96 h在倒置顯微鏡下觀察的細胞生長情況。A～D分別為50 mg/mL黃芪組、6.25 mg/mL黃芩組、病毒對照組和細胞對照組；E～H分別為6.25 mg/mL大黃組、6.25 mg/mL金錢草組、病毒對照組和細胞對照組

圖2顯示，黃芩與黃芪對TGEV吸附PK-15細胞有抑制作用(圖2-A，B)，而病毒對照組細胞則出現(xiàn)CPE(圖2-C)，正常的對照組細胞形態(tài)正常(圖2-D)；大黃、金錢草對TGEV有直接滅活作用(圖2-E，F(xiàn))，而病毒對照組細胞有CPE出現(xiàn)(圖2-G)，細胞對照組形態(tài)正常(圖2-H)。

2.4 MTT法確定4味中草藥抗TGEV的作用

2.4.1 對TGEV吸附PK-15細胞的抑制作用 表1和表2結果表明，黃芪和黃芩能抑制TGEV對PK-15細胞的吸附作用。黃芪在質量濃度不小于12.50 mg/mL時抗TGEV吸附的作用顯著高于TGEV對照組，其抑制指數為4。與TGEV對照組相比，黃芩在質量濃度為6.25～3.13 mg/mL時，其抗TGEV吸附的作用極顯著，在藥物質量濃度為 1.56 mg/mL時抗吸附作用顯著(表2)，其抑制指數為8。

表1 黃芪對TGEV吸附PK-15細胞的抑制作用Table 1 Inhibition of TGEV absorption on PK-15 cells by Astragalus

注：與TGEV對照組相比，數據后標*表示差異顯著(P<0.05)，標**表示差異極顯著(P<0. 01)。下同。

Note:Compared with TGEV control group,one asterisk (*) indicates the difference is significant (P<0.05),while two asterisks (**) indicate the difference is extremely significant (P<0. 01).The same below.

表2 黃芩對TGEV吸附PK-15細胞的抑制作用Table 2 Inhibition of TGEV absorption on PK-15 cells by Scutellaria

2.4.2 藥物對病毒的直接滅活作用 大黃、金錢草有直接滅活病毒的作用。大黃在質量濃度為3.13～1.56 mg/mL時，其OD630極顯著高于TGEV對照組(表3)，對TGEV的抑制指數為8。金錢草在質量濃度不小于0.78 mg/mL時，其滅活TGEV的作用極顯著高于病毒對照組(表4)，對TGEV的抑制指數為8。

表3 大黃對TGEV的直接滅活作用Table 3 Direct destruction action of Rhubarb against TGEV

表4 金錢草對TGEV的直接滅活作用Table 4 Direct destruction action of Loosestrife against TGEV

3 討 論

TGEV屬于冠狀病毒，該屬病毒培養(yǎng)比較困難。一方面需要敏感的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液有時也需要特殊處理。Storz等[12]研究表明，胰酶能促進牛冠狀病毒在胎牛腦(bovine fetal brain,BFB)細胞和胎牛甲狀腺(bovine fetal brain,BFTy)細胞上蝕斑的形成及細胞的融合、裂解脫落。TGEV對豬睪丸細胞 (ST)和PK-15細胞比較敏感，且在細胞維持液里加入適量的胰酶有助于提高病毒效價，較早產生細胞病變。但是ST細胞難培養(yǎng)，對血清質量要求較高，因此選用PK-15細胞既降低了操作的難度，又可以節(jié)約一部分成本。本試驗根據TGEV毒株的特性，選用了PK-15細胞，并在細胞維持液里加入了終質量濃度為5 μg/mL的胰酶，使細胞在第4代產生細胞病變。

體外組織培養(yǎng)法是體外篩選抗病毒中草藥的主要方法，常用的檢測方法有病毒致細胞病變抑制法、染料攝入法、MTT法、空斑減少法等。病毒致細胞病變抑制法比較直觀，但無法進行統(tǒng)計學計算。所以本試驗又結合了MTT法，可比較加藥組和病毒對照組活細胞數量是否有顯著差異，從而確定中草藥是否發(fā)揮了抗病毒的效果。采用MTT法應注意的問題有：MTT應保存于-20 ℃，而且操作過程中需要避光，以免MTT分解；MTT在細胞中的作用時間不宜太長，一般為4 h；MTT作用后可采用二甲基亞砜(DMSO)溶解藍色結晶，也可以用酸化異丙醇溶解，因為DMSO有一定毒性，而酸化異丙醇則沒有，因此本試驗選用酸化異丙醇，既起到良好的溶解結晶的作用，又降低了操作的危險性。

本試驗研究了4味中藥的體外抗病毒作用，結果顯示，黃芩和黃芪對病毒有抗吸附作用，大黃、金錢草對TGEV有直接滅活作用。黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，具有抗菌、抗病毒、抗炎及抗腫瘤等功效，其有效成分是黃酮類化合物。研究表明，黃芩多糖能抑制雞新城疫病毒感染雞胚成纖維細胞[13]；Zandi等[14]報道黃芩苷可抑制登革熱病毒的復制。黃芪的有效成分是黃芪多糖，可提高機體免疫力，增強宿主抗病毒能力。Kallon等[15]報道黃芪在體內外均可抑制H9N2禽流感病毒的感染；Jiang等[16]報道黃芪多糖可抑制雞傳染性法氏囊病毒的細胞感染。本試驗結果也顯示，黃芩和黃芪對TGEV的細胞感染有一定的抗吸附作用。大黃對多種DNA、RNA病毒都有抑制作用[17-18]。本試驗結果表明大黃有直接殺滅TGEV的作用。金錢草，又名馬蹄香，藥典記載有“清熱除濕，利尿通淋”的作用，其成分包括生物堿、黃酮苷類，用于治療黃疸、尿赤、癰腫、疔瘡、肝膽結石和尿路結石等癥。金錢草可用于治療人輪狀病毒感染引起的腹瀉[19]，也可用于犬細小病毒引起的腸炎的治療[20]。但金錢草的抗TGEV病毒作用尚未見報道。本研究表明，金錢草能直接滅活TGEV，拓展了金錢草的應用范圍。綜上所述，黃芪和黃芩對TGEV有抑制吸附的作用，可以作為預防TGEV感染的候選藥物使用；大黃、金錢草對TGEV有直接殺傷的作用，可以作為治療TGEV的候選藥物使用。

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Anti-TGEV effects of four herbs

WEI Wen-qiang1,2,WU Run1,LIU Lei1

(1CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China；2MedicalCollege,HenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China)

【Objective】 This study investigated the inhibition effects of four herbs (Astragalus,Scutellaria,Rhubarb and Loosestrife) against TGEVinvitro. 【Method】 The effective components of four herbs were extracted by traditional water-boiling method and their maximum safe concentrations for PK-15 cells were determined.The inhibition activity of four herbs against TGEV infection was determined by cytopathic effect method.The minimal antiviral concentrations and inhibition indexes of the four herbs were tested by MTT method.【Result】 The maximum safe concentrations of herbs Astragalus,Scutellaria,Rhubarb and Loosestrife were 50,12.50,6.25,and 6.25 mg/mL,respectively.Scutellaria and Astragalus inhibited the absorption of TGEV on PK-15 cells with the inhibition index of 8 and 4,respectively.Rhubarb and Loosestrife inactivated TGEV directly with the inhibition index of 8.【Conclusion】 Astragalus,Scutellaria,Rhubarb and Loosestrife all inhibited TGEVinvitro.

herb;antivirus;cytopathic effect;MTT assay

時間:2015-11-11 16:16

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.12.005

2014-03-20

甘肅省農業(yè)科技專項農業(yè)科技示范基地建設項目(0623006)

衛(wèi)文強(1981-)，男，河南洛陽人，講師，博士，主要從事微生物學研究。E-mail:greatdream123@163.com

劉 磊(1960-)，男，四川成都人，教授，博士，主要從事免疫學研究。E-mail:liuleigs@163.com

S858.283.72

A

1671-9387(2015)12-0023-06

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151111.1616.010.html