楊志方，肖 瀟，司美茹，成娟麗,2，沈錫輝，王 瑤

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2 運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000)

谷氨酸棒桿菌中苯酚羥化酶的鑒定及功能研究

楊志方1，肖 瀟1，司美茹1，成娟麗1,2，沈錫輝1，王 瑤1

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2 運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000)

【目的】 鑒定谷氨酸棒狀桿菌中ncgl2588基因編碼的苯酚羥化酶，并驗(yàn)證其在苯酚降解中的作用?！痉椒ā?構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌ncgl2588基因缺失突變株，比較突變株和野生型菌株利用苯酚能力的差異；同時(shí)將ncgl2588 基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET28a中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，利用IPTG誘導(dǎo)重組菌株原核表達(dá)，純化并測(cè)定重組蛋白對(duì)苯酚的羥化作用。【結(jié)果】 成功構(gòu)建了谷氨酸棒狀桿菌ncgl2588基因缺失突變株，其在以苯酚為惟一碳源和能源的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，而野生型谷氨酸棒狀桿菌能正常生長(zhǎng)；pET28a-ncgl2588重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)分子質(zhì)量為73 ku的目的蛋白，此蛋白酶活為0.37 mmol/(min·mg)；在以苯酚為惟一碳源和能源培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌時(shí)，苯酚羥化酶得到最高表達(dá)，用其他芳香族化合物培養(yǎng)則苯酚羥化酶表達(dá)較少；進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，谷氨酸棒狀桿菌中的苯酚羥化酶與酵母Trichosporoncutaneum中的苯酚羥化酶序列同源性高達(dá)43%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于與細(xì)菌中苯酚羥化酶的同源性?！窘Y(jié)論】 谷氨酸棒狀桿菌中的ncgl2588基因編碼苯酚羥化酶，且該酶為可誘導(dǎo)酶，在苯酚降解中發(fā)揮著重要作用。

谷氨酸棒狀桿菌；基因敲除；苯酚羥化酶

苯酚等芳香族化合物在環(huán)境污染物中占有很大比例，并且可以在高等動(dòng)物和人體內(nèi)富集，當(dāng)富集到一定濃度時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重傷害，而且芳香族化合物由于結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，因此很難用物理化學(xué)方法降解[1-2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多微生物有降解苯酚的能力，并且其降解機(jī)制已經(jīng)基本闡明，在降解苯酚的各種酶中，苯酚羥化酶可催化苯酚生成鄰苯二酚，是降解苯酚過(guò)程的首要步驟，因此受到關(guān)注。根據(jù)不同菌株中苯酚羥化酶的特性可大致將其分為3個(gè)類別：一是ComamonastestosteroniR5、PseudomonasputidaCF600和BH[3-5]等革蘭氏陰性細(xì)菌中的苯酚羥化酶，這是一種由6個(gè)亞基組成的蛋白復(fù)合酶體； 二是BacillusthermoglucosidasiusA7 和BacillusstearothermophilusBR219[6-7]等革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中的苯酚羥化酶，是由亞基PheA和PheB組成的異源四聚體(PheA2PheB2)，這2個(gè)亞基單獨(dú)存在時(shí)并無(wú)轉(zhuǎn)化苯酚的活性，只有共同組成四聚體時(shí)才有降解苯酚的能力；三是絲孢酵母Trichosporoncutaneum和PseudomonaspickettiiPKO1[8-9]中的苯酚羥化酶，是由單一蛋白組成的同源二聚體。

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)屬于高GC含量的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，廣泛分布于土壤、沉淀物等自然環(huán)境中，能降解包括苯酚在內(nèi)的多種芳香族化合物，但其苯酚降解機(jī)制尚未闡明[10-14]。本研究通過(guò)同源序列比對(duì)分析谷氨酸棒狀桿菌CorynebacteriumglutamicumRES167中ncgl2588基因與酵母Trichosporoncutaneum中苯酚羥化酶之間的相似性，并對(duì)該基因進(jìn)行突變體表型分析和酶學(xué)鑒定，以期闡明該基因與苯酚羥化酶的關(guān)系，為了解谷氨酸棒狀桿菌降解苯酚的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株、質(zhì)粒及其培養(yǎng)

本研究所使用的菌株谷氨酸棒狀桿菌C.glutamicumRES167、大腸桿菌E.coliDH5α、BL21(DE3)及質(zhì)粒pET28a、pK18mobsacB均由西北農(nóng)林科技大學(xué)沈錫輝教授實(shí)驗(yàn)室保存。E.coli、C.glutamicum用LB培養(yǎng)基分別在37和30 ℃下培養(yǎng)，LB培養(yǎng)基配方為：酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。測(cè)定谷氨酸棒狀桿菌野生型和突變株對(duì)苯酚的利用能力時(shí)采用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方為：Na2HPO4·12H2O 2.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.03 g/L，NH4Cl 0.53 g/L，微量元素溶液1 mmol/L，酵母粉0.05 g/L，調(diào)節(jié)pH值至8.4。

根據(jù)需要，確定培養(yǎng)大腸桿菌所用抗生素終質(zhì)量濃度為：卡那霉素50 μg/mL，氨芐青霉素100 μg/mL，氯霉素20 μg/mL； 確定培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌所用抗生素終質(zhì)量濃度為：卡那霉素25 μg/mL，氯霉素10 μg/mL。

1.2 基因操作

谷氨酸棒狀桿菌基因組DNA按Tauch等[15]的方法制備，DNA酶切、連接、質(zhì)粒提取、凝膠電泳等按Sambrook等[16]的方法進(jìn)行，谷氨酸棒狀桿菌的電轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[17]的方法。試驗(yàn)過(guò)程中所用限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶均為NEB公司(美國(guó))生產(chǎn)，pfuDNA聚合酶和TaqDNA聚合酶為全式金公司(中國(guó)北京)生產(chǎn)。

1.3 ncgl 2588缺失突變株的構(gòu)建

利用引物Up F (5′-CGCAGGATCCCGCTTC-GGCCAGGTCAGGCC-3′)和Up R (5′-TCCATTGGGTCACCGGTTGC-3′)擴(kuò)增ncgl2588基因上游(894 bp)片段，利用引物Down F (5′-GCAAC-CGGTGACCCAATGGATCCCCAAAATGAAAG-GCGCAC-3′)和Down R(5′-CCGACTCGAGTCG-CCGGGTTTCCACTCAGG-3′) 擴(kuò)增ncgl2588基因下游(824 bp)片段(引物下劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn))，然后混合上、下游片段作為模板，用引物Up F和Down R進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到一段1 800 bp左右的重疊片段，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后將此片段連接至同樣經(jīng)酶切處理的pK18mobsacB質(zhì)粒，即得到敲除質(zhì)粒pK18mobsacB-Δ2588。敲除質(zhì)粒pK18mobsacB-Δ2588的構(gòu)建流程見圖1。

通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將此敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入谷氨酸棒狀桿菌RES167中，在含25 μg/mL卡那霉素的LB平板上篩選第1次同源重組成功的陽(yáng)性克隆，將此陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后均勻涂布于含有200 g/L蔗糖的LB平板上，篩選發(fā)生第2次同源重組的克隆(對(duì)卡那霉素敏感)，即可獲得ncgl2588 基因缺失的突變株。

圖1 敲除質(zhì)粒pK18mobsacB-Δ2588的構(gòu)建流程

進(jìn)一步以Up F/Down R為引物，對(duì)谷氨酸棒狀桿菌野生型菌株和敲除ncgl2588基因的突變菌株、陽(yáng)性對(duì)照pK18mobsacB-Δ2588質(zhì)粒進(jìn)行PCR，以驗(yàn)證突變株是否構(gòu)建成功。

1.4 谷氨酸棒狀桿菌野生型和突變株在不同碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況

以苯甲酸鈉和苯酚分別為惟一碳源、能源，苯甲酸鈉和苯酚的終濃度均為2 mmol/L，將谷氨酸棒狀桿菌野生型菌株和突變株用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基于30 ℃、180 r/min空氣浴中振蕩培養(yǎng)，每隔2.5 h取2 mL菌液用721紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，根據(jù)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600數(shù)值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 ncgl 2588基因的原核表達(dá)及純化

以谷氨酸棒狀桿菌基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增ncgl2588基因，正向引物為5′-TCCACATATG-CAGTTTCATTATGAAG-3′(下劃線為NdeⅠ位點(diǎn))，反向引物為5′-CAACGCGGCCGCTTAGTTCGCGTTGATTAG-3′(下劃線為NotⅠ酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。純化后的PCR產(chǎn)物用NdeⅠ和NotⅠ雙酶切后與同樣酶切處理的表達(dá)載體pET28a連接，轉(zhuǎn)化DH5α得到含pET28a-ncgl2588質(zhì)粒的菌株。將重組的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主BL21(DE3)中，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.4時(shí)，加入0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后用6×His親和柱純化重組蛋白。SDS-PAGE所用分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，利用考馬斯亮藍(lán)R-250染色后觀察并拍照[18]。

1.6 ncgl 2588重組蛋白酶活性的測(cè)定

酶活反應(yīng)體系參照Neujahr等[9]的方法并稍作調(diào)整。酶促反應(yīng)體系組成為：0.15 mmol/L NADPH、1 mmol/L FAD、1 mmol/L苯酚、1 mmol/L EDTA、50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 (pH 7.5) ，總體積200 μL，最后加入30 μg原核表達(dá)的ncgl2588重組蛋白(即苯酚羥化酶)以起始反應(yīng)。其中FAD為苯酚羥化酶的輔酶，苯酚羥化酶在輔酶FAD的幫助下將苯酚羥基化，羥基化所需要的H+由NADPH提供，因此可以通過(guò)測(cè)定NADPH在340 nm處吸收值的衰減來(lái)計(jì)算酶活。

1.7 不同碳源條件下苯酚羥化酶相對(duì)活性的測(cè)定

以苯酚、葡萄糖、間苯二酚、苯甲酸鈉、對(duì)甲酚、間羥基苯甲酸和2,4-二羥基苯甲酸分別作為碳源，所有碳源的終濃度均為2 mmol/L，在含不同碳源和能源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌RES167菌株16 h；10 000g下收集菌體并用磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)清洗2次，最終用10 mL磷酸鉀緩沖液懸浮細(xì)胞；超聲破碎菌體(工作3 s，間歇5 s，99次，200 W)；12 000g、4 ℃下離心20 min，收集上清可溶部分用Bradford法對(duì)總蛋白進(jìn)行蛋白定量，用牛血清蛋白BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品[19]。通過(guò)測(cè)定全蛋白對(duì)苯酚的降解能力(酶活測(cè)定方法見1.6節(jié))來(lái)計(jì)算苯酚羥化酶在全蛋白中所占的比例，即苯酚羥化酶的相對(duì)活性。突變株Δ2588 在以葡萄糖為碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，測(cè)定全蛋白中苯酚羥化酶的活性，用于排除其他酶對(duì)苯酚的非特異性活性。

1.8 谷氨酸棒狀桿菌中苯酚羥化酶的進(jìn)化樹分析

利用MEGA4.0對(duì)其他菌株中已經(jīng)確定為苯酚羥化酶的蛋白氨基酸序列構(gòu)建生物系統(tǒng)進(jìn)化樹，以分析谷氨酸棒狀桿菌中苯酚羥化酶的進(jìn)化關(guān)系及與其他菌中該酶的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 ncgl 2588基因缺失突變株的構(gòu)建及其對(duì)苯酚的利用

2.1.1 突變株的構(gòu)建 為了敲除ncgl2588基因以鑒定其在谷氨酸棒狀桿菌降解苯酚中的作用，首先構(gòu)建敲除質(zhì)粒pK18mobsacB-Δ2588，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將pK18mobsacB-Δ2588質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒狀桿菌RES167中，并篩選發(fā)生2次同源重組的重組子(對(duì)卡那霉素敏感)，便獲得了ncgl2588基因缺失突變株。對(duì)谷氨酸棒狀桿菌野生型菌株、敲除ncgl2588基因的待測(cè)菌株及陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pK18mobsacB-Δ2588進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果野生型菌株擴(kuò)增出一條4 000 bp左右的片段；交換成功菌株與質(zhì)粒pK18mobsacB-Δ2588均應(yīng)擴(kuò)增出一條 1 800 bp左右的片段，篩選ncgl2588基因已被成功敲除的待測(cè)菌株(圖2)，將此菌株命名為CorynebacteriumglutamicumΔ2588，說(shuō)明ncgl2588基因缺失突變株構(gòu)建成功。

圖2 ncgl 2588基因缺失突變株的PCR鑒定M.Trans2K DNA ladder；1～8.待測(cè)缺失突變株；9.野生型菌株；10.pK18mobsacB-Δ 2588質(zhì)粒

2.1.2 對(duì)苯酚的利用 在以苯酚為惟一碳源和能源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)野生型谷氨酸棒狀桿菌能以苯酚為惟一碳源和能源生長(zhǎng)，而基因缺失突變株Δ2588完全喪失了利用苯酚的能力(圖3-A)，證明ncgl2588基因是谷氨酸棒狀桿菌降解苯酚所必需的。突變株Δ2588和野生型菌株在以苯甲酸鈉為惟一碳源、能源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中均能正常生長(zhǎng)(圖3-B)，表明ncgl2588基因并不是谷氨酸棒狀桿菌降解苯甲酸鈉所必需的，這與理論推測(cè)一致。

2.2 ncgl 2588基因的克隆表達(dá)及其重組蛋白的酶活性

ncgl2588基因原核表達(dá)菌株在IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)了1條大小為73 ku的目的蛋白，這與ncgl2588基因翻譯產(chǎn)物的理論分子質(zhì)量相吻合(圖4-A)。將此蛋白純化后測(cè)定酶活，可知該蛋白對(duì)苯酚的降解活性為0.37 mmol/(min·mg)(圖4-B)。進(jìn)一步證明ncgl2588基因在C.glutamicumRES167中編碼了苯酚羥化酶。

圖3 谷氨酸棒狀桿菌野生型和Δ2588突變株的生長(zhǎng)曲線 A.2 mmol/L苯酚為惟一碳源和能源培養(yǎng)基；B.2 mmol/L苯甲酸鈉為惟一碳源和能源培養(yǎng)基
Fig.3 Growth of wild-type and deletion mutant ofCorynebacteriumglutamicumRES167 A.Minimal medium with 2 mmol/L phenol as sole carbon and energy source;B.Minimal medium with 2 mmol/L sodium benzoate as sole carbon and energy source

圖4 谷氨酸棒狀桿菌ncgl 2588基因的表達(dá)純化(A)及重組蛋白的酶活性(B) 1.未誘導(dǎo)BL21上清；2.誘導(dǎo)后BL21上清；3.純化后的重組蛋白

2.3 碳源對(duì)谷氨酸棒狀桿菌中苯酚羥化酶相對(duì)活性的影響

從表1可以看出，當(dāng)以葡萄糖為惟一碳源和能源時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌中苯酚羥化酶的相對(duì)活性最低；而當(dāng)以苯酚為惟一碳源和能源時(shí)，苯酚羥化酶相對(duì)活性較高；以其他不同芳香族化合物作為碳源時(shí)苯酚羥化酶相對(duì)活性雖然也較高，但除對(duì)甲酚外，其余碳源條件下的苯酚羥化酶相對(duì)活性均不如苯酚高。以上結(jié)果說(shuō)明，ncgl2588基因所表達(dá)的苯酚羥化酶是一個(gè)可誘導(dǎo)酶，并且苯酚及其他多種芳香化合物均可誘導(dǎo)其表達(dá)；而ncgl2588基因缺失突變株Δ2588仍然能檢測(cè)到少量苯酚羥化酶活性，很可能是其他酶對(duì)苯酚的非特異性酶活。

表1 以不同碳源培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌RES167時(shí)ncgl 2588基因所表達(dá)的苯酚羥化酶的活性Table 1 Relative activity of phenol hydroxylase expressed by ncgl 2588 inCorynebacterium glutamicum RES167 cultured with various carbon sources

2.4 ncgl 2588基因進(jìn)化樹的構(gòu)建與分析

通過(guò)對(duì)谷氨酸棒狀桿菌CorynebacteriumglutamicumRES167基因組序列的分析，認(rèn)為ncgl2588基因與酵母Trichosporoncutaneum中的苯酚羥化酶基因有很高的相似性，可能是該菌中編碼苯酚羥化酶的基因。將已知的苯酚羥化酶基因與ncgl2588基因進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹，以確定苯酚羥化酶基因在各種菌株中的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，谷氨酸棒狀桿菌的苯酚羥化酶屬于第3類別，與酵母T.cutaneum中的苯酚羥化酶序列同源性高達(dá)43%，明顯高于與細(xì)菌PseudomonaspickettiiPKO1中苯酚羥化酶的同源性，說(shuō)明谷氨酸棒狀桿菌的苯酚羥化酶與酵母T.cutaneum中苯酚羥化酶的親緣關(guān)系更為接近。

圖5 谷氨酸棒狀桿菌與其他菌株中苯酚羥化酶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 PhcN (ComamonastestosteroniR5)、PoxD (Ralstoniasp.E2)、AfpN (AlcaligenesfaecalisIS-46)、 MphN (AcinetobactercalcoaceticusPHEA-2)、DmpN (Pseudomonassp.strain CF600)和 PheA (PseudomonasputidaBH) 是這些菌種中苯酚羥化酶最大的組分(此類苯酚羥化酶為多酶復(fù)合體)； TbmD (Burkholderiasp.strainJS150)是甲苯/苯/氯苯單加氧酶中的一個(gè)組分；PheA (BacillusstearothermophilusBR219) 和 PheA(Bacillusthermoglucosidasius)是這2個(gè)菌株中最大的亞基；TbuD(PseudomonaspickettiiPKO1)和 Phenol hydroxylase (Trichosporoncutaneum)是這2個(gè)菌株中的苯酚羥化酶(此類苯酚羥化酶由單一肽鏈組成)
Fig.5 Phylogenetic analysis of phenol hydroxylases inCorynebacteriumglutamicumand other strains PhcN (ComamonastestosteroniR5),PoxD (Ralstoniasp.E2),AfpN (AlcaligenesfaecalisIS-46), MphN (AcinetobactercalcoaceticusPHEA-2),DmpN (Pseudomonassp.strain CF600) and PheA (PseudomonasputidaBH) are the largest subunit of phenol hydroxylases.TbmD (Burkholderiasp.strain JS150) is the component of toluene/benzene/chlorobenzene monooxygenase.PheA (BacillusstearothermophilusBR219) and PheA (Bacillusthermoglucosidasius) are the larger subunit of phenol hydroxylase.TbuD (PseudomonaspickettiiPKO1) and Phenol hydroxylase (Trichosporoncutaneum) are the single chain protein of phenol hydroxylase

3 討 論

本研究通過(guò)基因敲除技術(shù)，構(gòu)建了谷氨酸棒狀桿菌突變株C．glutamicumΔ2588，并將其對(duì)芳香化合物的降解特性與野生型谷氨酸棒狀桿菌C.glutamicumRES167進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)突變株C．glutamicumΔ2588在以苯酚為惟一碳源和能源的培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)，說(shuō)明其已喪失利用苯酚的能力，表明ncgl2588基因與C.glutamicumRES167菌株對(duì)苯酚的降解密切相關(guān)。另外，本研究構(gòu)建了表達(dá)載體pET28a-ncgl2588，并通過(guò)原核表達(dá)將其在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，得到大小為73 ku的目的蛋白，且此蛋白對(duì)苯酚具有很高的活性(0.37 mmol/(min·mg))，進(jìn)一步證明ncgl2588基因在C.glutamicumRES167中編碼了苯酚羥化酶。本試驗(yàn)中，以苯酚和對(duì)甲酚為惟一碳源培養(yǎng)時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌苯酚羥化酶的活性較高，而在以葡萄糖為惟一碳源時(shí)活性最低，說(shuō)明苯酚羥化酶在谷氨酸棒狀桿菌中的表達(dá)為不嚴(yán)格的誘導(dǎo)表達(dá)型；缺失突變株Δ2588在以葡萄糖為惟一碳源時(shí)仍然具有少量的活性，通過(guò)Blast蛋白序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，苯酚羥化酶中并沒(méi)有與其相同的同源序列，所以突變株Δ2588具有少量活性的原因可能是其他酶對(duì)苯酚的非特異性酶活。

通過(guò)氨基酸同源性分析與預(yù)測(cè)，谷氨酸棒狀桿菌中的苯酚羥化酶屬于硫氧還蛋白超家族，并且很有可能為同源二聚體結(jié)構(gòu)。氨基酸同源比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它與酵母T.cutaneum中的苯酚羥化酶相似性最高，為43%；與細(xì)菌P.pickettiiPKO1和BacillusthermoglucosidasiusA7中苯酚羥化酶的相似性卻很低，這在物種進(jìn)化上也是一個(gè)比較有趣的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能是基因轉(zhuǎn)移引起的[20]。

雖然微生物廣泛分布于環(huán)境中, 并經(jīng)分離得到一些能夠降解苯酚等芳香族化合物的微生物[21-22]，但是對(duì)于微生物在苯酚等芳香族化合物污染生物修復(fù)中的作用尚未有足夠的重視。谷氨酸棒狀桿菌作為1株比較成熟的工業(yè)菌株，無(wú)論是培養(yǎng)條件還是生物降解作用都非常適合擴(kuò)大應(yīng)用。本研究通過(guò)克隆、表達(dá)及基因敲除分析，確定了ncgl2588基因編碼苯酚羥化酶，該酶參與苯酚等芳香族化合物的降解途徑，這不僅豐富了具有降解苯酚能力的菌種庫(kù)，也有望通過(guò)后期的基因工程改造，更好地將其應(yīng)用于苯酚等芳香族化合物的污染治理中。

[1] Gupta S S,Stadler M,Noser C A,et al.Rapid total destruction of chlorophenols by activated hydrogen peroxide [J].Science,2002,296(5566):326-328.

[2] Timmis K N,Pieper D H.Bacteria designed for bioremediation [J].Trends in Biotechnology,1999,17(5):201-204.

[3] Nordlund I,Powlowski J,Shingler V.Complete nucleotide sequence and polypeptide analysis of multicomponent phenol hydroxylase fromPseudomonassp strain CF600 [J].Journal of Bacteriology,1990,172(12):6826-6833.

[4] Takeo M,Maeda Y,Okada H,et al.Molecular cloning and sequencing of the phenol hydroxylase gene fromPseudomonasputidaBH [J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1995,79(5):485-488.

[5] Teramoto M,Futamata H,Harayama S,et al.Characterization of a high-affinity phenol hydroxylase fromComamonastestosteroniR5 by gene cloning,and expression inPseudomonasaeruginosaPAO1c [J].Molecular and General Genetics,1999,262(3):552-558.

[6] Kirchner U,Westphal A H,Müller R,et al.Phenol hydroxylase fromBacillusthermoglucosidasiusA7,a two-protein component monooxygenase with a dual role for FAD [J].J Biol Chem,2003,278(48):47545-47553.

[7] Kim I C,Oriel P J.Characterization of theBacillusstearothermophilusBR219 phenol hydroxylase gene [J].Applied and Environmental Microbiology,1995,61(4):1252-1256.

[8] Kukor J J,Olsen R H.Complete nucleotide sequence oftbuD,the gene encoding phenol/cresol hydroxylase fromPseudomonaspickettiiPKO1 and functional analysis of the encoded enzyme [J].Journal of Bacteriology,1992,174(20):6518-6526.

[9] Neujahr H Y,Gaal A.Phenol hydroxylase from yeast purification and properties of the enzyme fromTrichosporoncutaneum[J].Eur J Biochem,1973,35(2):386-400.

[10] Shen X H,Huang Y,Liu S J.Genomic analysis and identification of catabolic pathways for aromatic compounds inCorynebacteriumglutamicum[J].Microbes and Environments,2005,20(3):160-167.

[11] Kalinowski J,Bathe B,Bartels D,et al.The completeCorynebacteriumglutamicumATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of l-aspartate-derived amino acids and vitamins [J].Journal of Biotechnology,2003,104(1/2/3):5-25.

[12] Silberbach M,Sch?fer M,Hüser A H,et al.Adaptation ofCorynebacteriumglutamicumto ammonium limitation:A global analysis using transcriptome and proteome techniques [J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(5):2391-2402.

[13] Claes W A,Pühler A,Kalinowski J.Identification of twoprpDBCgene clusters inCorynebacteriumglutamicumand their involvement in propionate degradation via the 2-methylcitrate cycle [J].Journal of Bacteriology,2002,184(10):2728-2739.

[14] Sch?fer A,Tauch A,J?ger W,et al.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from theEscherichiacoliplasmids pK18 and pK19: Selection of defined deletions in the chromosome ofCorynebacteriumglutamicum[J].Gene,1994,145(1):69-73.

[15] Tauch A,Kassing F,Kalinowski J,et al.TheCorynebacteriumxerosiscomposite transposonTn5432 consists of two identical insertion sequences,designatedIS1249,flanking the erythromycin resistance geneermCX[J].Plasmid,1995,34(2):119-131.

[16] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning [M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.

[17] Tauch A,Kirchner O,L?ffler B,et al.Efficient electrotransformation ofCorynebacteriumdiphtheriaewith a mini-replicon derived from theCorynebacteriumglutamicumplasmid pGA1 [J].Current Microbiology,2002,45(5):362-367.

[18] Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophageT4 [J].Nature,1970,227(5259):680-685.

[19] Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J].Analytical Biochemistry,1976,72(1):248-254.

[20] Ravi J,Maria C R,James A L.Horizontal gene transfer among genomes:The complexity hypothesis [J].Proc Natl Acad Sci,1999,96:3801-3806.

[21] Sikkema J,de Bont J A.Metabolism of tetralin (1,2,3,4-tetrahydronaphthalene) inCorynebacteriumsp strain C125 [J].Applied and Environmental Microbiology,1993,59(2):567-572.

[22] Itoh N,Yoshida K,Okada K.Isolation and identification of st-yrene-degradingCorynebacteriumstrains,and their styrene metabolism [J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,1996,60(11):1826-1830.

Characterization and functional identification of phenol hydroxylase gene inCorynebacteriumglutamicum

YANG Zhi-fang1,XIAO Xiao1,SI Mei-ru1,CHENG Juan-li1，2,SHEN Xi-hui1,WANG Yao1

(1CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2LifeSciencesDepartment,YunchengUniversity,Yuncheng,Shanxi044000,China)

【Objective】 This study aimed to identify the functional and biochemical characterizations of putative phenol hydroxylase encoded byncgl2588 inCorynebacteriumglutamicumRES167. 【Method】 Thencgl2588 deleted mutant ofC.glutamicumRES167 was constructed to determine the difference in phenol degradation compared to wild-type.The recombinant phenol hydroxylase was expressed inE.coliBL21(DE3) by IPTG and purified to determine the activity of catalyzing phenol hydroxylation.【Result】 The obtainedncgl2588 gene deletion mutant ofC.glutamicumRES167 could not grow in the medium that used phenol as sole carbon and energy source,while the wild-type strain grew very well.The pET28a-ncgl2588 plasmid expressed was inE.coliBL21(DE3) as a single band with molecular mass of 73 ku and specific activity to phenol of 0.37 mmol/(min·mg).Phenol hydroxylase reached highest expression when cultured in phenol while it was in low level when cultured in other aromatic compounds.The phenol hydroxylase inC.glutamicumRES167 shared 43% phylogenetic identity with yeastTrichosporoncutaneum,much higher than the identity with bacteria.【Conclusion】 This study confirmed that thencgl2588 gene encoded phenol hydroxylase inC.glutamicumRES167 as an induced enzyme.It could play an important role in phenol degradation.

CorynebacteriumglutamicumRES167;knock out;phenol hydroxylase

時(shí)間:2015-11-11 16:16

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.12.027

2014-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170100，31270078)；國(guó)家“863”高新技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102802)

楊志方(1989-)，男，山東聊城人，在讀碩士，主要從事微生物生理生化研究。E-mail:yangzf1989@126.com

王 瑤(1972-)，女，陜西寶雞人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物生理生化研究。 E-mail:wangyao@nwsuaf.edu.cn

Q936

A

1671-9387(2015)12-0191-08

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