劉勇，付小凱，李陽，閆輝，容蓉，鞏麗麗，蔣海強(qiáng)，呂青濤

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

HPLC法同時測定半枝蓮中原兒茶酸和香草酸的含量*

劉勇，付小凱，李陽，閆輝，容蓉，鞏麗麗，蔣海強(qiáng)，呂青濤

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

建立高效液相色譜法同時測定半枝蓮中原兒茶酸和香草酸含量的方法。采用Zorbax SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.2%磷酸水溶液-甲醇作淋洗液梯度洗脫，流量為1.0 mL／min，紫外檢測波為260 nm，柱溫為25℃。半枝蓮中原兒茶酸和香草酸質(zhì)量濃度分別在2.66～31.92 μg／mL，2.86～34.32 μg／mL與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，檢出限分別為0.56,0.57 μg／mL。原兒茶酸、香草酸的加樣回收率分別為101.4%，99.4%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.76%，2.21% (n=9)。該方法適用于半枝蓮中原兒茶酸和香草酸的含量測定。

高效液相色譜法；半枝蓮；原兒茶酸；香草酸

半枝蓮(Scutllaria barbata D.Don)為唇形科植物的干燥全草，味辛、苦，性寒，具有清熱解毒、化瘀利尿之功效，多用于治療疔瘡腫毒、咽喉腫痛、跌撲傷痛、水腫、黃疸、蛇蟲咬傷［1］。半枝蓮中含有原兒茶酸、香草酸等多種有機(jī)酸類化合物［2-3］。研究表明，原兒茶酸具有抗菌、抗氧化、介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用［4-6］；香草酸是中藥胡黃連的有效成分之一，對酪氨酸酶具有明顯的抑制作用［7-8］。目前半枝蓮中原兒茶酸的含量測定方法已有文獻(xiàn)報道［9-10］，但半枝蓮中香草酸的含量測定方法尚未建立。筆者根據(jù)其它藥材中二者含量同時測定的方法［11-12］，建立了HPLC法同時測定半枝蓮中原兒茶酸及香草酸含量的方法，為半枝蓮藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，配有DAD檢測器、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī)，美國安捷倫科技公司；

電子天平：AE240型，瑞士梅特勒公司；

原兒茶酸、香草酸標(biāo)準(zhǔn)品：批號分別為YJ0623YB14、S20J6G1，純度均大于98%，上海源葉生物科技有限公司；

半枝蓮藥材：產(chǎn)地及批號分別為湖北100920，130501，安徽1212010，河北131202，江蘇20140101，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定皆為唇形科植物半枝蓮；

甲醇：色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；

磷酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 對照品溶液的制備

分別取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品和香草酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，分別以甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，分別制得質(zhì)量濃度為53.2 μg／mL的原兒茶酸對照品溶液和質(zhì)量濃度為57.2 μg／mL的香草酸對照品溶液。精密量取原兒茶酸對照品溶液和香草酸對照品溶液各500 μL，以甲醇稀釋并定容至2 mL容量瓶中，制得混合對照品溶液。

1.3 供試品溶液的制備

將半枝蓮藥材粉碎，過3號篩。取半枝蓮粉末約3 g，精密稱定，置于250 mL 圓底燒瓶中，加入甲醇60 mL，水浴回流提取3次，每次2.0 h，合并3次提取液，過濾并濃縮，以色譜甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制得供試品溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.2%磷酸水溶液(A)-甲醇(B)，流量為1.0 mL／min；梯度洗脫：0～45 min，B為20%～40%；柱溫：25℃；檢測波長：260 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。在此色譜條件下，對混合對照品溶液及供試品(批號為20140101)溶液進(jìn)行測定，色譜圖見圖1、圖2。

圖1 混合對照品液相色譜圖

圖2 供試品高效液相色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

分別考察了甲醇和無水乙醇加熱回流提取效果，結(jié)果顯示采用甲醇加熱回流提取，測得原兒茶酸和香草酸含量(分別為68.6，78.8 μg／g)高于無水乙醇加熱回流提取時的含量(分別為42.3， 27.0 μg／g)。因此選擇甲醇對半枝蓮進(jìn)行提取。

2.2 流動相的選擇

分別以乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水作為流動相，考察了等度洗脫和梯度洗脫供試品中原兒茶酸和香草酸的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫時，原兒茶酸和香草酸二者的分離度均在1.5 以上，待測組分色譜峰形良好，因此選用甲醇-0.2%磷酸水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

2.3 檢測波長的選擇

使用DAD檢測器，在190～400 nm范圍內(nèi)采集光譜圖，結(jié)果顯示原兒茶酸和香草酸在260 nm左右有最大吸收，因此選擇260 nm作為檢測波長。

2.4 工作曲線方程及檢出限

分別精密量取原兒茶酸和香草酸對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.2 mL，置于2 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，按1.4 色譜條件測定各峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、原兒茶酸或香草酸的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得原兒茶酸線性回歸方程為Y=34 073X-22.251 (r=0.999 7)，線性范圍為2.66～31.92 μg／mL；香草酸線性回歸方程為Y=35 762X-15.685 (r=0.999 7)，線性范圍為2.86～34.32 μg／mL。分別精密量取原兒茶酸和香草酸對照品溶液，逐步稀釋，按1.4 色譜條件進(jìn)行測定，直至信噪比S／N≥3，此時進(jìn)樣濃度即為對照品的檢出限，測得原兒茶酸的檢出限為0.56 μg／mL，香草酸的檢出限為0.57 μg／mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一批號(1212010)半枝蓮藥材的供試品溶液，按1.4色譜條件，連續(xù)測定6次，記錄原兒茶酸和香草酸的峰面積，測定結(jié)果見表1。由表1可知，原兒茶酸和香草酸測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.64%和1.23%，表明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(20140101)半枝蓮藥材的供試品溶液，按1.4色譜條件，分別在0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)樣分析，記錄原兒茶酸和香草酸的色譜峰面積，結(jié)果見表2。峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.82%和1.05%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(20140101)半枝蓮粉末(過3號篩)3 g，精密稱定6 份，按1.3方法制備供試品溶液，按1.4色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。由表3可知，藥材中原兒茶酸的平均含量為68.9 μg／g，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%；香草酸的平均含量為80.3 μg／g，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已知含量同一批號(20140101)半枝蓮粉末3 g，精密稱量9份，按照樣品中各成分含量的低、中、高3個水平，分別精密加入原兒茶酸和香草酸對照品溶液，按1.3方法制備供試品溶液，按1.4色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。由表4可知，原兒茶酸和香草酸的平均回收率分別為101.4%和99.4%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.76%和2.21%(n=9)，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表4 原兒茶酸和香草酸的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測定

按1.3方法制備5批半枝蓮藥材供試品溶液，按1.4色譜條件測定原兒茶酸和香草酸的色譜峰面積，計(jì)算樣品中二者的含量，結(jié)果見表5。由表5可知，不同產(chǎn)地及批號的半枝蓮中原兒茶酸和香草酸的差異較大，其中江蘇產(chǎn)半枝蓮中二者含量均較高。

表5 半枝蓮藥材中原兒茶酸和香草酸的含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)語

建立了HPLC 法同時測定半枝蓮中原兒茶酸和香草酸含量的方法，方法的靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度滿足實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同產(chǎn)地及批號的半枝蓮中原兒茶酸和香草酸的含量差異較大，其中江蘇產(chǎn)半枝蓮中的原兒茶酸及香草酸的含量均較高。

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Determination of Protocatechuic Acid and Vanillic Acid in Scutllaria Barbata D.Don by HPLC

Liu Yong， Fu Xiaokai， Li Yang， Yan Hui， Rong Rong， Gong Lili， Jiang Haiqiang， Lyu Qingtao
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China)

A method for simultaneously determination of protocatechuic acid and vanillic acid in scutllaria barbata D.Don was established. A Zorbax SB-C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm) was adopted with mobile phase of methanol -0.2% phosphoric acid with gradient elution at the flow rate of 1.0 mL／min，the detection wavelength was set at 260 nm and the column temperature was 25℃. The calibration curves for protocatechuic acid and vanillic acid were linear in the range of 2.66-31.92，2.86-34.32 μg／mL，respectively. Both of the correlation coefficients were 0.999 7， the detection limits were 0.56, 0.57 μg／mL，respectively. The average recoveries of protocatechuic acid and vanillic acid were 101.4% and 99.4%，respectively，the relative standard deviations were 1.76% and 2.21% (n=9). The method is suitable for determination of protocatechuic acid and vanillic acid in Scutllaria barbata D.Don.

HPLC method; scutllaria barbata D.Don; protocatechuic acid; vanillic acid

O657.7

：A

：1008-6145(2015)04-0020-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.04.006

*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173614)

聯(lián)系人：呂青濤；E-mail: luqingtao9@ 163.com

2015-04-12