鐘雨珅，王歷瓊，韓小丹，黃先智，丁曉雯,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400716；2.西南大學(xué)蠶學(xué)與生物系統(tǒng)研 究所，重 慶 400716）

正交試驗優(yōu)化超聲波輔助同時提取桑葉總黃酮、單寧工藝

鐘雨珅1，王歷瓊1，韓小丹1，黃先智2，丁曉雯1,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400716；2.西南大學(xué)蠶學(xué)與生物系統(tǒng)研 究所，重 慶 400716）

采用超聲波輔助法同時提取桑葉中總黃酮、單寧并用分光光度法對其含量進(jìn)行測定，為這兩類物質(zhì)快速分離測定提供參考。在單因素試驗基礎(chǔ)上用正交試驗優(yōu)化，得到超聲波同時提取桑葉總黃酮、單寧的最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度80℃、提取時間10 min、超聲功率128 W。在此條件下測得桑葉單寧提取量為6.32 mg/g，總黃酮提取量為18.55 mg/g。結(jié)論：與傳統(tǒng)方法相比，超聲波輔助提取法具有提取時間短、提取溫度低、提取率高、精確度高的優(yōu)點，且同時提取總黃酮、單寧的效果較好，適合于桑葉中總黃酮、單寧分離測定的提取。

超聲波；總黃酮；單寧；桑葉

桑樹在我國已有4 000多年的栽培歷史，具有較高的經(jīng)濟、藥用價值。近年來桑園種植的面積增加很快，但對桑葉的利用除桑蠶養(yǎng)殖外，應(yīng)用較少，出現(xiàn)了桑葉過剩的現(xiàn)象[1-2]。因此開發(fā)桑葉的新用途，不僅可以提高桑葉的利用價值，還可以增加蠶桑產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益和社會效益。

單寧作為一種具有較高功能價值的酸性物質(zhì)，其抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抑菌性等作用被逐步揭示[3-5]。然而我國單寧的來源主要依靠進(jìn)口，價格非常昂貴。如果能利用桑葉提取單寧，不但可以提高桑葉的附加值，還可以增加單寧的來源。黃酮類化合物中的許多種類具有較高的藥用價值，研究表明其在抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抑制心血管疾病等方面均具有較好的功效[6-9]。

國內(nèi)外對總黃酮、單寧提取的研究較多，但從桑葉中同時提取總黃酮、單寧的報道卻并不多見。目前提取桑葉單寧、總黃酮主要采用的是回流提取法，但該方法有提取率低、生產(chǎn)周期長的缺點，本研究中所使用的超聲波輔助提取法則具有收率高、速率快、能耗低等特點[10-12]。為了充分利用桑葉這一優(yōu)良的植物資源，本實驗對超聲波輔助同時提取桑葉中總黃酮、單寧的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為桑葉中這兩類物質(zhì)的快速分離、測定提供新的參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

嘉陵江2號桑葉粉（Morus alba） 西南大學(xué)桑園；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 北京德威鈉生物技術(shù)有限公司；單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 美國Sigma-Aldrich公司；常用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

KQ5200DB型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；Centrifuge5810型離心機 德國Eppendorf公司；UV2450S（E）紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總黃酮含量的測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取120℃條件下常壓干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.015 0 g，用70%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，其質(zhì)量濃度為0.30 mg/mL。分別準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定吸光度[13-16]，以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到回歸方程。

測定樣品總黃酮含量時需先進(jìn)行提取，取1.00 g桑葉粉于50 mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，放入超聲波清洗機中提取，提取完畢后，于5 000 r/min離心2 min，取出上清液，在殘渣中加入乙醇溶劑再提取，重復(fù)3次，合并上清液并離心、過濾，收集濾液，定容至100 mL待測。測定時取25 mL用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定其吸光度[17]。

1.3.2 樣品單寧含量的測定

單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取單寧酸0.010 g，用純水溶解并定容至100 mL，其質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL。分別準(zhǔn)確吸取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加Folir-Denis試劑2.5 mL及飽和碳酸鈉溶液5 mL，加水稀釋至刻度并充分混合，靜置30 min后，在750 nm波長處測其吸光度[18-19]。以單寧酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到回歸方程。

測定樣品單寧含量時，取1.0 mL 1.3.1節(jié)已提取并定容至100 mL的待測樣液，加Folir-Denis試劑2.5 mL及飽和碳酸鈉溶液5 mL，加水稀釋至刻度并充分混合，靜置30 min后在750 nm波長處測其吸光度。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響

料液比1∶20（g/mL）、提取溫度60℃、提取時間10 min、超聲功率80 W的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%對桑葉中總黃酮和單寧提取量的影響，篩選出較佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3.3.2料液比對提取效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度60℃、提取時間10 min、超聲功率80 W條件下，分別按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比加入70%乙醇溶液處理桑葉，考察料液比對桑葉中總黃酮和單寧提取量的影響，篩選出較佳料液比。

1.3.3.3提取溫度對提取效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20、提取時間10 min、超聲功率80 W條件下，分別按30、40、50、60、70、80℃的提取溫度處理桑葉，考察提取溫度對桑葉中總黃酮和單寧提取量影響，篩選出較佳提取溫度。

1.3.3.4提取時間對提取效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20、提取溫度60℃、超聲功率80 W條件下，分別按每次5、10、15、20、25 min的提取時間處理桑葉，考察提取時間對桑葉中總黃酮和單寧提取量的影響，篩選出較佳提取時間。

1.3.3.5超聲功率對提取效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20、提取時間10 min、提取溫度為60℃條件下，分別按64、80、96、112、128、144、160 W超聲功率處理桑葉，考察超聲功率對桑葉中總黃酮和單寧提取量的影響，篩選出較佳超聲功率。

1.3.4正交試驗優(yōu)化超聲波提取條件

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇對桑葉中單寧、總黃酮提取量影響比較大的因素，較好的水平進(jìn)行正交試驗，得到用超聲波同時提取桑葉單寧、總黃酮的最優(yōu)因素水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均重復(fù)3次以上，所得實驗數(shù)據(jù)為用Excel 2003分析、處理相關(guān)數(shù)據(jù)，用Origin 7.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁、單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=11.622x-0.003 1，r=0.999 7。單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=0.089 9x+0.004 2，r=0.999 7。上述標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明方程的線性關(guān)系良好，可用于樣品總黃酮、單寧含量的測定。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響

總黃酮在乙醇中有較好的溶解度，單寧酸的極性較強，根據(jù)相似相溶原理，選用乙醇作為提取溶劑[20-21]。乙醇體積分?jǐn)?shù)對桑葉總黃酮、單寧提取效果的影響如圖1所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency

由圖1可知，其他條件一定時，單寧和總黃酮的提取量均隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，總黃酮、單寧在乙醇中的溶解度達(dá)到最高，提取量達(dá)到最大，分別為9.69 mg/g和6.26 mg/g。因此，選取70%為較佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.2 料液比對提取效果的影響

料液比是考察物質(zhì)提取效果的重要因素，選擇最佳的料液比不僅可以將所需物質(zhì)提取充分，還能避免試劑的浪費。料液比對桑葉總黃酮、單寧提取量的影響如圖2所示。

圖2 料液比對提取量的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction efficiency

由圖2可知，其他條件一定，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時桑葉單寧提取量達(dá)到最大，為6.38 mg/g；料液比為1∶25時桑葉總黃酮提取量達(dá)到最大，為9.70 mg/g，單寧的提取量也達(dá)到6.37 mg/g。綜合考察同時提取的效果、單位溶劑的提取效率及最大產(chǎn)出比，將較佳的料液比定為1∶25。

2.2.3 提取時間對提取效果的影響

通常情況下目標(biāo)物質(zhì)的提取量隨著超聲時間的延長而增大，在得到充分提取后則開始下降[22]。提取時間對桑葉總黃酮、單寧提取效果的影響如圖3所示。

圖3 提取時間對提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonication time on extraction efficiency

由圖3可知，其他條件一定，當(dāng)提取時間為10 min時單寧提取量達(dá)到最大，為6.79 mg/g，此后隨時間的延長而減小，表明10 min時單寧得到了充分提取。而當(dāng)提取時間延長到15 min時總黃酮提取量達(dá)到最大為19.16 mg/g。充分考察同時提取的效果、成本控制和實驗消耗等因素，將較佳的提取時間定為10 min。

2.2.4 提取溫度對提取效果的影響

超聲提取時，目標(biāo)物質(zhì)均存在著一個最適提取溫度，在該溫度條件下提取量達(dá)到最大[12]。提取溫度對桑葉總黃酮、單寧提取效果的影響如圖4所示。

圖4 提取溫度對提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由圖4可知，其他條件一定，當(dāng)提取溫度為70℃時單寧、總黃酮提取量均達(dá)到最大，分別為7.14 mg/g和18.30 mg/g，這表明70℃為二者的最適提取溫度。因此將較佳的提取溫度定為70℃。

2.2.5 超聲功率對提取效果的影響

圖5 超聲功率對提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic powers on extraction efficeincy

提高超聲功率可利用超聲波的機械效應(yīng)，增大介質(zhì)分子的運動速率，從而增大介質(zhì)分子與生物分子的摩擦力，使目標(biāo)成分更多地溶解于溶劑中[23]。超聲功率對桑葉總黃酮、單寧提取效果的影響如圖5所示。

由圖5可知，在試驗功率范圍內(nèi)，桑葉總黃酮提取量在16.37～18.73 mg/g之間，單寧提取量在5.68～7.46 mg/g之間，且二者提取量隨超聲功率的增大并無明顯的增大或減小趨勢，表明超聲功率對桑葉總黃酮、單寧提取效果的影響是有限的。因此不將超聲功率作為考察的因素。

通過單因素試驗得到同時提取桑葉總黃酮、單寧較好提取條件是乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶25、提取時間10 min、提取溫度70℃，超聲功率固定在128 W。

2.3 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以對桑葉總黃酮、單寧提取量影響較大的因素和較好的條件作為因素水平進(jìn)行正交試驗，優(yōu)化出提取桑葉中總黃酮和單寧的最佳條件。綜合考慮同時提取桑葉總黃酮、單寧時二者的提取量、提取條件及實驗消耗，以總評分的方式考察二者的綜合提取效果，且將總黃酮、單寧的評分比重分別定為40%、60%。正交試驗結(jié)果如表1所示。

表1 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Results of orthogonal array design

由表1可知，在正交試驗范圍內(nèi)得到的最佳試驗條件為A3B3C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶30、提取溫度80℃、提取時間10 min、超聲功率128 W，在此條件下進(jìn)行驗證實驗，測得桑葉的單寧提取量為6.32 mg/g，總黃酮提取量為18.55 mg/g。

為了驗證單寧、總黃酮測定結(jié)果的準(zhǔn)確度，取一定量桑葉粉并分別加入單寧標(biāo)品1.0、2.0、3.0 mg和蘆丁標(biāo)品12.0、23.4、46.1 mg，在最佳條件下提取并測定其中單寧、總黃酮的含量。單寧的回收率在85%～92%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于5%；總黃酮的回收率在94%～104%之間，RSD小于5%，符合對該指標(biāo)的分析要求。

2.4 超聲波輔助提取桑葉總黃酮、單寧與傳統(tǒng)提取方法的比較

提取桑葉總黃酮的傳統(tǒng)方法為回流提取法[24]。用該方法得到的桑葉總黃酮提取量及其與超聲波輔助提取法的對比如表2所示。

表2 回流提取與超聲波輔助提取對比Table 2 Comparison between reflux extraction and ultrasonic-assisted extraction

提取桑葉單寧的傳統(tǒng)方法為熱水提取法[25]。用該方法得到的桑葉單寧提取量及其與超聲波輔助提取法的對比如表3所示。

表3 熱水提取與超聲波輔助提取對比Table 3 Comparison between hot water extraction and ultrasonic-assisted extraction

由表2、3可知，超聲波輔助提取桑葉總黃酮、單寧得到的提取量均大于二者的傳統(tǒng)提取方法，且精確度更高。此外，綜合分析各方法的提取條件，超聲波輔助提取法與回流提取法、熱水提取法相比均具有提取時間短、提取溫度低的優(yōu)點。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化，確定超聲波同時提取桑葉總黃酮、單寧的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶30、提取溫度80 ℃、提取時間10 min、超聲功率128 W，在此條件下測得的單寧提取量為6.32 mg/g，總黃酮提取量為18.55 mg/g，回收率分別在在85%～92%之間和94%～104%之間，RSD小于5%。相比于傳統(tǒng)工藝對單一物質(zhì)的提取研究，本實驗的工藝條件可使桑葉中總黃酮、單寧的提取量均達(dá)到較高水平，適于桑葉中總黃酮、單寧的同時提取。

與傳統(tǒng)的回流提取法、熱水提取法相比，超聲波輔助提取法具有提取時間短、提取溫度低、提取率高、精確度高的優(yōu)點，且同時提取總黃酮、單寧時可使二者的提取量均達(dá)到較高水平，提取效果較好，適合于桑葉中總黃酮、單寧分離測定的提取。

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Optimization of Simultaneous Ultrasonic-Assisted Extraction of Total Flavonoids and Tannins from Mulberry Leaves

ZHONG Yushen1, WANG Liqiong1, HAN Xiaodan1, HUANG Xianzhi2, DING Xiaowen1,*

(1. Key Laboratory of Processing and Storage of Agricultural Products of Chongqing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. Institute of Bombycology and Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China)

Ultrasonic-assisted extraction was adopted to simultaneously extract total flavonoids and tannins from mulberry leaves and these two classes of compounds were spectrophotometrically determined. Results showed that the best conditions for simultaneous ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids and tannins from mulberry leaves were as follows: ethanol concentration, 75%; material to liquid ratio, 1:30; extraction temperature, 80℃; extraction time, 10 min; and ultrasonic power, 128 W. The yields of tannins and total flavonoids were 6.32 mg/g and 18.55 mg/g, respectively under these optimized conditions. Compared with the traditional extraction methods, UAE achieved a higher extraction efficiency and a higher accuracy in a shorter time at a lower extraction temperature, making it an appropriate method to extract total flavonoids and tannins from mulberry leaves.

ultrasonic; total flavonoids; tannins; mulberry leaves

TS218

A

1002-6630（2015）12-0044-05

10.7506/spkx1002-6630-201512008

2014-11-17

國家桑蠶產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蠶繭綜合利用項目（CARS-22-ZJ0503）

鐘雨珅（1991—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：zhonglele91@163.com

*通信作者：丁曉雯（1963—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：xiaowend@sina.com