（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013）

化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測(cè)蘇丹紅Ⅰ

范 艷，孟 瑋，朱立鑫，劉仁榮*，許 龍，裘雪梅，楊帆帆

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013）

為檢測(cè)食品中蘇丹紅Ⅰ殘留，建立間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）法。通過(guò)優(yōu)化包被抗原中本抗原與載體物質(zhì)的量比、包被抗原質(zhì)量濃度、抗體稀釋比例，建立競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。線性范圍為0.156～5 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.078 9 ng/mL，IC50為0.679 ng/mL。CLEIA回收率為75.08%～112.18%，變異系數(shù)為8.89%～15.61%；通過(guò)與酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法進(jìn)行比較，在相同抗原抗體質(zhì)量濃度條件下，CLEIA法測(cè)定的IC50較ELISA方法降低30%，具有較高的靈敏度。

蘇丹紅Ⅰ；化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析；酶聯(lián)免疫吸附分析

蘇丹紅染料是一系列化學(xué)合成的脂溶性偶氮化合物，在工業(yè)上廣泛應(yīng)用，如地板、塑料、印刷用油墨等的染色[1]。因?yàn)槠渚哂辛己玫闹裕环ㄉ特湆⑻K丹紅染料作為食品添加劑加入辣椒、番茄等食品中，進(jìn)入人體內(nèi)的蘇丹紅經(jīng)各種酶系代謝后，形成的部分代謝產(chǎn)物具有致突變、致癌變的生物活性[2-3]。1995年歐盟國(guó)家已經(jīng)禁止將蘇丹紅作為食用色素，2005年英國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)署就食品添加蘇丹紅色素發(fā)出警告[4]，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將蘇丹紅歸為三類(lèi)致癌物。因此需要對(duì)食品中含有的蘇丹紅染料進(jìn)行監(jiān)控[5-6]。

現(xiàn)階段檢測(cè)蘇丹紅染料的方法有色譜法、光譜法、免疫檢測(cè)方法和電化學(xué)方法[7-9]等。色譜法主要包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器和電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用等[13-15]。光譜法有紅外光譜快速檢測(cè)[16]，這些方法具有應(yīng)用廣泛、重復(fù)性好和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但需要昂貴的設(shè)備、復(fù)雜的樣品處理過(guò)程和較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間。免疫學(xué)檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法[17-18]、化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫（chemiluminescentenzyme immunoassay，CLEIA）法[19-22]等。CLEIA法是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，同時(shí)具備化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性[23]。近年來(lái)已經(jīng)大規(guī)模應(yīng)用到食品有毒有害殘留分析。

本實(shí)驗(yàn)基于魯米諾-辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行了探索和優(yōu)化，建立了檢測(cè)蘇丹紅Ⅰ（SudanⅠ）的間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA方法。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好，能滿(mǎn)足大規(guī)模樣品的快速篩選。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG美國(guó)Sigma公司；抗SudanⅠ單克隆抗體 本實(shí)驗(yàn)室自制；化學(xué)發(fā)光魯米諾底物 廈門(mén)赫利森公司。

包被液：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），pH 7.4；封閉液：50 g/L脫脂奶；清洗液：含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液：30%甲醇溶液。實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Luminoskan Ascent化學(xué)發(fā)光儀、Multiskan MK3酶標(biāo)儀、Wellwash versa洗板機(jī) 美國(guó)Thermo公司；96孔酶標(biāo)板與96孔發(fā)光板 美國(guó)Costar公司。

1.3方法

1.3.1包被抗原SudanⅠ-BSA的制備

采用活潑酯法進(jìn)行半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)，稱(chēng)取羧基化SudanⅠ2 mg[24]，N-羥基琥珀酰亞胺2.31 mg，碳二亞胺3.85 mg，溶于400μL N,N-二甲基甲酰胺后，在21℃，120 r/min反應(yīng)12 h。稱(chēng)取30 mg BSA溶于12 mL 0.13 mol/L NaHCO3溶液中。將活性酯溶液按照不同物質(zhì)的量比例緩慢滴入BSA溶液中，17℃，120 r/min反應(yīng)8 h。取出反應(yīng)液放入透析袋中，在PBS中透析3 d，偶聯(lián)產(chǎn)物用紫外光譜掃描，根據(jù)其在波長(zhǎng)280、490 nm處的吸光度A分析測(cè)定偶聯(lián)物的物質(zhì)的量比。

1.3.2間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法的建立

用PBS稀釋SudanⅠ-BSA包被在96孔化學(xué)發(fā)光板，120μL/孔，4℃包被過(guò)夜；用PBST洗板4次后，每孔加入320μL脫脂奶在37℃保溫保濕2 h。洗板4次后，每孔加入50μL合適質(zhì)量濃度的抗體稀釋液和50μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，在37℃保溫保濕45 min。洗板4次，加入1∶3 000酶標(biāo)二抗，37℃保溫保濕45 min。洗板4次，加入化學(xué)發(fā)光底物100μL/孔，立即用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)各孔化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

1.3.2.1最佳包被抗原質(zhì)量濃度的選擇

用方陣滴定法，選取0.5、1、2、4、8μg/mL質(zhì)量濃度的SudanⅠ-BSA包被96孔板，抗SudanⅠ單克隆抗體按照1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1 024 000進(jìn)行稀釋?zhuān)凑臻g接CLEIA法步驟，選取最佳包被質(zhì)量濃度。

1.3.2.2最佳抗體稀釋比例的選擇

按照選取的最佳SudanⅠ-BSA質(zhì)量濃度包被96孔板后，選擇1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000這4種抗體稀釋比例按照間接競(jìng)爭(zhēng)法，測(cè)定對(duì)應(yīng)的化學(xué)發(fā)光值（relative lighe unit，RLU）和IC50，以IC50和RLUmax/IC50作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。RLUmax/IC50最大的選為最佳抗體稀釋比例。

1.3.2.3間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照確定的最佳抗原包被質(zhì)量濃度，最佳抗體稀釋比例，以標(biāo)準(zhǔn)品SudanⅠ質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以I/I0（I為不同標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度時(shí)的RLU；I0為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0 ng/mL時(shí)的RLU）為縱坐標(biāo)，通過(guò)RIDAWIN免疫分析軟件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3實(shí)際樣品的加標(biāo)回收及與ELISA方法的對(duì)比

稱(chēng)取辣椒粉1 g放入離心管中，分別添加SudanⅠ標(biāo)準(zhǔn)品0、0.1、0.5、1μg/g。每管加入6 mL乙腈，四管辣椒粉旋渦振蕩器劇烈振蕩10 min后，超聲波提取20 min，然后4 500 r/min離心15min。取上清液3 mL，放入玻璃試管中，用N2吹干，每管加入1 mL甲醇溶解，然后加入蒸餾水配制成30%的甲醇溶液，分別用CLEIA和ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)（各測(cè)4次，取平均值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SudanⅠ-BSA人工抗原的制備

通過(guò)活潑酯法將SudanⅠ與BSA偶聯(lián)并透析后得到了人工抗原SudanⅠ-BSA，人工抗原的紫外光譜掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。4條曲線代表4種不同物質(zhì)的量比例偶聯(lián)的SudanⅠ-BSA。BSA標(biāo)準(zhǔn)品的特征吸收峰是280 nm，SudanⅠ的特征吸收峰490 nm，人工抗原在波長(zhǎng)280 nm與490 nm處均出現(xiàn)了吸收峰，通過(guò)繪制SudanⅠ與BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出物質(zhì)的量偶聯(lián)比例。

圖1 4 種偶聯(lián)比的SudanⅠ-BSA紫外掃描圖Fig.1 UV spectra of Sudan Ⅰ-BSA with different conjugation ratios

2.2CLEIA工作條件的確定

2.2.1包被抗原質(zhì)量濃度的確定

根據(jù)方陣滴定結(jié)果，在一定的抗體稀釋比例下，2μg/mL SudanⅠ-BSA包被時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度明顯高于0.5、1μg/mL。4μg/mL與8μg/mL包被時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度變化逐漸平緩，分別將SudanⅠ-BSA用2、4μg/mL和8μg/mL 3種質(zhì)量濃度進(jìn)行包被，比較其IC50變化，見(jiàn)圖2，在相同的抗體稀釋比例下，2μg/mL包被時(shí)測(cè)定的IC50低于4μg/mL與8μg/mL，綜合RLU與IC50選擇2μg/mL作為其最優(yōu)包被質(zhì)量濃度。

圖2 包被質(zhì)量濃度對(duì)CLEIA的影響Fig.2 Effect of coating antigen concentration on CLEIA

2.2.2抗體稀釋比例的確定

SudanⅠ-BSA包被質(zhì)量濃度為2μg/mL時(shí)，隨著抗體稀釋比例的增大，IC50先明顯降低，后變化平緩。RLU隨抗體稀釋比例的增大而顯著減小。根據(jù)RLUmax/IC50值的變化，在抗體稀釋比例為1∶64 000時(shí)RLUmax/IC50達(dá)到最大，見(jiàn)圖3。所以選擇抗體最佳稀釋比例為1∶64 000。

圖3 抗體稀釋比例對(duì)CCLLEEIIAA的影響Fig.3 Effect of antibody dilution ratio on CLEIA

2.2.3包被抗原SudanⅠ-BSA的半抗原與載體偶聯(lián)比的影響

圖4 SudanⅠ-BSA物質(zhì)的量比對(duì)CLEIA與ELISA的影響Fig.4 Effects of molar ratio of SudanⅠ to BSA on CLEIA and ELISA

SudanⅠ-BSA用4種偶聯(lián)比例用活潑酯法合成后，按照2.2.1節(jié)和2.2.2節(jié)的優(yōu)化過(guò)程得到抗原包被質(zhì)量濃度和抗體稀釋比例后，4種不同偶聯(lián)比的抗原對(duì)CLEIA和ELISA兩種方法測(cè)定的IC50影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，不同的偶聯(lián)比對(duì)CLEIA的IC50影響不大，對(duì)ELISA，偶聯(lián)比在0.27∶1和11.8∶1時(shí)，IC50都顯著上升，在偶聯(lián)比值為2.05∶1時(shí)，IC50最小，證明SudanⅠ與BSA物質(zhì)的量比為2.05∶1時(shí)，比較合適。所以包被抗原選擇偶聯(lián)比為2.05∶1的SudanⅠ-BSA。

2.2.4CLEIA和ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖 55 CCLLEEIIAA間接競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線Fig.5 Indirect competitive inhibition curve of CLEIA

圖6 ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線Fig.6 Indirect competitive inhibition curve of ELISA

SudanⅠ-BSA包被質(zhì)量濃度為2μg/mL，抗體稀釋比例為1∶64 000，建立的CLEIA間接競(jìng)爭(zhēng)曲線見(jiàn)圖5。標(biāo)準(zhǔn)品SudanⅠ質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以I/I0為縱坐標(biāo)。IC50為0.679 ng/mL，線性范圍是0.132～5 ng/mL，線性方程為y=-0.45x+0.403 7，R2=0.989 1；選擇IC10為最低檢測(cè)限，最低檢測(cè)限是0.078 9 ng/mL。建立的ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)曲線見(jiàn)圖6，IC50為1.0 ng/mL，線性范圍是0.2～5 ng/mL，線性方程為y=-0.443x+0.490，R2=0.998 0；選擇IC10為最低檢測(cè)限，最低檢測(cè)限為0.118 ng/mL。

2.3樣品的檢測(cè)及與ELISA方法的對(duì)比

表11 CCLLEEIIAA加標(biāo)回收率Table 1 Recovery rates of CLEIA for spiked sample

由表1、2可知，CLEIA法測(cè)定的加標(biāo)回收率為75.08%～112.18%，變異系數(shù)為8.89%～15.61%。ELISA法測(cè)定的加標(biāo)回收率為94.59%～150.18%，變異系數(shù)為5.3%～10.9%。建立的CLEIA法能檢測(cè)實(shí)際樣品。

表2 ELISA加標(biāo)回收率Table 2 Recovery rates of ELISA for spiked sample

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化包被抗原質(zhì)量濃度、包被抗原偶聯(lián)比、抗體稀釋比例，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法檢測(cè)辣椒粉中的SudanⅠ的添加量。IC50為0.679 ng/mL，線性范圍為0.132～5 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.078 9 ng/mL。包被抗原偶聯(lián)比對(duì)CLEIA方法的IC50影響較小，CLEIA方法的發(fā)光強(qiáng)度RLU信號(hào)放大倍數(shù)優(yōu)于ELISA方法的吸光度，在相同的低偶聯(lián)比抗原包被質(zhì)量濃度條件下，CLEIA方法的IC50較穩(wěn)定。相同抗原抗體質(zhì)量濃度條件下，CLEIA法測(cè)定的IC50較ELISA方法降低30%左右，相比ELISA方法，CLEIA方法靈敏度較高，檢測(cè)限低于ELISA方法。測(cè)定的辣椒粉中SudanⅠ加標(biāo)回收率為75.08%～112.18%，變異系數(shù)為8.89%～15.61%。與ELISA方法對(duì)比，變異系數(shù)稍大，是由于化學(xué)發(fā)光方法很靈敏，操作中的各種因素均會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成較大影響，回收率較低，可能是SudanⅠ吸附性較強(qiáng)，在加標(biāo)回收過(guò)程中損失較大。因此實(shí)驗(yàn)操作需要快速和準(zhǔn)確，相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件也需進(jìn)一步優(yōu)化。綜合比較兩種方法，CLEIA檢測(cè)方法具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度，符合實(shí)際樣品中蘇丹紅大批量檢測(cè)的需求，可用于相關(guān)食品安全污染物和非法添加物的快速高效的檢測(cè)。

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Determination of Sudan Ⅰ by Chemiluminescent Enzyme Immunoassay

FAN Yan, MENG Wei, ZHU Lixin, LIU Renrong*, XU Long, QIU Xuemei, YANG Fanfan
(College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

An indirect competitive chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) was developed for the detection of Sudan Ⅰ in food products. TheCLEIAconditions including molar ratio of coating antigen to carrier, antigen concentration, and dilution ratio of antibody were optimized. In the standard curve of the optimizedCLEIA, the linear range was 0.1 56-5 ng/mL, the half maximal inhibitory concentration (IC50) was 0.679 ng/mL and the limit of detection (LOD) was 0.078 9 ng/mL. TheCLEIAshowed good recoveries with spiked chili powder ranging from 75.08%to 112.18%. Compared with ELISA method, the IC50values ofCLEIAwas reduced by 30%. The proposed method has a high sensitivity.

Sudan Ⅰ; chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA); enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

TQ610.7；O657.3

A

1002-6630（2015）12-0209-04

10.7506/spkx1002-6630-201512039

2014-08-03

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20122BAB214006）；江西省教育廳科技項(xiàng)目（GJJ13573）

范艷（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：fy12271227@163.com

*通信作者：劉仁榮（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：lilirenrong@hotmail.com