彭本英+袁漢文+庹銳

摘要：研究了三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）血細(xì)胞分類、形態(tài)特征以及溫度和蚌齡對三角帆蚌血細(xì)胞密度的影響。結(jié)果表明，溫度和蚌齡對三角帆蚌血細(xì)胞的密度均有明顯的影響，溫度越高，血細(xì)胞密度越高;蚌齡越大，血細(xì)胞密度越高;三角帆蚌的血細(xì)胞分為大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、透明細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、血栓細(xì)胞，依次占血細(xì)胞總數(shù)的5.5%、56.8%、9.5%、22.5%和5.7%。

關(guān)鍵詞：三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）;血細(xì)胞;形態(tài);密度

中圖分類號：S966.22+1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2857-03

Morphology and Density Effect Factors on Hemocytes of Hyriopsis cumingii Lea

PENG Ben-ying，YUAN Han-wen，TUO Rui

（School of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou ?434025， Hubei， China）

Abstract： In this study， hemocyte classification， morphology of different types in Hyriopsis cumingii， and the effect of temperature and age on hemocyte concentration were studied， which would guide for the disease control of Hyriopsis cumingii. The results showed that temperature and age had significant effects on hemocyte density. The higher temperature， the higher hemocyte density， and there is the same correlation between age and hemocyte density. The haemocytes of H.cumingii were classified as 5 types based on the characteristics， amount of granule and its relative size. There were big granulocyte， small granulocyte， hyalinocyte， lymphoid-like cell and thrombocyte， which account for 5.5%， 56.8%， 9.5%， 22.5% and 5.7% respectively.

Key words： Hyriopsis cumingii Lea; hemocyte; morphology; concentration

貝類沒有免疫球蛋白和淋巴系細(xì)胞，其免疫防御功能主要依賴于非特異性免疫[1]，由血細(xì)胞來行使免疫防御功能。血細(xì)胞是貝類免疫的基礎(chǔ)，不同類型的血細(xì)胞在細(xì)胞免疫過程中具有不同的功能。三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）是我國培育淡水珍珠的主要蚌種之一，病害的發(fā)生給三角帆蚌培育造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。三角帆蚌天然免疫系統(tǒng)是抵御外來病原微生物入侵的屏障，主要依靠血細(xì)胞的吞噬作用來完成，溶酶體酶、凝集素、抗菌肽等體液免疫因子以殺菌、促進(jìn)吞噬等方式參與三角帆蚌的免疫防御。目前，國內(nèi)外關(guān)于三角帆蚌的血細(xì)胞報道較少，羅文等[2]對其進(jìn)行了初步研究，并將其血細(xì)胞初步分為無顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞。本研究對三角帆蚌的血細(xì)胞分類形態(tài)特征及密度影響因素進(jìn)行了研究，旨在為進(jìn)一步深入研究三角帆蚌的免疫機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 ?材料

三角帆蚌取自湖北省荊州市公安縣某珍珠養(yǎng)殖場，為蚌齡適中、健康無病的2～5齡三角帆蚌。

1.2 ?方法

1.2.1 ?溫度的設(shè)置 ?為了研究溫度對血細(xì)胞密度的影響，采用控溫棒加熱方式設(shè)置了12、15、18、21、24、27、30 ℃ 7個不同溫度，將三角帆蚌置于其中暫養(yǎng)1周左右，以待后續(xù)抽取血液。

1.2.2 ?三角帆蚌血細(xì)胞的采集 ?首先采用活體直接從閉殼肌抽血，由于活體直接采集，蚌兩殼咬合很緊，操作些許困難。然后采用緩慢加熱（每小時升溫3 ℃），使水溫緩慢上升到30 ℃時，加熱30 min，三角帆蚌處于麻醉狀態(tài)，兩殼自然地微微地張開，從閉殼肌部位容易抽取血液。

1.2.3 ?血細(xì)胞的計數(shù)及觀察 ?血細(xì)胞大小測量、血細(xì)胞計數(shù)和Giemsa染色參照文獻(xiàn)[3]的方法并略作改進(jìn)。取血后立即滴片，待血細(xì)胞貼壁后，用濾紙將上清小心吸干，甲醇固定后空氣干燥，Giemsa染色，DMXY顯微鏡觀察并拍照。血細(xì)胞的分類、比例以及特征均以3齡三角帆蚌為研究對象。

1.2.4 ?統(tǒng)計分析 ?采用Duncan's多重比較進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?溫度對三角帆蚌血細(xì)胞密度的影響

由圖1可以看出，血細(xì)胞的密度從12 ℃的1.42×106 個/mL下降到15 ℃的1.37×106個/mL，然后隨著溫度不斷升高，血細(xì)胞密度也不斷升高，30 ℃時達(dá)到最高，為2.19×106 個/mL。統(tǒng)計學(xué)分析表明，三角帆蚌處于12～18、21～27、30 ℃ 3個溫度范圍下血細(xì)胞密度差異顯著（P<0.05），而在12、15、18 ℃溫度下，三角帆蚌血細(xì)胞密度差異不顯著（P>0.05），在21、24、27 ℃溫度下血細(xì)胞密度差異也不顯著（P>0.05），這說明在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高，三角帆蚌血細(xì)胞密度緩慢增加，但溫度升高到一定值后，三角帆蚌血細(xì)胞密度則快速增加。endprint

2.2 ?不同蚌齡三角帆蚌血細(xì)胞密度

不同蚌齡三角帆蚌血細(xì)胞密度差異較大（表1）。由表1可以看出，隨著蚌齡增長，三角帆蚌血細(xì)胞密度不斷升高，5齡三角帆蚌血細(xì)胞密度顯著高于2～4齡三角帆蚌（P<0.05），2齡和3齡三角帆蚌血細(xì)胞密度差異不顯著（P>0.05）。4個蚌齡的三角帆蚌血細(xì)胞平均密度為2.09×106 個/mL。

2.3 ?三角帆蚌血細(xì)胞分類及特征

盡管三角帆蚌不同蚌齡階段其血細(xì)胞密度差異較大，但血細(xì)胞形態(tài)及每種血細(xì)胞所占的比例變化不大。因而下面以3齡三角帆蚌為例，介紹血細(xì)胞的形態(tài)及比例。

大顆粒細(xì)胞：胞體較大，橢圓形，胞體中有許多折光性很強(qiáng)的圓形大顆粒，細(xì)胞直徑為18.2 μm，占細(xì)胞總數(shù)的5.5%，由于大顆粒布滿胞體，所以一般都看不到細(xì)胞核。

小顆粒細(xì)胞：數(shù)量最多的一類細(xì)胞，占細(xì)胞總數(shù)的56.8%。胞體圓形或橢圓形，胞體中有許多小顆粒，細(xì)胞直徑為13.9 μm。細(xì)胞著色較淺，細(xì)胞核染成淺紅色。

透明細(xì)胞：圓形或橢圓形，細(xì)胞很小，直徑僅3.8 μm，占細(xì)胞總數(shù)的9.5%。細(xì)胞透明，胞質(zhì)少且均勻，無任何顆粒，細(xì)胞核居中或偏離一側(cè)，有1～2個細(xì)胞核。染色時著色較深，細(xì)胞核染成深紅色，細(xì)胞質(zhì)透明。

淋巴樣細(xì)胞：細(xì)胞具有脊椎動物典型的淋巴細(xì)胞形態(tài)，呈圓形或橢圓形，直徑約為16.4 μm，占細(xì)胞總數(shù)的22.5%。細(xì)胞核大，核質(zhì)比大，細(xì)胞核周圍僅有一薄層細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)透明。

血栓細(xì)胞：細(xì)胞形狀變化多樣，有圓形、橢圓形、梭型等形狀，細(xì)胞外具有長短不一的偽足。細(xì)胞直徑7.4 μm，占細(xì)胞總數(shù)的5.7%。

3 ?討論

近年來，雖然對貝類特別是雙殼類血細(xì)胞的形態(tài)和功能等已進(jìn)行了大量的研究，但由于分類標(biāo)準(zhǔn)不一，特別是因?yàn)椴煌愵惖难?xì)胞在形態(tài)上存在較大的差異，對貝類血細(xì)胞的分類迄今仍存在較大的分歧。大多數(shù)學(xué)者將貝類的血細(xì)胞分為兩大類，即透明細(xì)胞（無顆粒細(xì)胞）和顆粒細(xì)胞（包括大顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞），如貽貝（Mytilus edulis）[4]、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）、硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）、牡蠣（Crassostrea virginica）[5]、中國蛤蜊（Mactra chinensis） 和紫石房蛤（Saxudomus purpuratus）[6]、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、海灣扇貝（Argopecten irradians）、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）和毛蚶（Scapharca subcrenata）[7]。但在許多貝類中又發(fā)現(xiàn)了其他類型細(xì)胞，如在牡蠣和硬殼蛤的血細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了纖維細(xì)胞[8]、黃硨磲（Tridacnacrocea）中觀察到了桑葚樣細(xì)胞[9]、褶紋冠蚌（Gristaria plicata Lea）血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有漿細(xì)胞[10]、橢圓背角無齒蚌（Anodonta woodiana elliptica）中發(fā)現(xiàn)有淋巴樣細(xì)胞[11]、池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）中發(fā)現(xiàn)有漿液細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、梭形細(xì)胞和血栓細(xì)胞[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，三角帆蚌除了羅文等[2]報道的顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞外，還有淋巴樣細(xì)胞和血栓細(xì)胞。雖然根據(jù)形態(tài)學(xué)方法對貝類血細(xì)胞進(jìn)行分類，導(dǎo)致結(jié)果不一致，但由于形態(tài)學(xué)的分類方法比較簡單實(shí)用，并且其他分類方法（外源凝集素標(biāo)記法、單克隆抗體技術(shù)、免疫探針技術(shù)）也同樣存在著缺陷。

貝類血細(xì)胞的密度在不同的物種中差別很大甚至在同一物種中也因年齡、生理狀況、環(huán)境壓力和研究方法的不同而變化[13，14]。例如硬殼蛤[15]和辛辣梨溝貝（Scrobicularia plana）[16]個體間血細(xì)胞密度差異很大。本研究中2～5齡三角帆蚌血細(xì)胞平均密度為2.09×106 個/mL，這與貽貝、大刀蟶（Ensis siliqua）[17]、齒蝶蚌[12]、褶紋冠蚌[18]等蚌的血細(xì)胞密度處于同一數(shù)量級。血細(xì)胞數(shù)量是貝類重要的生理指標(biāo)，許多研究表明貝類血細(xì)胞密度還受溫度的影響[18，19]。三角帆蚌血細(xì)胞在低溫12～18 ℃之間平均密度為1.44×106 個/mL，在21～27 ℃之間血細(xì)胞平均密度為1.83×106 個/mL，30 ℃時為2.19×106 個/mL。同為淡水育珠蚌的褶紋冠蚌也有此規(guī)律，15 ℃時褶紋冠蚌血細(xì)胞密度為1.90×106 個/mL，30 ℃時血細(xì)胞密度達(dá)2.62×106 個/mL，但超過30 ℃血細(xì)胞密度反而下降[18]。在一定的溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高，貝類血細(xì)胞密度才不斷上升，超過一個溫度界限，溫度上升，密度反而下降[19]。影響血細(xì)胞密度除了上述描述的因素外，還有病原菌的感染情況[14]，與健康的櫛孔扇貝（Chlamys farreri）相比較，受感染的櫛孔扇貝其血細(xì)胞密度下降了8%。雖然影響血細(xì)胞密度的因素很多，但在南美洲貽貝（Perna perna）研究發(fā)現(xiàn)，性別并不影響其血細(xì)胞密度[20]。

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