康敬芹+呂躍東+陶琳+王勇+劉楊+張良

摘要：為了提高CTF619-D發(fā)酵液中的代謝物質(zhì)濃度，獲得更多有效抗菌活性成分，采用響應面法對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，CTF619-D菌株的最佳發(fā)酵條件為搖床轉(zhuǎn)速119.33 r/min、裝液量109.75 mL、溫度26.78 ℃。

關(guān)鍵詞：放線菌;發(fā)酵;優(yōu)化;響應面分析

中圖分類號：TS201.3 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2867-04

Liquid Fermentation Process Optimization for CTF619-D by Response Surface Method

KANG Jing-qin1， LV Yue-dong， TAO Lin2， WANG Yong1， LIU Yang1， ZHANG Liang1

（1.Liaoning University of Science and Technology， Anshan 114051，Liaoning，China;2.Shenyang Normal University， Shenyang 110034，China）

Abstract： In order to improve the concentration of metabolites in CTF619-D fermentation broth for more effective antimicrobial active ingredient the liquid fermentation conditions for CTF619-D were optimized by response surface method. The ?optimum fermentation conditions were： shaking speed of 119.33 r/min， liquid volume of 109.75 mL， and temperature of 26.78 ℃. The inhibition zone diameter was up to 27.58 mm under optimized conditions.

Key words： actinomycetes; fermentation; optimization; response surface analysis

放線菌是具有巨大使用價值的一類微生物，是抗生素的主要生產(chǎn)菌，是新醫(yī)藥、新農(nóng)藥和生物防治活菌劑研制的源頭[1]。目前，已知的抗生素大約有80%來自于放線菌，其產(chǎn)生的抗生素具有抗腫瘤、抗真菌、抗細菌、抗寄生蟲等多種活性[2]。在植物病害生物防治中，拮抗微生物主要是鏈霉菌屬及其相關(guān)類群[3]。據(jù)報道，淡紫灰鏈霉菌是一類重要的抗生素產(chǎn)生菌， 其產(chǎn)生的醫(yī)用抗生素如薰衣草菌素、鏈絲菌素和農(nóng)用抗生素如中生菌素等都已有廣泛的用途[4]。目前，國內(nèi)關(guān)于拮抗淡紫灰鏈霉菌鑒定的諸多研究中，除淡紫灰鏈霉菌海南變種外，未見有其他淡紫灰鏈霉菌變種的報道。因此，CTF619-D是一株有價值的具生物活性的生防菌株，期待進一步開發(fā)其在瓜果蔬菜病害防治領(lǐng)域中的應用。本試驗以菌株CTF619-D為發(fā)酵菌種，用響應面法對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化[5]，以實現(xiàn)試驗次數(shù)的最小化和多因素交互作用分析，并建立變量與響應量之間的模型，預測最優(yōu)的條件和結(jié)果，從而獲得該菌代謝產(chǎn)生有效抗菌活性成分的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，為該菌株在工業(yè)上大量生產(chǎn)代謝物質(zhì)提供一定的實踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株 ?供試菌株為放線菌菌株CTF619-D（由遼寧科技大學生物試驗室分離、篩選并保存）;指示菌株為番茄炭疽菌、黃瓜炭疽菌、蘋果腐爛菌等植物病原菌，由遼寧科技大學生物制藥工藝室提供。

1.1.2 ?儀器 ?HZQ-C型空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）、SPX-250B-G型光照培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、TGL-16C型高速離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）;ZHWY-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海向帆儀器有限公司）、ES-315型高壓滅菌鍋（杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司）、T-203型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）、SW-CJ-5型超凈工作臺（南京庚辰科學儀器公司）等。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?菌株的活化和發(fā)酵培養(yǎng) ?將保存的放線菌菌株CTF619-D接種于高氏1號固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，進行活化。然后將菌種接種至裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28℃、140 r/min培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)。

1.2.2 ?抑菌活性物質(zhì)的測定 ?將菌株CTF619-D接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，經(jīng)不同的發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，將菌液于4 000 r/min條件下無菌離心10 min。然后把無菌濾紙片在離心所得的上清液中浸泡3 min后置于接種農(nóng)業(yè)致病真菌的PDA平板中央，于25℃條件下恒溫培養(yǎng)72h后，再分別測量抑菌圈直徑，每個試驗均設(shè)3個重復，取平均值。確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.3 ?響應面法優(yōu)化發(fā)酵試驗

1）Placket-Burman（P-B）設(shè)計試驗[6]。首先采用單因素試驗依次對淀粉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、種子菌齡、接種量、裝液量、發(fā)酵時間、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、pH等11個液體發(fā)酵工藝參數(shù)進行優(yōu)化。每個試驗均設(shè)3個重復，取平均值。然后對植物病原菌進行抑制試驗。確定抑菌圈最大的單因素發(fā)酵培養(yǎng)條件。然后在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取N=11的P-B試驗進行設(shè)計，將影響微生物發(fā)酵11個因素作為P-B設(shè)計的主要成分。根據(jù)單因素對高水平（1）和低水平（-1）進行設(shè)定，一般高水平設(shè)定為低水平的1.25～1.50倍，抑菌圈直徑作為響應值y。P-B設(shè)計試驗因素與水平見表1。數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，分別對數(shù)據(jù)作單因子方差分析，以P<0.05表示差異性顯著。選出影響抑菌圈大小的3個顯著因子。endprint

2）Box-Behnken（B-B）試驗設(shè)計。在單因素試驗及P-B試驗的基礎(chǔ)上，選取對整個發(fā)酵模型影響最大的3個顯著因子進行響應面分析，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行B-B試驗設(shè)計，每個因素3個水平，中心點有5個重復。響應面分析試驗以顯著因素為自變量，以抑菌圈直徑為響應值，來確定各因素對植物病原菌影響。

1.2.4 ?模型的驗證試驗 ?為了進一步驗證預測值，利用優(yōu)化后確定的培養(yǎng)條件進行發(fā)酵試驗，每個試驗均設(shè)3個重復，取平均值。所得數(shù)值與預測值進行比較，來確定采用響應面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件是否準確可靠，是否具有實用價值。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?Placket-Burman試驗結(jié)果分析

按照Placket-Burman試驗的設(shè)計方法來考察各個因素對響應值抑菌圈直徑的影響。P-B試驗結(jié)果見表2。表中數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理（見表3），在這個模型中X7、X9、X10 3項的P值較其他項小，為模型的顯著項。篩選出影響發(fā)酵培養(yǎng)的3個顯著因子依次為裝液量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速。其P值均小于0.05。說明這個回歸模型是具有統(tǒng)計學意義的。由表3回歸模型方差分析表可知，回歸分析的決定系數(shù)R2=1.000，說明自變量和因變量形成的散點與回歸曲線高度接近，即散點基本都集中于回歸線上。說明這個回歸模型是具有統(tǒng)計學意義的。

2.2 ?顯著影響因子的Box-Behnken試驗結(jié)果分析

由表5可知，20組試驗中除3個顯著因素外，其他因素取值與初始培養(yǎng)條件中取值一致。按照試驗設(shè)計的培養(yǎng)條件進行發(fā)酵培養(yǎng)，并對植物病原菌進行抑菌活性測定。每組重復3次，結(jié)果取平均值，得到相應的抑菌圈直徑填入表中。利用Design-Expert8.0.6軟件對表5結(jié)果進行處理，確定回歸方程為Y=27.22-0.59A-1.27B-1.01C+0.38AB-0.37AC+0.38BC-1.98A2-1.98B2-2.51C2。該回歸方程的方差分析結(jié)果見表6。其中模型P<0.000 1，失擬P=0.104 1>0.05。說明該模型回歸顯著而失擬不顯著。另外，通過可信度分析可看知，精簡模型校正后的復相關(guān)系數(shù)的平方為0.945 5，說明精簡模型能解釋響應值變化的94.55%，進一步證明試驗方程式與實際數(shù)據(jù)之間具有非常好的擬合性。預測值和實際值之間具有高度的相關(guān)性。另外調(diào)整后的復相關(guān)系數(shù)為0.896 4，說明89.64%數(shù)據(jù)的可變性可用此模型來解釋，即響應值的變化有89.64%取決于裝液量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速3個顯著因子的取值，因此可以用該方法對其結(jié)果進行預測和分析，離散系數(shù)（Coeflcient of variation，CV）表示試驗精確度。其值越大，試驗的可靠性就越低。此模型中CV為4.88%，說明試驗操作可信，模型選擇正確。所以，可確定此回歸方程準確、可靠。同時得出當搖床轉(zhuǎn)速為119.33 r/min，裝液量為109.75 mL，溫度為26.78 ℃，理論抑菌圈最大直徑為27.58 mm。

響應曲面圖是回歸方程的圖形表述，通過響應面和等高線圖可以直觀、有效地找到最佳參數(shù)和各參數(shù)之間的相互作用及最大響應值。由以上回歸方程，通過Design-Expert軟件作出抑菌圈直徑對裝液量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速的響應曲面圖，最大響應值由等高線上最小橢圓所示（圖1～圖3）。通過計算回歸方程的值可知，響應面圖所示最大響應值和各因素參數(shù)值與計算的值一致。

2.3 ?模型的驗證

為了檢驗響應面分析法的可靠性，采用上述優(yōu)化參數(shù)進行發(fā)酵試驗，實際測得抑菌圈的直徑為27mm，與預測值的相對誤差為2.11%（表7）。采用響應面分析法優(yōu)化得到的培養(yǎng)條件工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

3 ?結(jié)論

P-B設(shè)計法是近年來國際上普遍采用的試驗 設(shè)計方法[7-9]，它能快速、有效地從眾多因子中篩選出影響抑菌活性最為重要的幾個因素供進一步研究。響應面法（RSM）是一種優(yōu)化過程的綜合技術(shù)，可同時對影響生物過程的因子水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價[10]。因此它可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[11，12]。與傳統(tǒng)優(yōu)化方法相比，RSM所需的試驗組數(shù)相對較少，優(yōu)化方法更為有效，因此基于這種統(tǒng)計方法的試驗設(shè)計廣泛地應用于生化微生物工程等方面[13-16]。本試驗利用Design-Expert 8.0.6軟件對CTF619-D菌株的發(fā)酵條件進行響應面優(yōu)化分析，數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，建立多項數(shù)學模型，并利用SAS對模型進行顯著性檢驗。優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件為： 淀粉17.5 g/L，硝酸鉀1.1 g/L，磷酸氫二鉀0.4 g/L，硫酸亞鐵0.001 g/L，種子菌齡72 h，接種量17 mL，發(fā)酵時間6.5 d，pH 7.5，搖床轉(zhuǎn)速為119.33 r/min，裝液量為109.75 mL，溫度為26.78 ℃。在此優(yōu)化條件下，抑菌圈直徑直徑為27.58 mm，較優(yōu)化前的抑菌圈直徑（16 mm）提高了72%，為菌株CTF619-D的發(fā)酵培養(yǎng)提供了理論試驗數(shù)據(jù)，為進一步研究CTF619-D菌株及工業(yè)化液體發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

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