代 波，趙瑩瑩，王 博，王 華，張 程，徐德祥，孟秀紅

◇預(yù)防醫(yī)學(xué)研究◇

青春期低劑量氰戊菊酯暴露對(duì)小鼠行為的影響

代 波1，趙瑩瑩1，王 博1，王 華2，張 程2，徐德祥2，孟秀紅1

目的 探究青春期低劑量氰戊菊酯暴露對(duì)小鼠行為的影響。方法 對(duì)出生后第28天的48只ICR小鼠雌雄各半分別進(jìn)行不同濃度氰戊菊酯（0、0.02、0.20、2.00 mg／kg）灌胃染毒。出生后第28～56天。在出生后第9周，雌雄小鼠分別進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。通過黑白巷實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的探索行為和焦慮相關(guān)行為，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)行為。結(jié)果 各組小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的行為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在黑白巷實(shí)驗(yàn)中，與0 mg／kg組雄性小鼠比較，0.02 mg／kg組和2.00 mg／kg組雄性小鼠跨過中線的潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＝0.006，P＝0.039）。在Morris水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)中，與0 mg／kg組雌鼠比較，0.02 mg／kg組和2.00 mg／kg組的雌鼠登陸平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＝0.011，P＝0.014）；與0 mg／kg組雌鼠比較，0.20 mg／kg組的雌鼠搜尋平臺(tái)的距離明顯增加（P＝0.003）；而雄性小鼠各組指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在Morris水迷宮的空間探索實(shí)驗(yàn)中，與0 mg／kg組比較，0.20 mg／kg組雌鼠的目標(biāo)象限時(shí)間比降低（P＝0.046）；而雄鼠各組指標(biāo)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 青春期低劑量的氰戊菊酯暴露能夠影響小鼠的多種行為，可能影響小鼠青春期的神經(jīng)行為發(fā)育。

青春期；低劑量；氰戊菊酯；行為；學(xué)習(xí)記憶

氰戊菊酯是一種II型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于蔬菜、果樹、棉花等農(nóng)作物的害蟲防治。兒童主要通過飲食、粉塵、住宅的地面等途徑接觸到低水平的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，研究對(duì)象中大多數(shù)兒童至少接觸了1種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥［1］。擬除蟲菊酯為脂溶性，可以通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，也可以在哺乳期通過乳汁被幼兒攝入，對(duì)子代造成影響。母親懷孕期間擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的暴露導(dǎo)致嬰兒的神經(jīng)智力發(fā)育水平降低［2］。尿中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的代謝產(chǎn)物濃度較高的兒童SDQ量表中總困難的得分越高［3］。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物能夠產(chǎn)生抗雌激素和抗雄激素作用，而且對(duì)甲狀腺激素受體產(chǎn)生拮抗作用［4］。青春期氰戊菊酯的暴露導(dǎo)致雄性小鼠大腦皮層中睪酮和雌二醇水平下降，而雌性小鼠中睪酮和雌二醇的水平略微上升［5］。Moniz et al［6］發(fā)現(xiàn)圍生期氰戊菊酯暴露使子代大鼠性成熟推遲、性行為減少、發(fā)情周期異常，這些結(jié)果表明氰戊菊酯具有抗雌激素的作用。該研究通過建立青春期低劑量氰戊菊酯暴露的小鼠動(dòng)物模型，觀察氰戊菊酯對(duì)小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、黑白巷實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中焦慮、學(xué)習(xí)記憶等行為的影響，探討氰戊菊酯對(duì)神經(jīng)行為發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出生后第21天清潔級(jí)ICR小鼠共48只，8～11 g，雌雄各半，購(gòu)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。雌鼠和雄鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12 h交替，溫度控制在20～25℃，濕度控制在50%～60%。小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，在出生后第28天將小鼠按性別分為雌雄2組，再將每個(gè)性別小鼠隨機(jī)分為4個(gè)不同濃度的暴露組（0、0.02、0.20、2.00 mg／kg），每組6只。每天同一時(shí)間對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃，灌胃的試劑體積為小鼠體重的1%。出生后第56天進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，行為實(shí)驗(yàn)的順序依次為曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、黑白巷實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮。

1.2 主要試劑與器材氰戊菊酯及其他生化試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；玉米油為福臨門玉米油；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備采用安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院ANY-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)，購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司；曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)及黑白巷行為實(shí)驗(yàn)的設(shè)備均為自制。

1.3 行為實(shí)驗(yàn)采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、黑白巷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的探索和焦慮相關(guān)行為，Morris水迷宮測(cè)試小鼠青春期的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間：出生后第57天，記錄小鼠在曠場(chǎng)中的跑動(dòng)格數(shù)，用于反應(yīng)小鼠的自發(fā)活動(dòng)能力，站立次數(shù)反應(yīng)小鼠的探究新異環(huán)境的能力，第1格潛伏期、周邊時(shí)間用于反應(yīng)焦慮行為。黑白巷實(shí)驗(yàn)時(shí)間：出生后第58天，記錄潛伏期、跨越次數(shù)和黑巷內(nèi)時(shí)間，反應(yīng)小鼠的焦慮行為。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)間：出生后第60天，記錄登臺(tái)潛伏期、游泳距離、目標(biāo)象限時(shí)間比、平臺(tái)區(qū)穿越次數(shù)。Morris實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分：前6 d的定位航行實(shí)驗(yàn)反應(yīng)小鼠的學(xué)習(xí)能力，第7天的空間探索實(shí)驗(yàn)反應(yīng)小鼠的記憶能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 10.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，測(cè)定值用±s表示。Morris水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，其他行為數(shù)據(jù)采用單因素的方差分析。處理組之間的兩兩比較采用事后檢驗(yàn)中的最小顯著差法。

2 結(jié)果

2.1 體重本研究中小鼠出生后第28～56天每日經(jīng)口給予不同濃度氰戊菊酯（0、0.02、0.20、2.00 mg／kg）暴露，各組小鼠體重在各觀察時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)青春期低劑量氰戊菊酯的暴露對(duì)雄性和雌性小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中站立次數(shù)、潛伏期、周邊區(qū)域活動(dòng)時(shí)間、跨越的方格數(shù)等指標(biāo)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 青春期氰戊菊酯暴露對(duì)小鼠曠場(chǎng)行為的影響（n＝6，±s）

表1 青春期氰戊菊酯暴露對(duì)小鼠曠場(chǎng)行為的影響（n＝6，±s）

2.3 黑白巷實(shí)驗(yàn)不同組間雄鼠的潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝4.764，P＝0.015），其中與0 mg／kg組比較，0.02 mg／kg組雄鼠的潛伏期明顯升高（P＝0.006）；不同組間雌鼠的潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝3.824，P＝0.031），其中與0 mg／kg組比較，2.00 mg／kg組雌鼠的潛伏期明顯升高（P＝0.039）。不同組間雄鼠和雌鼠的白巷時(shí)間、跨越中線次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.4.1定位航行試驗(yàn) 持續(xù)6 d的定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠的登臺(tái)潛伏期隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加逐漸降低。見圖1。雌鼠各組游泳距離差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝4.638，P＝0.016）。與0 mg／kg組比較，0.20 mg／kg組游泳距離顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.003）。雌鼠各組登臺(tái)潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝3.627，P＝0.036）。與0 mg／kg組比較，0.20 mg／kg組和2.00 mg／kg組潛伏期顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.011，P＝0.014）。不同組雌鼠的目標(biāo)象限時(shí)間比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雄鼠各組游泳距離、登臺(tái)潛伏期、目標(biāo)象限時(shí)間比等指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表2 青春期氰戊菊酯暴露對(duì)小鼠黑白巷行為的影響（n＝6，±s）

表2 青春期氰戊菊酯暴露對(duì)小鼠黑白巷行為的影響（n＝6，±s）

與同一性別小鼠0 mg／kg組比較：*P＜0.05

表3 青春期氰戊菊酯暴露對(duì)小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)空間學(xué)習(xí)能力的影響（n＝6，±s）

表3 青春期氰戊菊酯暴露對(duì)小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)空間學(xué)習(xí)能力的影響（n＝6，±s）

與0 mg／kg組雌鼠比較：*P＜0.05

2.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn)雌鼠各組目標(biāo)象限區(qū)域活動(dòng)時(shí)間占總時(shí)間的比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝5.023，P＝0.012），與0 mg／kg組比較，0.20 mg／kg組目標(biāo)象限時(shí)間比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.046）；而各組雌鼠穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雄鼠各組的目標(biāo)象限時(shí)間比、穿越次數(shù)等指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 青春期暴露氰戊菊酯對(duì)小鼠Morris水迷宮空間記憶能力的影響（n＝6，±s）

表4 青春期暴露氰戊菊酯對(duì)小鼠Morris水迷宮空間記憶能力的影響（n＝6，±s）

與0 mg／kg組雌鼠比較：*P＜0.05

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)青春期小鼠采用低劑量氰戊菊酯經(jīng)口灌胃染毒，觀察低劑量暴露氰戊菊酯對(duì)小鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響，0.02 mg／kg相當(dāng)于國(guó)際食品法典委員會(huì)規(guī)定的氰戊菊酯每日允許攝入量，2.00 mg／kg相當(dāng)于1／100 LD50，低于此前研究［5，7］設(shè)計(jì)的劑量組30 mg／kg（1／8 LD50）和7.5 mg／kg（1／32 LD50）。

在Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，各實(shí)驗(yàn)組的仔鼠登臺(tái)潛伏期隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加逐漸縮短，說明各組小鼠通過訓(xùn)練均能找到平臺(tái)，而且雌性小鼠0.20 mg／kg組和2.00 mg／kg組的潛伏期與0 mg／kg組比較潛伏期明顯延長(zhǎng)。各組小鼠的游泳路程也隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加而減少，0.20 mg／kg組雌鼠的游泳路程與0 mg／kg組游泳路程相比有明顯增加的趨勢(shì)，青春期氰戊菊酯暴露對(duì)雌性小鼠的空間學(xué)習(xí)能力有影響。研究［7］表明，青春期氰戊菊酯暴露對(duì)雌雄小鼠的影響存在性別差異，雌鼠相比雄鼠在空間學(xué)習(xí)和記憶方面受到的損傷要更加嚴(yán)重，青春期的暴露還抑制了雄鼠的攻擊行為，增加了雌鼠的焦慮行為。Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中，雌鼠各組的目標(biāo)象限時(shí)間比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，0.20 mg／kg組的雌鼠與0 mg／kg組比較目標(biāo)象限時(shí)間比明顯減少，說明0.20 mg／kg組雌鼠在目標(biāo)象限中的時(shí)間相對(duì)較少。研究［8］表明，仔鼠的軀體感覺運(yùn)動(dòng)功能發(fā)育受到了氰戊菊酯暴露的影響，而到了青春期，小鼠的感覺運(yùn)動(dòng)功能又得以恢復(fù)；小鼠成年后的空間記憶能力也受到了影響。有研究［9］顯示，青春期暴露氰戊菊酯的小鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，青春期氰戊菊酯暴露對(duì)于雌雄小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的穿越格數(shù)、周邊時(shí)間、潛伏期等指標(biāo)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在黑白巷實(shí)驗(yàn)中，雌雄小鼠的白巷時(shí)間、跨越次數(shù)等指標(biāo)各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而氰戊菊酯暴露組的雌雄小鼠與0.20 mg／kg組比較潛伏期增加了。有研究［10］表明，哺乳期氰戊菊酯暴露導(dǎo)致了子代雌性大鼠在青春期探索和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力降低、焦慮行為增加，對(duì)挖掘、囤積食物、筑巢等生活習(xí)性沒有影響。

許多內(nèi)分泌干擾物的暴露都能影響神經(jīng)行為發(fā)育。除了本研究中的氰戊菊酯，BPA、鄰苯二甲酸酯、溴氰菊酯等農(nóng)藥均可能影響到小鼠的焦慮抑郁等行為及學(xué)習(xí)記憶能力［11－14］。氰戊菊酯暴露對(duì)神經(jīng)行為的影響可能是通過干擾發(fā)育大腦中雌激素及其受體的正常功能和抑制神經(jīng)元突起等途徑實(shí)現(xiàn)的［5，15］。

綜上所述，青春期低劑量氰戊菊酯暴露對(duì)小鼠青春期神經(jīng)行為發(fā)育存在影響。

［1］ Morgan M K.Children′s exposures to pyrethroid insecticides athome：a review of data collected in published exposure measurement studies conducted in the United States［J］.Int J Environ Res Public Health，2012，9（8）：2964－85.

［2］ 齊小娟，鄭明嵐，鄔春華，等.宮內(nèi)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥暴露對(duì)1歲幼兒神經(jīng)發(fā)育的影響［J］.衛(wèi)生研究，2011，40（6）：693－7.

［3］ Oulhote Y，Bouchard M F.Urinary metabolites of organophosphate and pyrethroid pesticides and behavioral problems in Canadian children［J］.Environ Health Perspect，2013，121（11－12）：1378－84.

［4］ Du G，Shen O，Sun H，et al.Assessing hormone receptor activities of pyrethroid insecticides and their metabolites in reporter gene assays［J］.Toxicol Sci，2010，116（1）：58－66.

［5］ Liu P，Meng X H，Wang H，et al.Effects of pubertal fenvalerate exposure on testosterone and estradiol synthesis and the expression of androgen and estrogen receptors in the developing brain［J］.Toxicol Lett，2011，201（2）：181－9.

［6］ Moniz A C，Cruz-Casallas P E，Salzgeber S A，et al.Behavioral and endocrine changes induced by perinatal fenvalerate exposure in female rats［J］.Neurotoxicol Teratol，2005，27（4）：609－14.

［7］ Meng X H，Liu P，Wang H，et al.Gender-specific impairments on cognitive and behavioral development in mice exposed to fenvalerate during puberty［J］.Toxicol Lett，2011，203（3）：245－51.

［8］ 張玉媛，王取南，王志剛，等.出生后接觸氰戊菊酯對(duì)仔鼠神經(jīng)行為發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶的影響［J］.毒理學(xué)雜志，2008，22（2）：88－91.

［9］ 岳 穎，蔡 蕤，喬 輝，等.氰戊菊酯染毒對(duì)小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的影響［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2011，27（S1）：1200－2.

［10］章 恒，項(xiàng)靜英，寧 萑，等.母體哺乳期氰戊菊酯染毒對(duì)子代青春期雌鼠行為發(fā)育的影響［J］.中華勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病雜志，2012，30（4）：289－92.

［11］Tian Y H，Baek J H，Lee S Y，et al.Prenatal and postnatal exposure to bisphenol a induces anxiolytic behaviors and cognitive deficits in mice［J］.Synapse，2010，64（6）：432－9.

［12］Xu X，Hong X，Xie L，et al.Gestational and lactational exposure to bisphenol-A affects anxiety-and depression-like behaviors in mice［J］.Horm Behav，2012，62（4）：480－90.

［13］Boberg J，Christiansen S，Axelstad M，et al.Reproductive and behavioral effects of diisononyl phthalate（DINP）in perinatally exposed rats［J］.Reprod Toxicol，2011，31（2）：200－9.

［14］Chen N N，Luo D J，Yao X Q，et al.Pesticides induce spatial memory deficits with synaptic impairments and an imbalanced tau phosphorylation in rats［J］.J Alzheimers Dis，2012，30（3）：585－94.

［15］楊葉新，王取南，夏玉寶，等.體外氰戊菊酯暴露抑制小鼠海馬神經(jīng)元突起形成［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（3）：289－93.

Effects of pubertal exposure to low dose fenvalerate on behaviors in mice

Dai Bo，Zhao Yingying，Wang Bo，et al
（Dept of Maternal，Child Adolescent Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the effects of low dose of fenvalerate exposure during puberty on behaviors in mice.MethodsTwenty four male and twenty four female ICR mice in postnatal day 28 were randomly divided into four groups respectively：the control group（0 mg／kg）and fenvalerate group，0.02，0.20，2.00 mg／kg.Mice were treated with corn oil as a vehicle control or fenvalerate by gavage daily from postnatal day 28 to 56.At the age of 9 weeks，open field，black and white alley，Morris water maze were used to test anxiety，exploratory behavior，spatial learning and memory in mice.ResultsExposure to fenvalerate did not alter mice behaviors in open field test.In black and white alley test，pubertal exposure to fenvalerate（0.02 mg／kg）significantly increased latency in male mice（P＝0.006）；exposure to fenvalerate（2.00 mg／kg）significantly increased latency in female mice（P＝0.039）.TheResultsof spatial learning test in Morris water maze showed that pubertal exposure to fenvalerate（0.20 mg／kg and 2.00 mg／kg）significantly increased the escape latency of female mice（P＝0.011，P＝0.014）；exposure to fenvalerate（0.20 mg／kg）significantly extended the escape distance in the female（P＝0.003）.Spatial memory testResultsshowed that the time proportion of objective quadrant was significantly decreased in female mice treated with 0.20 mg／kg（P＝0.046）.Exposure to fenvalerate did not alter behaviors of male mice in Morris water maze test.ConclusionPubertal exposure to low dose fenvalerate disrupts multiple behaviors and may affect neurobehavioral development in mice.

puberty；low dose；fenvalerate；behaviors；learning and memory

R 977.12；R 179；R 322.811

1000－1492（2015）02－0177－04

2014－10－23接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：KJ2010A173）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81102155）；安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研課題資助（編號(hào)：XJ201115）

安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院1兒少與衛(wèi)生保健學(xué)系、2衛(wèi)生毒理學(xué)系，合肥 230032

代 波，男，碩士研究生；孟秀紅，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：mengxh＿ahmu＠163.com