王 雪，田 佳，徐琳琳，盧寶慧，楊麗娜，高 潔

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春130118)

表達(dá)hrpZPsg12基因的重組枯草芽孢桿菌工程菌株構(gòu)建及其生防活性評(píng)價(jià)

王 雪，田 佳，徐琳琳，盧寶慧，楊麗娜，高 潔

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春130118)

【目的】 提高生防枯草芽孢桿菌JN209的穩(wěn)定性及生防活性?！痉椒ā?利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建含hrpZPsg12基因的分泌表達(dá)載體，采用電轉(zhuǎn)化方法將從大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)中克隆到的hrpZPsg12基因轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌JN209中，同時(shí)采用抑菌圈法測(cè)定宿主菌與基因工程菌抑菌活性的變化，評(píng)價(jià)其作為生物農(nóng)藥在田間對(duì)煙草病毒病的生防效果。【結(jié)果】 成功構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12。抑菌活性分析表明，基因工程菌株在保持原始宿主菌株抑菌活性的同時(shí)，對(duì)部分靶標(biāo)菌的抑菌效果有明顯提高。煙草病毒病田間小區(qū)防治試驗(yàn)表明：與原始宿主菌JN209相比，新構(gòu)建的基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12對(duì)煙草病毒病的防效有明顯提高?！窘Y(jié)論】 改良的基因工程菌在抑菌譜和抑菌活性方面均有明顯提高，同時(shí)對(duì)煙草病毒病也有較好的防治效果，可進(jìn)一步開發(fā)為新型生物農(nóng)藥。

hrpZPsg12；枯草芽孢桿菌；基因工程菌；抑菌效果；生物農(nóng)藥

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，簡稱Bs)是自然界中廣泛存在的具有內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，其生理特性豐富多樣，極易分離培養(yǎng)，對(duì)人畜無毒無害，能產(chǎn)生40多種具有不同結(jié)構(gòu)的抗菌素，具有顯著的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，已作為益生菌和生物防治制劑廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、畜牧、水產(chǎn)及農(nóng)作物種植等領(lǐng)域，是目前微生物殺菌劑中應(yīng)用最為成功的細(xì)菌之一[1-3]。Harpin蛋白是由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的一類能激發(fā)植物過敏反應(yīng)的蛋白，由hrp基因編碼，其可誘導(dǎo)植物體內(nèi)一系列基因的表達(dá)，激活植物自身的生長系統(tǒng)和防衛(wèi)系統(tǒng)，從而使植物能抵御多種病蟲害的侵染和逆境脅迫，并獲得促進(jìn)生長發(fā)育和提高產(chǎn)量的效果[4-5]。然而由于天然型微生物菌劑存在持效期短、作用對(duì)象單一、易受環(huán)境影響、競(jìng)爭(zhēng)存活力有限等缺陷，采用基因工程技術(shù)對(duì)生防菌株進(jìn)行遺傳改良，進(jìn)一步提高生防菌株的生防效果、拮抗性能，擴(kuò)大其防治對(duì)象，已成為目前生物防治研究的熱點(diǎn)[6-7]。隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，越來越多的枯草芽孢桿菌被用作基因工程的表達(dá)宿主菌，并已表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。田大偉等[8]發(fā)現(xiàn),以生防促生芽孢桿菌為宿主菌，可外泌表達(dá)Harpin蛋白激發(fā)子的基因工程菌，對(duì)水稻白葉枯病的防治效果較出發(fā)菌株顯著提高，同時(shí)還可促進(jìn)植物生長。魏利輝等[9]研究發(fā)現(xiàn)，將表達(dá)載體pHTPOW轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌168得到的工程菌株具有促進(jìn)番茄生長和抑制根結(jié)線蟲的作用。菌株JN209是吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室分離得到的1個(gè)對(duì)多種植物病原菌有防治效果的枯草芽孢桿菌菌株，為了更好地開發(fā)利用該菌株，提高其生防效果，本研究將從大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)中克隆到的hrpZPsg12基因轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌JN209中，構(gòu)建新型基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12，并通過抑菌圈法測(cè)定其對(duì)部分植物病原細(xì)菌的抑菌作用，明確其對(duì)煙草病毒病的生防效果，為進(jìn)一步開發(fā)研制新型、高效的生物農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ)，并提供新的研究視角。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株和載體 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JN209菌株，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

分泌表達(dá)載體pWB980，由天津工業(yè)生物技術(shù)研究所饋贈(zèng)。

1.1.2 供試植物病原細(xì)菌 煙草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)、大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)、芥菜細(xì)菌性葉斑病菌(Xanthomonascampestrispv.armoraciae)、萬壽菊細(xì)菌性葉斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tagetis)、防風(fēng)葉腐病菌(Pseudomonasviridiflavapv.pastinacae)、黃瓜細(xì)菌性角斑病菌(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)、西瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxcirrulli)，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.3 供試藥劑和煙草品種 供試藥劑10%寧南霉素SPX，德強(qiáng)生物股份有限公司產(chǎn)品；感病毒病煙草品種“青農(nóng)1號(hào)”，農(nóng)家品種。

1.1.4 供試酶和試劑 ExTaqDNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶、核酸限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和PstⅠ,均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠純化試劑盒,購自上海生物工程技術(shù)公司；其余均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.1.5 供試培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、豐富表達(dá)培養(yǎng)基、枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。

1.2 方 法

1.2.1hrpZPsg12基因的克隆 以含有pGEX-4T-hrpZPsg12的基因?yàn)槟０錚CR擴(kuò)增hrpZPsg12基因。hrpZPsg12的擴(kuò)增引物為：上游引物P1，5′-CTAGTCTAGAATGCAGAGTCTCAGTCTTA-ACA-3′ ；下游引物P2，5′-AAAACTGCAGTCAGGCAGCAGCC-3′。上、下游引物分別加XbaⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)(底部劃線處為酶切位點(diǎn))。

1.2.2 pWB980-hrpZPsg12分泌表達(dá)載體的構(gòu)建hrpZPsg12基因PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后用XbaⅠ和PstⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶將hrpZPsg12基因連接到經(jīng)相同雙酶切的分泌表達(dá)載體pWB980中，獲得重組表達(dá)載體pWB980-hrpZPsg12。轉(zhuǎn)化pWB980-hrpZPsg12到大腸桿菌DH5α細(xì)胞，在含有50 μg/mL卡那霉素LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子并加以驗(yàn)證。

1.2.3 高效表達(dá)重組枯草芽孢桿菌hrpZPsg12基因工程菌的構(gòu)建及陽性克隆篩選 以生防枯草芽孢桿菌JN209作為宿主，通過電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的表達(dá)載體pWB980-hrpZPsg12轉(zhuǎn)入宿主菌JN209中，在含卡那霉素的選擇壓力下篩選陽性重組子。

1.2.4 宿主菌JN209與基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12發(fā)酵產(chǎn)物抑菌譜的比較 將JN209及其基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12分別接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，28 ℃、 200 r/min過夜培養(yǎng)至OD600為0.8，將發(fā)酵液用于抑菌譜測(cè)定，采用抑菌圈法[10-11]測(cè)定其對(duì)病原細(xì)菌的抑菌效果。將LB固體培養(yǎng)基融化，接近室溫時(shí)，將2 mL靶標(biāo)細(xì)菌發(fā)酵液與100 mL LB培養(yǎng)基混合后倒平板，在無菌操作臺(tái)中待平板自然凝固后，打取直徑為9.0 mm的圓孔，用消毒后的鑷子將圓形培養(yǎng)基取出，然后取10 μL宿主菌JN209發(fā)酵液和JN209/pWB980-hrpZPsg12發(fā)酵液緩慢注入圓孔中，放入25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后量取抑菌圈直徑，每個(gè)處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 宿主菌JN209與基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12對(duì)煙草病毒病的生防效果評(píng)價(jià) (1)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，測(cè)定新構(gòu)建的基因工程菌對(duì)煙草生產(chǎn)上的主要病害煙草病毒病的生防效果。試驗(yàn)在吉林省農(nóng)安縣進(jìn)行，選取自然發(fā)生煙草病毒病的煙草種植區(qū)，將JN209及其基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12分別接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)至OD600為0.8，發(fā)酵液用于田間生防效果測(cè)定。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：①宿主菌JN209發(fā)酵液處理；②基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12發(fā)酵液處理；③寧南霉素900 g/hm2處理；④清水對(duì)照。每小區(qū)面積20 m2，均設(shè)3次重復(fù)。試驗(yàn)用量為每小區(qū)均勻噴施600 mL生防菌發(fā)酵液和等量對(duì)照藥劑，每隔5 d噴藥1次，共噴藥3次。

(2)試驗(yàn)調(diào)查。以株為單位調(diào)查各小區(qū)的全部煙株，每次施藥5 d后進(jìn)行調(diào)查，共調(diào)查3次。按病毒病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查各處理煙株病毒病的發(fā)病率、病情指數(shù)，觀察有無藥害，計(jì)算防效[12-13]。

煙草病毒病調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[14]：0級(jí)，全株無??；1級(jí)，心葉脈明或輕微花葉，病株無明顯矮化；3級(jí)，1/3葉片花葉但不變形，或病株矮化為正常株高的3/4以上；5級(jí)，1/3～1/2葉片花葉，或少數(shù)葉片變形，或主脈變黑，或病株矮化為正常株高的2/3～3/4；7級(jí)，1/2～2/3葉片花葉，或變形或主側(cè)脈壞死，或病株矮化為正常株高的1/2～2/3；9級(jí)，全株葉片花葉，嚴(yán)重變形或壞死，或病株矮化為正常株高的1/2以上。

發(fā)病率=(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%；

病情指數(shù)=∑(各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值)×100；

防治效果=(對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù))/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100%。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 7.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 hrpZPsg12基因的克隆

以pGEX-4T-hrpZPsg12質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到大小為 1 026 bp的基因片段(圖1)，測(cè)序結(jié)果與目的基因hrpZPsg12序列完全匹配。

圖1 hrpZPsg12基因的PCR檢測(cè)M.DL 2000 DNA Marker；1.hrpZPsg12基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR detection of hrpZPsg12 gene M.DL 2000 DNA Marker；1.PCR products of hrpZPsg12

圖2 重組質(zhì)粒pWB980-hrpZPsg12的酶切鑒定M．DL 2000 DNA Marker；1.XbaⅠ/PstⅠ雙酶切Fig.2 Restriction analysis of recombinant pWB980-hrpZPsg12 plasmid M．DL 2000 DNA Marker；1.Digested by XbaⅠand PstⅠ

2.2 pWB980-hrpZPsg12分泌表達(dá)載體的構(gòu)建

分別提取質(zhì)粒pMD18-hrpZPsg12以及pWB980，對(duì)提取后的質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ/PstⅠ雙酶切。切膠回收小片段后進(jìn)行片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。在卡那霉素(50 μg/mL)平板上篩選轉(zhuǎn)化子，對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)后提取轉(zhuǎn)化后的陽性重組子的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，圖2結(jié)果表明，pWB980-hrpZPsg12重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 高效表達(dá)重組枯草芽孢桿菌hrpZPsg12基因工程菌的構(gòu)建及陽性克隆篩選

將構(gòu)建好的表達(dá)載體pWB980-hrpZPsg12，通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入宿主枯草芽孢桿菌JN209中，在含卡那霉素的選擇壓力下初篩出陽性重組子。提取質(zhì)粒后以引物P1、P2對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果(圖3)表明：表達(dá)載體pWB980-hrpZPsg12向枯草芽孢桿菌JN209轉(zhuǎn)化成功，將新構(gòu)建的基因工程菌命名為JN209/pWB980-hrpZPsg12。

2.4 宿主菌JN209與基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌譜

從表1可知，原始宿主菌JN209對(duì)供試7種植物病原細(xì)菌的抑制作用表現(xiàn)不同，僅對(duì)煙草野火病菌和芥菜細(xì)菌性葉斑病菌有一定的抑制效果，而新構(gòu)建的基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12對(duì)供試的多種靶標(biāo)植物病原細(xì)菌的抑菌效果均較宿主菌

有不同程度的增強(qiáng)，抑菌譜擴(kuò)展，尤其提高了對(duì)萬壽菊細(xì)菌性葉斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tagetis)、煙草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)、黃瓜細(xì)菌性角斑病菌(Pseudomonassyrin-gaepv.lachrymans)的抑菌效果，對(duì)萬壽菊細(xì)菌性葉斑病菌的抑制效果最佳，抑菌圈直徑為24.83 mm，顯著高于其他病原細(xì)菌，對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌的抑制效果無明顯提高。

圖3 JN209/pWB980-hrpZPsg12的PCR檢測(cè) M.DL 2000 DNA Marker；1～3.引物P1/P2擴(kuò)增結(jié)果
Fig.3 PCR detection of JN209/pWB980-hrpZPsg12plasmid M.DL 2000 DNA Marker；1-3.Amplification of primer P1/P2

表1 宿主菌JN209 及基因工程菌 JN209/pWB980-hrpZPsg12對(duì)7種植物病原細(xì)菌的抑菌效果Table 1 Comparison of inhibition effects of strains JN209 and JN209/pWB980-hrpZPsg12against 7 plant pathogenic bacteria

注：*同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P=0.05水平差異顯著。表2同。

Note：Different lowercase letters indicate significant difference atP=0.05 level.The same for table 2.

2.5 宿主菌JN209與基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12對(duì)煙草病毒病生防效果的評(píng)價(jià)

煙草病毒病是目前煙草生產(chǎn)上的主要病害，分別用原始宿主菌JN209的發(fā)酵液和新構(gòu)建的基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12的發(fā)酵液以及防治病毒病的藥劑寧南霉素處理田間自然發(fā)病的煙草植株，連續(xù)用藥3次，每次用藥后5 d調(diào)查病害的發(fā)展情況，調(diào)查結(jié)果見表2。由表2可以看出，經(jīng)基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12發(fā)酵液處理后的煙草植株病毒病得到了明顯的控制，病害擴(kuò)展不明顯，3次施藥后平均防效分別達(dá)到了71.46%，84.91%和59.60%，均較原始宿主菌防效有所提高，尤其是發(fā)病初期施藥防治效果更為明顯，與10%寧南霉素SPX藥劑對(duì)照組差異顯著，可考慮進(jìn)一步開發(fā)為新型的生物農(nóng)藥。

表2 不同處理對(duì)煙草病毒病的防治效果Table 2 Biocontrol effects of different treatments on tobacco virus diseases

3 結(jié)論與討論

本研究通過基因工程手段構(gòu)建了含hrpZPsg12基因的分泌表達(dá)載體pWB980-hrpZPsg12，采用電轉(zhuǎn)化方法，將從大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)中克隆到的hrpZPsg12基因轉(zhuǎn)化至具有生防活性的枯草芽孢桿菌JN209中，成功構(gòu)建了具有雙重活性的重組枯草芽孢桿菌基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12。在成功構(gòu)建工程菌的基礎(chǔ)上，比較了原始宿主菌株與基因工程菌株在抑菌效果方面的差異，結(jié)果表明：與原始宿主菌相比,基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12對(duì)除西瓜細(xì)菌性果斑病菌外的其余6種供試植物病原細(xì)菌的抑菌效果有明顯增強(qiáng)，尤其提高了對(duì)萬壽菊細(xì)菌性葉斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tagetis)、煙草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)、黃瓜細(xì)菌性角斑病菌(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)的抑菌效果，抑菌圈直徑均大于20 mm。

目前，在烤煙生產(chǎn)上病毒病以復(fù)合性侵染危害為主，給煙葉生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失，化學(xué)藥劑防治煙草病毒病尚有一定局限性，因此提高煙草植株自身的抗病毒能力，是防治病毒病最科學(xué)、有效的途徑。而蛋白農(nóng)藥作為一種新型生物農(nóng)藥，能有效激發(fā)植物自身的抗病防蟲基因表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)植物生長發(fā)育[15-16]。在本研究中，利用新構(gòu)建的基因工程菌的發(fā)酵液處理感染煙草病毒病的煙草植株，以期誘導(dǎo)其抗病基因的表達(dá)，增強(qiáng)植株抗病能力。結(jié)果表明，與原始宿主菌JN209相比，新構(gòu)建的基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12對(duì)煙草病毒病的防效有明顯提高，與對(duì)照藥劑處理間差異顯著。另外，從施藥時(shí)間來看，新構(gòu)建工程菌的發(fā)酵液于發(fā)病初期處理的防治效果更為明顯，這可能與Harpin蛋白所表達(dá)的誘導(dǎo)抗性有關(guān)，此類蛋白在生物防治中所起到的作用可能主要體現(xiàn)在預(yù)防保護(hù)方面，其作用機(jī)理尚有待進(jìn)一步深入研究。

本研究采用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)生防菌進(jìn)行遺傳改良，將表達(dá)Harpin蛋白的hrpZ基因成功導(dǎo)入生防枯草芽孢桿菌中，使新構(gòu)建的枯草芽孢桿菌基因工程菌在保持原始菌株生物學(xué)特性的同時(shí)，抑菌譜和抑菌能力均較原始菌株有所增強(qiáng)，體現(xiàn)了生物技術(shù)在生防細(xì)菌遺傳改良中的應(yīng)用潛力，為進(jìn)一步研究和開發(fā)新型微生物農(nóng)藥創(chuàng)造了條件。

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Construction and biocontrol activity of genetic engineeringBacillussubtilisstrain withhrpZPsg12gene

WANG Xue,TIAN Jia,XU Lin-lin,LU Bao-hui,YANG Li-na,GAO Jie

(CollegeofAgronomy,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 The objective of this study was to improve the stabilities and biocontrol activities ofBacillussubtilisstrains JN209.【Method】Bacillussubtilissecretory expression vector was constructed by engineering approach,andhrpZPsg12fromPseudomonassyringaepv.glycineawas transferred intoBacillussubtilisstrain JN209 by electroporation engineering approach.The inhibition activity of JN209 and genetic engineering bacterium JN209/pWB980-hrpZPsg12against seven plant pathogenic bacteria was determined by inhibition zone method,and the biocontrol effects on tobacco virus diseases was appraised.【Result】 Genetic engineering bacterium JN209/pWB980-hrpZPsg12was successfully constructed.The antibacterial activities against plant pathogenic bacteria were significantly improved in genetic engineering strains.The field trial of controlling tobacco virus disease showed that genetic engineering strains JN209/pWB980-hrpZPsg12had better control efficiency than the host strain.【Conclusion】 Both inhibition spectrum and antibacterial activity were improved significantly in genetic engineering bacteria.This study provides reference for the further development of new biological pesticides.

hrpZPsg12;Bacillussubtilis;genetic engineering strain;inhibitory effect;biological pesticide

時(shí)間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.021

2014-03-26

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20090211)；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(201106)

王 雪(1981-),女,遼寧沈陽人，講師,博士,主要從事植物病害生物防治研究。E-mail:wangxue813@126.com

高 潔(1964-),女,吉林梨樹人，教授,博士,博士生導(dǎo)師,主要從事植物細(xì)菌病害及植物病害生物防治研究。 E-mail:jiegao115@126.com

Q78;S482.2+92

A

1671-9387(2015)11-0139-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.042.html