劉 美，王劉慶，廖美德，陸 亮

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

球形芽孢桿菌BS-10高產(chǎn)培養(yǎng)基的優(yōu)化

劉 美，王劉慶，廖美德，陸 亮

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

【目的】 對殺蚊球形芽孢桿菌BS-10高產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，為該菌株的規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)?！痉椒ā?以菌株BS-10菌體生物量、干質(zhì)量和芽孢數(shù)為考察指標(biāo)，對培養(yǎng)基中添加的碳、氮組成成分進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，并對優(yōu)化所得培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)和生物活性測定?！窘Y(jié)果】 菌株BS-10高產(chǎn)毒力最優(yōu)培養(yǎng)基(NBFB)配方為胰蛋白胨3 g/L，牛肉膏1 g/L，魚粉6 g/L，麩皮4 g/L；采用NBFB培養(yǎng)基，可將BS-10培養(yǎng)周期縮短至18 h，芽孢數(shù)達(dá)4.12×109CFU/mg，對致倦庫蚊幼蟲的毒力較基礎(chǔ)培養(yǎng)基增大了100倍。【結(jié)論】 菌株BS-10在NBFB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)中，不僅獲得了高產(chǎn)量，而且縮短了發(fā)酵周期，具有較好的應(yīng)用潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

球形芽孢桿菌；菌株BS-10；致倦庫蚊；魚粉；麩皮

LIU Mei,WANG Liu-qing,LIAO Mei-de,LU Liang

蚊蟲是眾所熟知的一種衛(wèi)生害蟲和傳媒昆蟲，能傳播多種疾病，如瘧疾、絲蟲病、流行性乙型腦炎、登革熱和黃熱病等，給人類的健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的威脅。球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus，簡稱BS)作為蚊蟲幼蟲生物防治的有益細(xì)菌之一，不僅能夠產(chǎn)生多種具有高選擇性的殺蚊毒素(Bin，Mtx)[1-5]，而且能夠侵染蚊蟲幼蟲蟲體并在其體內(nèi)存活，延長持效期[6]，這些優(yōu)點(diǎn)使得其逐漸成為蚊蟲幼蟲防治化學(xué)農(nóng)藥的替代物。球形芽孢桿菌BS-10是江蘇省里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)研究所選育的殺蚊幼高毒力菌株，其血清型與世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的1593、2362菌株一樣，同屬H5a5b型，但其發(fā)酵液毒力比1593菌株高1.78～3.2倍，比2362菌株高 1.79 倍[7-8]。然而，實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)BS-10的毒力效價(jià)并不高，需要高劑量才能達(dá)到防治效果[9]。究其原因主要是由于其在多種培養(yǎng)基中的芽孢率不高，這限制了其高毒力制劑的發(fā)展。為了提高BS-10的芽孢率，本研究篩選出魚粉和麩皮2種物質(zhì)作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分，通過正交試驗(yàn)確定了各組分的最佳配比，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室級發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，以期為BS-10菌株的規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試生物 球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)BS-10菌株由肇慶真格生物科技公司提供，并由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)3齡末或4齡初幼蟲由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基材料 魚粉、大豆粉、玉米粉、麩皮等副產(chǎn)品，均購于廣州市花鳥蟲魚市場。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基)：胰蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、去離子水1 000 mL(pH 7.0)；NYSM培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、酵母粉0.5 g、MgCl2·6H2O 0.203 g、CaCl2·2H2O 0.103 g、MnCl2·4H2O 0.01 g、去離子水1 000 mL(pH 7.0)。

1.2 菌株BS-10種子液與發(fā)酵液的制備

刮取活化后的菌株BS-10菌苔 1～2環(huán)接種在裝有20 mL種子培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，于30 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)10 h得到種子液。將種子液以2%接種量(體積分?jǐn)?shù))接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵液。

1.3 菌體生物量及芽孢數(shù)的測定

取適量發(fā)酵液，用分光光度計(jì)在600 nm處測定其吸光度(OD600)，以去離子水為對照，吸光度值OD600為標(biāo)準(zhǔn)判斷菌體生物量(精確到0.1)。取100 mL發(fā)酵液，12 000×g下離心，去掉上清液，冷凍干燥，分析天平稱菌體干質(zhì)量(含有魚粉和麩皮的發(fā)酵液離心之前用孔徑25 μm篩子去掉殘留物)，進(jìn)一步對比相同組分不同配比發(fā)酵液的菌體生物量(精確到 0.01)。芽孢數(shù)測定：準(zhǔn)確稱取0.1 g凍干菌粉溶于100 mL含有少量玻璃珠的無菌水中，振蕩20 min，進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的菌液放入80 ℃水浴中加熱12 min，冷卻后，采用平板傾注計(jì)數(shù)法測算芽孢數(shù)(CFU/mg)。

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 碳源對菌株BS-10菌體生物量和芽孢數(shù)的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加5 g/L的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、麥芽糖、乙酸鈉(CH3COONa)、麩皮，按1.2節(jié)的方法培養(yǎng)24 h，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，測定OD600和芽孢數(shù)。

1.4.2 氮源對菌株BS-10菌體生物量和芽孢數(shù)的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加3 g/L的魚粉、大豆粉、花生餅粉、玉米粉、酵母粉、尿素、NH4NO3，按1.2節(jié)的方法培養(yǎng)24 h，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，測定OD600和芽孢數(shù)。

1.4.3 麩皮、魚粉添加量對菌株BS-10菌體生物量和芽孢數(shù)的影響 將篩選出的最佳碳源(麩皮)、氮源(魚粉)以不同添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，1.1%，1.3%，1.5%)添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按1.2節(jié)的方法培養(yǎng)24 h，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，測定OD600和芽孢數(shù)。

1.4.4 培養(yǎng)基組分配比優(yōu)化與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的胰蛋白胨、牛肉膏及優(yōu)化得到的麩皮和魚粉進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，采用 L9(34) 正交表確定培養(yǎng)基各組分的最佳配比(表1)。

表1 菌株BS-10培養(yǎng)基成分組合優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experiment design for medium composition optimization of BS-10 g/L

1.5 優(yōu)化培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)

以NYSM培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基，采用7 L發(fā)酵罐(NBS公司， BIO FLO 3000)和優(yōu)化所得培養(yǎng)基NBFB對BS-10進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30 ℃，溶氧30%(采用攪拌轉(zhuǎn)速-溶氧聯(lián)合控制，初始轉(zhuǎn)速300 r/min)，通氣量1 v/(v·min)，每2 h取樣1次，測定菌體生物量和芽孢數(shù)，記錄發(fā)酵過程中的相關(guān)參數(shù)。

1.6 生物活性測定

參考WHO推薦的生物活性測定方法進(jìn)行殺蚊幼蟲活性測定[10]。稱取一定量的BS-10菌粉，溶于蒸餾水中配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的母液。在(28±2) ℃下，以3齡末至4齡初的致倦庫蚊幼蟲為供試對象，設(shè)置7個(gè)質(zhì)量濃度(10 mg/L,1 mg/L,100 μg/L,10 μg/L,1 μg/L,0.5 μg/L,0.1 μg/L)，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次，每20頭幼蟲置于100 mL待測藥液中記為1次重復(fù)，記錄48 h后的死亡數(shù)。以無菌水作對照，計(jì)算校正死亡率，用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算LC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BS-10培養(yǎng)基組分的篩選

2.1.1 不同碳源對菌株BS-10菌體生物量和芽孢數(shù)的影響 試驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明，添加麩皮的BS-10菌株發(fā)酵液菌體生物量、芽孢數(shù)明顯高于對照和其他處理組；添加葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇和麥芽糖的試驗(yàn)組與對照組無明顯差異。綜合菌體生物量和芽孢數(shù)2個(gè)因素，選擇麩皮作為最佳碳源。

圖1 碳源對菌株BS-10發(fā)酵菌體生物量和芽孢數(shù)的影響

2.1.2 不同氮源對菌株BS-10菌體生物量和芽孢數(shù)的影響 圖2表明，添加魚粉、大豆粉和花生餅粉均能促進(jìn)BS-10的菌體生長，其中，魚粉的芽孢數(shù)最高，大豆粉次之；添加玉米粉、酵母粉、尿素和NH4NO3的發(fā)酵液芽孢數(shù)均低于對照。綜合菌體生物量和芽孢數(shù)2個(gè)因素，選擇魚粉作為最佳氮源。

圖2 氮源對菌株BS-10發(fā)酵菌體生物量和芽孢數(shù)的影響

2.1.3 魚粉、麩皮添加量對菌株BS-10發(fā)酵菌體生物量和芽孢數(shù)的影響 試驗(yàn)結(jié)果(圖3，圖4)表明，隨著魚粉和麩皮在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中比例的增加，發(fā)酵液菌體生物量和芽孢數(shù)逐漸增大，當(dāng)魚粉的添加量為1.1%時(shí)，發(fā)酵液菌體生物量和芽孢數(shù)達(dá)到最大；當(dāng)麩皮的添加量為1.1%和1.3%時(shí)，發(fā)酵液菌體生物量和芽孢數(shù)分別達(dá)到最大。但隨著添加量的繼續(xù)增大，發(fā)酵液菌體生物量和芽孢數(shù)呈下降趨勢。因此，在培養(yǎng)基中同時(shí)添加魚粉和麩皮時(shí)，其添加量之和不能大于1.3%。

圖3 魚粉添加量對菌株BS-10發(fā)酵菌體生物量和芽孢數(shù)的影響Fig.3 Effect of fish meal additive amount on biomass and spore count of BS-10

圖4 麩皮添加量對菌株BS-10發(fā)酵菌體生物量和芽孢數(shù)的影響Fig.4 Effect of wheat bran additive amount on biomass and spore count of BS-10

2.2 菌株BS-10培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，胰蛋白胨、牛肉膏、魚粉和麩皮對菌株BS-10菌體生物量和芽孢數(shù)均有明顯影響，具體結(jié)果見表2。

表2 菌株BS-10培養(yǎng)基成分組合優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results for medium composition optimization of BS-10

表2表明，4因素對菌株BS-10芽孢數(shù)影響大小依次為：A>B>D>C，即胰蛋白胨>牛肉膏>麩皮>魚粉；對菌體干質(zhì)量影響大小依次為A>C>D>B，即胰蛋白胨>魚粉>麩皮>牛肉膏。以芽孢數(shù)為考察指標(biāo)時(shí)，培養(yǎng)基成分最優(yōu)組合為A1B1C1D2；以菌體干質(zhì)量為考察指標(biāo)時(shí)，培養(yǎng)基成分最優(yōu)組合為A3B3C3D3。因此，為同時(shí)保證菌體干質(zhì)量和芽孢數(shù)，以菌體干質(zhì)量和芽孢數(shù)的乘積為考察指標(biāo)，此時(shí)培養(yǎng)基成分最優(yōu)組合為A1B1C3D2，即胰蛋白胨3 g/L，牛肉膏1 g/L，魚粉6 g/L，麩皮4 g/L(NBFB培養(yǎng)基)。

2.3 菌株BS-10優(yōu)化培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

圖5和圖6結(jié)果表明，菌株BS-10在NYSM 培養(yǎng)基中6 h進(jìn)入快速生長階段，耗氧量在7～13 h迅速增加，而在NBFB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h即進(jìn)入快速生長階段，耗氧量在3～7 h 迅速增加。

圖5 菌株BS-10在NYSM 培養(yǎng)基中的溶氧和轉(zhuǎn)速Fig.5 Dissolved oxygen and speed of BS-10 in NYSM medium

圖6 菌株BS-10在NBFB培養(yǎng)基中的溶氧和轉(zhuǎn)速Fig.6 Dissolved oxygen and speed of BS-10 in NBFB medium

圖7結(jié)果進(jìn)一步表明，BS-10在NBFB培養(yǎng)基中沒有經(jīng)過穩(wěn)定期，即進(jìn)入了快速生長的對數(shù)期，而在NYSM培養(yǎng)基中需要4 h的穩(wěn)定期。顯微鏡觀察芽孢萌發(fā)情況表明，BS-10菌株在NYSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)22 h芽孢出現(xiàn)脫落，而在NBFB中培養(yǎng)18 h即出現(xiàn)脫落，說明菌株BS-10在NBFB培養(yǎng)基中發(fā)酵周期縮短了4 h。

2.4 不同培養(yǎng)基對致倦庫蚊幼蟲的毒力

表3結(jié)果表明，3種培養(yǎng)基的BS-10培養(yǎng)物對致倦庫蚊幼蟲的毒力大小依次為NBFB>NYSM>NB，與NB基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，優(yōu)化的NBFB培養(yǎng)基中BS-10芽孢數(shù)增大了2個(gè)數(shù)量級，毒力也增加了100倍，說明優(yōu)化得到的NBFB培養(yǎng)基可取代NYSM培養(yǎng)基用于菌株BS-10規(guī)?；a(chǎn)。

圖7 菌株BS-10在NYSM和NBFB培養(yǎng)基中的生長曲線

表3 不同培養(yǎng)基中BS-10生物量、芽孢數(shù)和毒力的比較Table 3 Comparison of biomass,spore count and toxicity among different media

3 討 論

大量研究結(jié)果表明，球形芽孢桿菌不能利用葡萄糖、蔗糖等糖類物質(zhì)，只能利用蛋白質(zhì)、氨基酸等作為能源物質(zhì)[11]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了球形芽孢桿菌的這一特性。也就是說，麩皮作為碳源添加到NB培養(yǎng)基中，起促進(jìn)作用的是其中的氨基酸等物質(zhì)。這與郭榮君等[12]通過有機(jī)氮源篩選試驗(yàn)得出的“豆餅粉和麩皮添加到液體培養(yǎng)基中能夠顯著提升地衣芽孢桿菌BH1芽孢量”的結(jié)果相一致。

魚粉和麩皮作為培養(yǎng)基成分能夠?yàn)槲⑸锾峁┧璧奶荚础被?、微量元素和維生素[13]。對于球形芽孢桿菌而言，麩皮往往作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分用于殺蚊毒素的生產(chǎn)。然而，固體發(fā)酵的周期相對較長，需要72 h以上才能獲得理想的生物量和芽孢數(shù)[14-15]。為了縮短發(fā)酵周期，降低發(fā)酵成本，研究者們開始將目光轉(zhuǎn)向生物副產(chǎn)品。目前可以作為發(fā)酵生產(chǎn)的材料有花生餅粉[16]、黃豆粉[16]、蛋黃[17]、污泥[18]等，但在這些培養(yǎng)基中，所得發(fā)酵液的毒力多與對照培養(yǎng)基(NYSM培養(yǎng)基或者NB培養(yǎng)基)相當(dāng)。本研究發(fā)現(xiàn)，在NB培養(yǎng)基中添加適量的魚粉或麩皮均能夠顯著促進(jìn)菌株BS-10的菌體生物量和芽孢數(shù)，且魚粉的效果要優(yōu)于花生餅粉和大豆粉，而在同時(shí)含有魚粉和麩皮的NBFB培養(yǎng)基中，菌株BS-10的培養(yǎng)周期縮短至18 h，毒力增大了100倍，考慮到2種添加物均為價(jià)格低廉的副產(chǎn)品，因此，NBFB培養(yǎng)基可以用于菌株BS-10的規(guī)?；a(chǎn)。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的魚粉和麩皮對菌體生物量及芽孢數(shù)的促進(jìn)效果進(jìn)一步減小，這與EL-Bendary等[15]在研究干酪乳清液培養(yǎng)球形芽孢桿菌時(shí)得到的結(jié)果相一致，推測其可能與高濃度乳清液中含有過量的陽離子等因素有關(guān)。對于2種添加物中是否存在芽孢促進(jìn)因子，有研究表明：精氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸能夠促進(jìn)球形芽孢桿菌芽孢的形成和毒素蛋白的合成[19]，這可能是NBFB培養(yǎng)基毒性提高以及發(fā)酵周期縮短的原因所在。而這種向培養(yǎng)基中添加魚粉和麩皮的方法是否適用于其他芽孢桿菌，以及兩者促進(jìn)球形芽孢桿菌芽孢形成的機(jī)制均有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

(1)通過單因素試驗(yàn)篩選出促進(jìn)菌株BS-10芽孢形成的2種培養(yǎng)基成分魚粉和麩皮，通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到高產(chǎn)芽孢的NBFB培養(yǎng)基：3 g/L胰蛋白胨，1 g/L牛肉膏，6 g/L魚粉和4 g/L麩皮。

(2)NBFB培養(yǎng)基發(fā)酵周期較NYSM培養(yǎng)基縮短了4 h。

(3)NBFB培養(yǎng)基芽孢數(shù)達(dá)4.12×109CFU/mg，對致倦庫蚊幼蟲的毒力較基礎(chǔ)培養(yǎng)基增大了100倍。

[1] Nielsen-Leroux C,Charles J F.Binding ofBacillussphaericusbinary toxin to a specific receptor on midgut brush-border membranes from mosquito larvae [J].Eur J Biochem,1992,210(2):585-590.

[2] Shanmugavelu M,Rajamohan F,Kathirvel M,et al.Functional complementation of nontoxic mutant binary toxins ofBacillussphaericus1593M generated by site-directed mutagenesis [J].Appl Environ Microbiol,1998,64(2):756-759.

[3] Thanabalu T,Hindley J,Jackson-Yap J,et al.Cloning,sequencing,and expression of a gene encoding a 100-kilodalton mosquitocidal toxin fromBacillussphaericusSSⅡ-1 [J].J Bacteriol,1991,173(9):2776-2785.

[4] Thanabalu T,Porter A G.ABacillussphaericusgene encoding a novel type of mosquitocidal toxin of 31.8 kDa [J].Gene,1996,170(1):85-89.

[5] Liu J W,Porter A G,Wee B Y,et al.New gene from nineBacillussphaericusstrains encoding highly conserved 35.8-kilodalton mosquitocidal toxins [J].Appl Environ Microbiol,1996,62(6):2174-2176.

[6] Wirth M C,Walton W E,Federici B A.Evolution of resistance to theBacillussphaericusBin toxin is phenotypically masked by combination with the mosquitocidal proteins ofBacillusthuringiensissubspecies israelensis [J].Environ Microbiol，2010,12(5):1154-1160.

[7] 陳世夫，管玉霞，武秀蘭，等.五株球形芽胞桿菌的產(chǎn)毒效能及殺蟲活性影響因子的比較研究 [J].中國公共衛(wèi)生學(xué)報(bào),1989,8(6):371-373.

Chen S F,Guan Y X,Wu X L,et al.A comparative study of five strains ofBacillussphaericusfactor of toxigenic effectiveness and impact of insecticidal activity [J].Chinese Journal of Public Health,1989,8(6):371-373.(in Chinese)

[8] 戴承鏞，黃湘云.球形芽孢桿菌BS-10菌株的生物學(xué)特性及其殺滅蚊幼效果 [J].中國公共衛(wèi)生學(xué)報(bào),1990,9(2):69-72.

Dai C Y,Huang X Y.Biological properties and moqutio larvicide activity ofBacillussphaericusstrain BS-10 [J].Chinese Journal of Public Health,1990,9(2):69-72.(in Chinese)

[9] 戴志東，袁生安，吳鶴臨.球形芽孢桿菌BS-10于水生植物覆蓋污水塘、溝滅蚊幼效果比較 [J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制,1994,10(2):120-121.

Dai Z D,Yuan S A,Wu H L.The mosquito larvicide effect ofBacillussphaericusBS-10 in sewage pond and ditch covered aquatic plants [J].Journal of Medical Pest Control,1994,10(2):120-121.(in Chinese)

[10] World Health Organization.Informal consultation on the development ofBacillussphaericusas a microbial larvicide [M].Geneva:TDR/BCV/SPHAERICUS/85.3,1985:1-24.

[11] Russell B L,Jelley S A,Yousten A A.Carbohydrate metabolism in the mosquito pathogenBacillussphaericus2362 [J].Appl Environ Microbiol,1989,55(2):294-297.

[12] 郭榮君，王步云，李世東.營養(yǎng)對生防菌株BH1芽孢產(chǎn)量的影響研究 [J].植物病理學(xué)報(bào),2005(3):283-285.

Guo R J,Wang B Y,Li S D.Nutrient requirement for the spore production of biocontrol strain BH1 [J].Journal of Plant Pathology,2005(3):283-285.(in Chinese)

[13] Devi P S,Ravinder T,Jaidev C.Cost-effective production ofBacillusthuringiensisby solid-state fermentation [J].J Invertebr Pathol,2005,88(2):163-168.

[14] Foda M S,El-Bendary M A,Moharam M E.Salient parameters involved in mosquitocidal toxins production fromBacillussphaericusby semi-solid substrate fermentation [J].Egyptian Journal of Microbiology,2003,38(3):229-246.

[15] EL-Bendary M A,Moharam M E,Foda M S.Efficient mosquitocidal toxin production byBacillussphaericususing cheese whey permeate under both submerged and solid state fermentations [J].J Invertebr Pathol,2008,98(1):46-53.

[16] Prabakaran G,Balaraman K,Hoti S L,et al.A cost-effective medium for the large-scale production ofBacillussphaericusH5a5b (VCRC B42) for mosquito control [J].Biological Control,2007,41(3):379-383.

[17] Prabakaran G,Hoti L.Egg yolk enhances early sporulation and toxicity ofBacillussphaericusH5a5b for small-scale production of a mosquito control agent [J].Acta Tropica,2008,108(1):50-53.

[18] Zhuang L,Zhou S,Wang Y,et al.Mosquito biolarvicide production by sequential fermentation with dual strains ofBacillusthuringiensissubsp.israelensisandBacillussphaericususing sewage sludge [J].Bioresource Technology,2011,102(2):1574-1580.

[19] Shevtsov V V,Petrova T M,Khovrychev M P,et al.Growth and spore germination factors of various strains ofBacillussphaericus[J].Mikrobiologiia,1990,59(3):453-459.

Optimization of high yield medium forBacillussphaericusstrain 10

(KeyLaboratoryofNaturalPesticideChemicalBiology,MinistryofEducation,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China)

【Objective】 The medium for high mosquito larvicide activity ofBacillussphaericusstrain 10 (BS-10) was optimized to guide large-scale production.【Method】 In terms of bacterial biomass,dry weight and spore count of strain BS-10,carbon and nitrogen sources of medium were optimized by orthogonal experiment.Then,the biomass,dissolved oxygen,and other related parameters of optimal medium were evaluated through a 7 L fermentor.【Result】 The optimal medium (NBFB) of BS-10 consisted of 3 g/L tryptone,1 g/L beef extract,6 g/L fish meal and 4 g/L wheat bran.Fermentation period was shortened to 18 h with the optimal medium.The maximum spore count was 4.12×109CFU/mg and the toxicity againstCulexquinquefasciatuswas increased by 100 times compared to basal medium (NB medium).【Conclusion】 Culturing strain BS-10 in NBFB medium obtained higher larvicide activity and shortened the fermentation period,which has a promising application potential and economic value.

Bacillussphaericus;BS-10;Culexquinquefasciatus;fish meal;wheat bran

時(shí)間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.032

2014-03-26

廣州市科技局項(xiàng)目(2010J1-E361)

劉 美(1988-)，男，河南許昌人，碩士，主要從事微生物農(nóng)藥研究。E-mail：panda1988mei@163.com

廖美德(1965-)，男，湖北黃梅人，副教授，主要從事微生物、農(nóng)藥生物技術(shù)研究。E-mail：liaomeide@scau.edu.cn

S476.11

A

1671-9387(2015)11-0214-07

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