鞠吉雨，于文靜，初金鑫，張金寶，連 波，趙春玲*

1濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2 濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，濰坊 261053

血栓性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，其主要治療手段之一是溶栓。溶栓劑迄今已發(fā)展了三代，但出血、發(fā)熱、過敏反應(yīng)、低血壓等副作用的出現(xiàn)使現(xiàn)有藥物并不理想。臨床上迫切需要尋找和開發(fā)安全高效的新型溶栓劑。研究發(fā)現(xiàn)，纖溶酶(fibrinolytic enzyme)在溶栓治療中起重要作用，能夠溶解血凝塊的主要成分纖維蛋白［1，2］。

海蚯蚓(Arenicola cristata)，屬于環(huán)節(jié)動物門海洋生物，始載于《中國藥用動物志》，用于癰瘡腫毒，有清熱解毒之功效。但有關(guān)海蚯蚓的研究只有少量報道［3-5］。1975 年血紅蛋白從海蚯蚓中被分離且結(jié)構(gòu)被特征化;Parker 等從海蚯蚓中分離到4 種能夠激活環(huán)AMP 磷酸二酯酶;Wang 等從海蚯蚓中分離到一種具有抗腫瘤活性的新的烯醇式磺化甾醇—Arenicolsterol A。本研究利用cDNA 末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)法，從海蚯蚓消化道組織中獲得海蚯蚓纖溶酶的cDNA 序列、氨基酸序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體并表達(dá)純化融合蛋白，并進(jìn)一步對其功能進(jìn)行初步研究。本研究為探討海蚯蚓纖溶酶的生物學(xué)活性和可能的開發(fā)應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海蚯蚓采自煙臺市近海。Trizol 試劑、3＇RACE試劑盒、5＇RACE 試劑盒購自北京吉百特公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自fermentas 公司;T-A Easy 試劑盒、高保真Taq 酶、內(nèi)切酶BamHI 和XhoI 購自大連寶生物公司;IPTG、鎳柱填料和超濾管購自北京東勝泰博公司;牛血纖維蛋白溶酶原和尿激酶購自中國食品藥品檢定研究院。表達(dá)載體pET-21a、E.coli BL21為本室保存。

1.2 海蚯蚓纖溶酶基因cDNA 3＇及5＇ 端序列擴增及測序

設(shè)計引物序列:3R 為含接頭引物序列的反轉(zhuǎn)錄引物;3R1 為3＇端接頭引物;3F1 是根據(jù)絲氨酸蛋白酶家族催化活性中心Ser 附近所含的高度保守序列GDSGGP 設(shè)計的引物。5R 為oligodT 反轉(zhuǎn)錄引物;5R1、5R2 是根據(jù)3＇RACE 獲得的3＇端序列設(shè)計的特異性引物;5F1 為含5＇端接頭引物序列的引物;5F2為5＇端接頭引物。引物具體序列見Table 1。

利用Trizol 試劑從鮮活海蚯蚓腸道組織中提取總RNA，以3R 作為反轉(zhuǎn)錄引物使用fermentas 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模板，3F1 和3R1 為上下游引物，利用3＇RACE 試劑盒擴增3＇末端序列。以5R-oligodT 作為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，使用dCTP 和TdT 對純化的cDNA 加尾，以過柱純化后的加尾產(chǎn)物為模板，5F1、5R1 和5F2、5R2 分別為引物，利用5＇RACE 試劑盒擴增5＇末端序列。將擴增出來3＇和5＇末端序列電泳膠回收純化后，分別連接TA 克隆載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌E.coli DH5α，測序。應(yīng)用Contigexpress 軟件對海蚯蚓纖溶酶基因cDNA 5＇端和3＇端序列進(jìn)行拼接。

1.3 生物信息學(xué)分析

將得到的海蚯蚓纖溶酶基因DNA(mRNA)序列，使用DNAMAN 軟件，獲得該海蚯蚓纖溶酶cDNA 編碼的氨基酸序列。登陸NCBI 利用Blast 在GenBank 數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較分析。Signal P 3.0 軟件分析海蚯蚓纖溶酶的信號肽序列。

1.4 海蚯蚓纖溶酶基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)發(fā)現(xiàn)的海蚯蚓纖溶酶基因cDNA序列，設(shè)計一對引物，F(xiàn):5＇-TTCGAGCTCATTATTGGTGGTTCTGATGCA-3＇，R:5＇-GTGCTCGAGGACTCCAGTAACACTCTGGAT-3＇，上下游引物中分別引入Sac1 和XhoI 酶切位點(下劃線部分);以海蚯蚓纖溶酶cDNA 為模板，利用pfu DNA 聚合酶擴增活性肽的cDNA 片段，PCR 產(chǎn)物利用酶切、連接的方法構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET-21a 中，并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α 中，以雙酶切和測序進(jìn)行陽性克隆的篩選與鑒定。

1.5 重組海蚯蚓纖溶酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化鑒定

提取經(jīng)鑒定確認(rèn)的陽性重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，構(gòu)建工程菌。工程菌單菌落在1.0 mM IPTG 中30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h(對照組未加入IPTG);收集菌體后超聲破碎，4 ℃12000 × g 離心30 min，上清和沉淀各取10 μL 進(jìn)行SDS-PAGE 分析。將收集的菌體超聲破碎后，取上清液過Ni2+樹脂柱，50 mL 洗滌液洗滌(20mM Tris-CL，pH7.4，10 mM 咪唑，0.5 M NaCl);用洗脫液(20 mM Tris-CL，pH7.4，500 mM 咪唑，0.5M NaCl)洗脫結(jié)合蛋白，每次加入1 mL，共洗5 次。

1.6 重組海蚯蚓纖溶酶的纖維蛋白酶原激活活性測定

在50 mL TBS-HCL(50 mmol/L Tris-CL，pH 8.0，150 mmol/L NaCl)緩沖液中加入0.5 g 瓊脂糖，微波爐煮沸;加入0.5 g 脫脂奶粉，混勻。冷卻至40℃后加入10 U 牛血纖維蛋白溶酶原，混勻。鋪2 個平皿，待凝固后打孔，加入0.5、1 μg/μL 重組蛋白，以尿激酶(1 μg/μL)為陽性對照，以PBS 為陰性對照，37 ℃孵育16 h 后，觀察小孔周圍有無透明圈的形成。

2 實驗結(jié)果

2.1 海蚯蚓纖溶酶基因cDNA 3＇端及5＇端序列擴增

以海蚯蚓消化組織RNA 為模板，利用3＇RACE和5＇RACE 技術(shù)分別擴增出3＇端及5＇端序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，3＇端和5＇端擴增產(chǎn)物長度分別約為250bp 及740bp(圖1，圖2)。測序后，應(yīng)用Contigexpress 軟件對海蚯蚓纖溶酶基因cDNA 5＇端和3＇端序列進(jìn)行拼接，獲得海蚯蚓纖溶酶編碼基因的DNA(mRNA)序列。使用DNAMAN 軟件，獲得該海蚯蚓纖溶酶cDNA 編碼的氨基酸序列。該蛋白酶由信號肽、前肽及成熟肽組成，成熟肽以IIGG 起始;含絲氨酸蛋白酶家族高度保守序列GDSGGP 及保守的催化三聯(lián)體(H79，D126，S213)(圖3)。

圖2 5＇ RACE 擴增產(chǎn)物Fig.2 Amplification product of 5＇ RACE

2.2 海蚯蚓纖溶酶cDNA 編碼的氨基酸序列的同源性分析

圖3 海蚯蚓纖溶酶基因序列和氨基酸序列Fig.3 Gene sequence encoding fibrinolytic enzyme of A.cristata and deduced amino acid sequence

登陸NCBI，利用Blast 在GenBank 數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較分析。結(jié)果顯示尚無與該基因具有明顯相似性的序列，提示其可能為一新基因。該海蚯蚓纖溶酶與蚯蚓蛋白酶比較，氨基酸序列同源性為＜40%;海蚯蚓蛋白酶除與其他環(huán)節(jié)動物的蛋白酶都具有GDSGGP 高度保守序列外，在一級結(jié)構(gòu)上沒有同源性。

2.3 重組表達(dá)克隆的鑒定

篩選的陽性克隆經(jīng)Sac1 和XhoI 雙酶切，出現(xiàn)705bp 目的基因片斷(圖4)，經(jīng)測序，序列與RACE克隆結(jié)果一致。

2.4 重組蛋白的表達(dá)純化

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)后，結(jié)果如圖5 所示，在27kDa 處可見有重組海蚯蚓纖溶酶融合蛋白，主要以包涵體形式存在，上清中含量較少。上清液經(jīng)Ni2+樹脂柱純化后獲得均質(zhì)的融合蛋白(圖6)。

2.5 重組海蚯蚓纖溶酶的纖維蛋白酶原激活活性

經(jīng)平板法檢測純化的重組海蚯蚓纖溶酶的活性。在加入纖維蛋白酶原的平板上，加重組蛋白和尿激酶的小孔周圍形成明顯的透明圈(圖7);而不加纖維蛋白酶原的平板上，加重組蛋白和尿激酶的小孔周圍都沒有透明圈形成。這說明該重組海蚯蚓纖溶酶具有纖維蛋白酶原激活活性。

圖4 重組表達(dá)克隆的酶切鑒定Fig.4 Identification of the recombinant clone by restriction enzymes

圖5 重組原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.5 Induced expression of the recombinant plasmid from A.cristata protease

3 討論

纖溶酶作為新型溶栓劑，主要來源于天然動植物、微生物［6-9］。但由于分離提取存在操作繁瑣、提取純度低、所需原材料多等缺點，因此，應(yīng)用基因工程技術(shù)獲得有功能性的蛋白藥物已成為該領(lǐng)域的研究熱點。纖溶酶大多屬于絲氨酸蛋白酶家族，該家族的蛋白酶催化活性中心Ser 附近含高度保守序列GDSGGP［10］，這為尋找已知功能蛋白的編碼基因提供了入手點。

圖6 重組表達(dá)蛋白的純化Fig.6 Purification of the recombinant protein

圖7 重組表達(dá)蛋白的體外活性測定Fig.7 In vitro fibrinolytic activity of the purified recombinant protein

本研究根據(jù)絲氨酸蛋白酶家族高度保守序列GDSGGP 設(shè)計引物，采用3＇RACE 和5＇RACE 技術(shù)從海蚯蚓消化道上皮細(xì)胞中擴增出長度為777bp 的蛋白質(zhì)編碼序列。該基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的其他基因序列沒有明顯的相似性;其氨基酸序列在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性搜索分析證明該基因為一新發(fā)現(xiàn)的基因，且其蛋白序列中含有與其他絲氨酸蛋白酶家族高度保守序列GDSGGP，這提示我們克隆到的海蚯蚓纖溶酶為絲氨酸蛋白酶家族的一個新成員。海蚯蚓纖溶酶中還含有保守的催化三聯(lián)體(H83、D129、S225)，由信號肽、前肽及成熟肽組成，且其成熟肽即蛋白質(zhì)的活性形式中含有保守的IVGG(第36～39 位)序列［11］。進(jìn)一步將海蚯蚓成熟肽成功構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET-21a 中，轉(zhuǎn)化工程菌，融合蛋白主要為包涵體，其上清經(jīng)Ni2+樹脂柱純化后，通過平板法證明該融合蛋白具有纖維蛋白酶原激活活性，顯示了間接的纖溶活性。絲氨酸蛋白酶家族主要裂解纖維蛋白和纖維蛋白原中Lys或Arg 羧基端的肽鍵使其被降解成許多具有抗凝作用的可溶性小肽［12］;有的纖溶酶還作為纖溶酶原激活劑，間接發(fā)揮溶栓作用，如葡激酶［13］、普佑克(注射用重組人尿激酶原，即Pro-UK)［14］。

另外，就形態(tài)而言，海蚯蚓形似蚯蚓，故名海蚯蚓;就種屬而言，海蚯蚓與蚯蚓都屬于環(huán)節(jié)動物門，海蚯蚓屬于多毛綱，蚯蚓屬于寡毛綱。從蚯蚓中提取的蚓激酶，具有良好的溶栓抗凝作用，使其在治療多種血栓性疾病方面取得很好的應(yīng)用［15］。蚓激酶(lumbrokinase，LK)就是從蚯蚓體內(nèi)分離出的一組20～40 kDa 絲氨酸蛋白酶，也稱蚯蚓纖溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme，EFE)，具有直接溶解纖維蛋白及纖溶酶原激活作用［16-18］。

因此，我們推測:海洋生物海蚯蚓中也可能含有一組具有溶栓作用的纖溶酶。我們期望能繼續(xù)進(jìn)行海蚯蚓纖溶酶的克隆工作，并對克隆到的海蚯蚓纖溶酶的溶栓活性進(jìn)行比較，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高效低毒的具有溶栓作用的海洋創(chuàng)新藥物提供科學(xué)依據(jù)。

總之，本研究從海洋環(huán)節(jié)生物海蚯蚓中克隆到海蚯蚓纖溶酶的cDNA 序列和氨基酸序列，并初步證明其具有纖維蛋白酶原激活活性。這為海蚯蚓功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定理論基礎(chǔ)，也為開發(fā)海洋生物新型溶栓藥物提供新的思路和資源。

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