賴 朋，劉怡欣

1西華大學生物工程學院，成都 610039;2 四川大學華西醫(yī)院老年病科，成都 610041

血管內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)對于維持血管內(nèi)皮完整性和血管生成具有極其重要的作用。作為一種祖細胞，EPCs 為成熟血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，具有分化能力，能通過再內(nèi)皮化(Re-endothelialization)或再血管化(Re-vascularization)發(fā)揮其保護血管內(nèi)皮的功能［1］。研究表明，骨髓中生成的EPCs 能夠延緩脈粥樣硬化(AS)的發(fā)病歷程，改善缺血灶的血液供應［2］。因此，EPCs 被認為是心腦血管疾病新的治療策略，包括動冠心病、心肌梗死、缺血性卒中等［3，4］。臨床上已在小范圍開展應用EPCs 移植治療缺血性疾病的實踐［5］。然而，有證據(jù)表明，如高血脂、高血糖等心血管危險因素能減少循環(huán)中EPCs 的數(shù)量并削弱其功能［6，7］，其中oxLDL 作為獨立的心腦血管事件的危險因素，在體內(nèi)和體外都能影響EPCs 的數(shù)量與功能［8，9］。因此，對抗在高濃度oxLDL 環(huán)境下所造成的EPCs 損傷將成為治療動脈粥樣硬化等心腦血管缺血性疾病的方法之一［10］。

薔薇目，豆科落葉喬木皂莢(Gleditsia sinensis Lam.)廣泛分布于中國各地，其果實含有三萜、黃酮、低聚糖等多種類型的化合物。研究顯示皂莢具有多種生理活性［11］。近年來有報道顯示其中的三萜類化合物具有保護缺血心肌的作用［12］。此前的研究也發(fā)現(xiàn)皂莢水提物中的三萜酸(主要為刺囊酸和齊墩果酸)具有明顯的降血脂和抗AS 作用［13］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，其中刺囊酸的降脂能力來源于其對兩種脂代謝酶:酰基輔酶A 膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)和二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)的抑制［14］，但抗AS 的作用機制并未得到充分揭示。本研究考察了刺囊酸在體外對于oxLDL 誘導的EPCs損傷的保護作用，并揭示其部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1100 高效液相色譜儀，G1312A 二元泵，二極管陣列檢測器(DAD，美國Agilent 公司);IX71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司);680 酶標儀、硝酸纖維素薄膜(美國Bio-Rad 公司);Wistar 大鼠［四川省實驗動物專委會，許可證號:SCXK(川)2013-14］;皂莢(成都中醫(yī)藥大學);人纖連蛋白、異硫氰酸熒光素、荊豆凝集素、低密度脂蛋白、Wortmannin、硝基-L-精氨酸甲酯、二氨二苯吲哚、血管內(nèi)皮生長因子(美國Sigma-Aldrich 公司);內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基及補充劑EGM-2-MV-Single Quots(美國Clonetics 公司);胎牛血清(美國Gibco 公司，批號:1221109);DiI 標記乙酰化低密度脂蛋白(美國Molecular Probes 公司);eNOS 抗體(批號:sc-8904)、Ser1177 磷酸化eNOS 抗體(批號:sc-3452)、Akt 抗體(批號:sc-9005)、Ser473 磷酸化Akt 抗體(批號:sc-2511)(美國Santa Cruz 公司);抗VEGFR-2 抗體(批號:121126)、抗CD133 抗體(批號:120831)(北京中杉金橋公司);辣根過氧化酶結(jié)合的IgG(武漢博士德公司，批號:2012.06);TUNEL 試劑盒(美國Promega 公司);Caspase-3 活性檢測試劑盒(海門碧云天公司，批號:20120128);Transwell 板(美國Corning 公司)。

1.2 刺囊酸的分離

皂莢水提物的提取方法參照文獻報道［13］，隨后通過柱層析分離得刺囊酸(echinocystic acid，EA)。HPLC 檢測其純度≥98%，色譜條件為:固定相，40×500 mm 反相C18硅膠柱，粒徑5 μm;流動相，甲醇∶水=8∶2;檢測器，DAD，215 nm 處檢測出峰。結(jié)構(gòu)經(jīng)ESI-MS 和1H NMR 確認為EA(參見圖1)。

圖1 刺囊酸的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of echinocystic acid (EA)

1.3 EPCs 的分離、培養(yǎng)及鑒定

EPCs 的分離和培養(yǎng)參照以前的方法［15］。3 到4 周齡的Wistar 大鼠處死并分離股骨和脛骨骨髓，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法(密度:1.083)提取單個核細胞并接種于人纖連蛋白涂層(FN)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)基使用內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(EGM-2)并補加EGM-2-MV-Single Quots 和20%胎牛血清(FBS)，4 d后洗去未貼壁細胞，此后每3 d 更換新鮮培養(yǎng)基，給藥前換為無血清培養(yǎng)基休眠培養(yǎng)24 h。

貼壁的單個核細胞培養(yǎng)7 d 后用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的荊豆凝集素(UEA-1)和DiI 標記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)進行熒光染色。細胞先與DiI-acLDL(10 μg/mL)在37 ℃共培養(yǎng)4 h，2%的多聚甲醛固定15 min 后再與UEA-1(10 μg/mL)共培養(yǎng)1 h，倒置熒光顯微鏡觀察，雙陽性細胞鑒定為EPCs［16］。EPCs 表面表達血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)和CD133 等標志性抗原，通過免疫熒光染色法標記VEGFR-2 和CD133，雙陽性可確認EPCs。

1.4 OxLDL 的制備

參考以前方法制備oxLDL［8］。正常低密度脂蛋白(nLDL)37 ℃下與CuSO4(10 μM)共培養(yǎng)24 h，用含NaCl(150 mM)、乙二胺四乙酸(1 mM)、多粘菌素(100 μg/mL)的無菌溶液透析過夜。制備的ox-LDL 可用測定硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物的含量及瓊脂糖凝膠電泳的方法驗證。

1.5 EPCs 的處理

單個核細胞培養(yǎng)7 d 后，胰酶消化后收集制成細胞懸液并計數(shù)，等細胞數(shù)接種于24 孔板并分為4組:正常組(Control，培養(yǎng)基+0.1%DMSO)、模型組(Model，培 養(yǎng) 基+100 μg/mL oxLDL)、高 劑 組(HEA，培養(yǎng)基+100 μg/mL oxLDL+20 μM EA)、低劑組(LEA，培養(yǎng)基+100 μg/mL oxLDL+5 μM EA)。另外，為研究PI3K/Akt/eNOS 信號通路在EA 作用中的作用，再設(shè)置兩組藥理抑制組:PI3K 抑制組(Wort，高劑組+100 nM Wortmannin 預處理)和eNOS 抑制組(L-NAME，高劑組+100nM l-NAME 預處理)。Wortmannin 為PI3K 抑制劑，硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)為eNOS 抑制劑。

1.6 凋亡檢測

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導dUTP 缺口末端標記(TUNEL)測定法和Caspase-3 活性檢測法測定oxLDL 誘導的EPCs 凋亡。按TUNEL 試劑盒說明書操作，EPCs 用二氨二苯吲哚(DAPI)反染。TUNEL 染色陽性細胞為凋亡細胞，以盲法計數(shù)并計算陽性率(凋亡率)。Caspase-3 活性檢測試劑盒同樣按說明書操作，最后使用酶標儀在405 nm 處檢測對硝基苯胺的量，計算Caspase-3 活性。

1.7 細胞粘附測定

經(jīng)過相應處理之后的EPCs 用DiI-acLDL 染色(方法見1.2)，消化、離心之后重懸于含0.5%FBS的EGM-2 培養(yǎng)基，計數(shù)后等量接種于FN 涂層的24孔板，37 ℃培養(yǎng)60 min 后輕輕洗去未貼壁細胞。倒置熒光顯微鏡200 倍視野下，每孔隨機選取6 個視野盲法計數(shù)貼壁細胞并計算平均貼壁細胞數(shù)。

1.8 細胞遷移測定

單個核細胞培養(yǎng)7 d 后，無添加的EGM-2 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后進行Transwell 小室實驗。5 × 104個細胞重懸于100 μL 趨化緩沖液中，接種于8.0 μm 微孔的Transwell 上室，下室加入含100 ng/mL VEGF 的600 μL 趨化緩沖液，37 ℃下在5%CO2中培養(yǎng)8 h，用棉簽從上表面擦去未遷移細胞，0.1%結(jié)晶紫染色下室遷移細胞。在光鏡下每孔選取10 個隨機視野計數(shù)遷移細胞，并計算遷移率(對比總細胞數(shù))。

1.9 NO 產(chǎn)量測定

EPCs 的NO 產(chǎn)量可通過相應試劑盒測定。EPCs 產(chǎn)生的NO 轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和硝酸鹽，后者又被還原為前者，總亞硝酸鹽用Griess 試劑通過測定550 nm 處的吸光度定量。

1.10 相關(guān)蛋白表達測定

為揭示EA 的作用機制，采用Western blot 對細胞Akt/eNOS 蛋白及其磷酸化形式進行了測定。Triton X-100 緩沖液中裂解EPCs 1 h，離心除去細胞核及碎片，蛋白由SDS-PAGE 分離并印記于硝酸纖維素薄膜上，Tris 緩沖液中以脫脂牛奶封閉薄膜并清洗，加入特異性抗體［eNOS 抗體(1 ∶2500)、Ser1177 磷 酸 化eNOS 抗 體(1 ∶500)、Akt 抗 體(1∶1000)、Ser473 磷酸化Akt 抗體(1∶500)］4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶結(jié)合的IgG(1∶40000)室溫孵育1 h，增強化學發(fā)光發(fā)顯示印記并分析結(jié)果。

1.11 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗結(jié)果

2.1.1 EPCs 的鑒定

單個核細胞經(jīng)過7 d 的培養(yǎng)分化形成紡錘形外觀(早期EPCs 的形態(tài))，約90%以上的貼壁細胞在DiI-acLDL 攝取和UEA-1 結(jié)合實驗中呈雙陽性(參見圖2A、B 和C)。免疫熒光染色的結(jié)果顯示CD133 +和VEGFR-2 +細胞占了細胞總數(shù)的絕大部分(參見圖2D)，這進一步確定了這些細胞正是EPCs。

圖2 200 倍熒光顯微鏡下EPCs 的鑒定。A、B、C 分別代表DiI-acLDL 攝取陽性細胞、FITC-UEA-l 結(jié)合陽性細胞及雙陽性細胞;D 為分化培養(yǎng)7 天后的單個核細胞進一步進行免疫熒光染色的情況，同樣，VEGFR2 和CD133 雙陽性鑒定為EPCs;圖中顯示早期EPCs 為紡錘形而晚期EPCs 為卵石型。A、B、C 中白色橫條代表50 μm，D 中代表20 μm。Fig.2 Characterisation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs)at ×200 magnification.(A)Red fluorescence represents cells positive for DiI-acLDL uptaking.(B)Green fluorescence represents cells positive for FITC-UEA-l binding.(C)Yellow fluorescence represents differentiated endothelial progenitor cell-like adherent cells that were double-positive for uptake of DiI-acLDL and binding with FITC-UEA-l.(D)The cultured mononuclear cells were further characterized by immunofluorescent staining using the EPC-specific markers，VEGFR-2 and CD133，and the nuclear marker DAPI.The cells further differentiated to cobblestone-like late EPCs.Bars in A，B，and C=50 μm.Bars in D=20 μm

2.1.2 EA 抑制oxLDL 誘導的EPCs 凋亡

如圖3A-F 所示，TUNEL 染色與DAPI 復染使凋亡細胞呈現(xiàn)出綠色，而TUNEL 陰性的活細胞為藍色。在模型組中，oxLDL 陽性細胞對比正常組大大增加(模型組:35.2 ±6.4%，正常組:6.4 ±2.0%;P＜0.05);而EA 明顯降低了TUNEL 陽性細胞的比例(高劑組:14.7 ±5.3%，低劑組:22.9 ±7.2%;對比模型組P＜0.05)，而且此效果呈現(xiàn)出劑量依賴性;經(jīng)過藥理抑制劑Wortmannin 或L-NAME 預處理后，凋亡細胞的數(shù)量對比EA 高劑組明顯上升(PI3K抑制組:30.3 ±6.9%，eNOS 抑制組:28.1 ±5.8%，對比高劑組P＜0.05;參見圖3G)。Caspase-3 作為細胞凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白，其活性在模型組中明顯升高(模型組:670 ±89%，正常組:100% ±13%;P＜0.05;參見圖3H);EA 存在下，Caspase-3 活性收到明顯的劑量依賴性的抑制(高劑組:224 ±70%，低劑組:339 ±59%;對比模型組P＜0.05);同樣，Wortmannin 和l-NAME 使Caspase-3 活性再次上升(PI3K 抑制組:405 ± 44%，eNOS 抑制組:619 ±107%，對比高劑組P＜0.05)。

2.1.3 EA 改善EPCs 粘附及遷移功能

EPCs 的粘附能力對于其附著于內(nèi)皮和細胞外基質(zhì)，形成新生血管極其重要。本研究中，oxLDL 顯然明顯削弱了EPCs 的粘附能力(模型組:14 ±1，正常組:24 ±3;P＜0.05;參見圖4A-F);EA 部分恢復了EPCs 的正常粘附功能(高劑組:20 ±2，低劑組:17 ±2;對比模型組P＜0.05);而兩個抑制劑顯著抵消了EA 的作用(PI3K 抑制組:13 ±3，eNOS 抑制組:15 ±2，對比高劑組P＜0.05，參見圖4G)。

遷移能力對于EPCs 發(fā)揮功能同樣重要，Transwell 小室測試的結(jié)果如預計的一樣(參見圖5A、C、D)，模型組遷移率遠低于正常組(6.6 ± 0.9 對11.0 ± 1.4%);高劑量的EA 明顯改善了這種情況(高劑組:10.2 ± 2.0%;對比模型組P＜0.05)，而低劑未見明顯效果(低劑:8.0 ± 2.4%;對比模型P ＞0.05);Wortmannin 和L-NAME 顯著抑制了高劑EA 對于EPCs 遷移能力的恢復(PI3K 抑制組:6.9± 2.2%，eNOS 抑制組:7.4 ± 1.6%，對比高劑組P＜0.05)。

圖3 A 到F 為TUNEL 凋亡檢測結(jié)果圖(依次為正常組、模型組、高劑組、低劑組、PI3K 抑制組和eNOS 抑制組)，說明了EA抑制EPCs 凋亡的作用，白色箭頭代表陽性即凋亡細胞;G 為各組的TUNEL 檢測陽性率統(tǒng)計;H 為Caspase-3 活性統(tǒng)計圖。A 到F 中白色橫條代表25 μm;G、H 中* 代表相對于正常組P＜0.05;#代表相對于模型組P＜0.05;§代表相對于高劑組P＜0.05。Fig.3 A representation illustrating TUNEL-positive EPCs (A-F).White arrows show dual staining of EPCs (apoptosis).TUNELpositive EPCs were examined and counted in a blinded manner，and the percentage of apoptotic cells was calculated (G).Caspase-3 activity was measured by a caspase-3 activity assay kit，as described under Materials and methods (H).Data are shown as mean±SD (n=6).* P＜0.05 versus Control;#P＜0.05 versus Model;§ P＜0.05 versus High-dose (G and H).The Bar=25 μm

圖4 A 到F 表示各組EPCs 的粘附能力(依次為正常組、模型組、高劑組、低劑組、PI3K 抑制組和eNOS 抑制組)。紅色為DiI-acLDL 標記的粘附于FN 涂層培養(yǎng)板上的EPCs，其中白色橫條代表50 μm。G 為200 倍視野下粘附細胞數(shù)的統(tǒng)計圖，每組隨機取6 個視野做統(tǒng)計，其中* 代表相對于正常組P＜0.05;#代表相對于模型組P＜0.05;§代表相對于高劑組P＜0.05。Fig.4 Effects of EA on endothelial progenitor cell (EPC)adhesion.Identical numbers of cells were re-plated onto FN-coated culture plates.After removal of non-adherent cells，the adherent cells were counted.Data are shown as mean±SD (n=6).* P＜0.05 versus Control;#P＜0.05 versus Model;§ P＜0.05 versus High-dose (G).The Bar=50 μm

2.1.4 EA 增加EPCs 一氧化氮的產(chǎn)量

作為eNOS 的產(chǎn)物，NO 在心腦血管系統(tǒng)有廣泛的活性，對于EPCs 也有重要的影響［9］。oxLDL 大大降低EPCs 中NO 的產(chǎn)量(模型組:7.97 ±1.56 μM，正常組:18.37 ±2.52 μM;P＜0.05);EA 在這方面也發(fā)揮了較好的作用(高劑組:19.28 ±3.27 μM，低劑組:10.6 ±0.84;對比模型組P＜0.05);但是，隨著對PI3K/Akt/eNOS 通路的抑制，NO 的產(chǎn)量再次降低(PI3K 抑制組:11.09 ±2.31 μM，eNOS 抑制組:8.23 ±0.9 μM，對比高劑組P＜0.05;參見圖5B)。

2.1.5 EA 對激活Akt/eNOS 通路

鑒于PI3K/Akt/eNOS 信號通路在EPCs 存活、功能中的關(guān)鍵性作用，假設(shè)EA 將對此條通路具有調(diào)節(jié)作用并通過免疫印跡法進行了驗證(參見圖6)。本研究設(shè)定正常組磷酸化Akt(p-Akt)或磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白水平為100%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL 并未使Akt 的表達量減少，但卻顯著抑制了Akt的磷酸化激活(模型組:47 ±5%;對比正常組P＜0.05);而模型組的eNOS 表達受到明顯抑制(模型組eNOS:39 ±6%，對比正常組P＜0.05);EA 顯著增加了Akt 的磷酸化(高劑組p-Akt:76 ±6%，低劑組p-Akt:55 ± 3%;對比模型組P＜0.05);然而，EA并不能恢復oxLDL 造成的eNOS 表達下降，卻劑量依賴性的提高了p-eNOS 與eNOS 的比例，激活了eNOS(高劑組p-eNOS/eNOS:1.33 ±0.15，低劑組peNOS/eNOS:1.07 ±0.3;對比模型組0.82 ±0.05;P＜0.05);Wormannin 作為信號通路上游的PI3K 抑制劑造成p-Akt 的下調(diào)而對p-eNOS/eNOS 沒有太大的影響(PI3K 抑制組p-Akt:49 ±6%;PI3K 抑制組p-eNOS/eNOS:對比高劑組P＜0.05)。L-NAME作為eNOS 的直接抑制劑對蛋白表達并沒有明顯影響［17］。

2.2 討論

總結(jié)本研究的結(jié)果可以得到兩個主要發(fā)現(xiàn):首先是確定了刺囊酸確實具有獨立于降脂作用之外的抗AS 機制。之前的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)皂莢水提物(含80%的EA)能顯著降低高脂飼料喂養(yǎng)的家兔的血脂，包括甘油三酯及總膽固醇，另外也觀察到治療組斑塊面積的大幅度縮小，這證實EA 具有抗AS 能力，但這是否完全來自于其降血脂作用并未得到揭示［13］。其次，本研究證實了最初的設(shè)想，即EPCs 是EA 的作用靶點，而且EA 通過對PI3K/Akt/eNOS 信號通路的激活發(fā)揮保護EPCs 的作用，尤其是在高濃度oxLDL 存在的情況下。EPCs 在防止斑塊形成，改善AS 造成的組織缺血方面發(fā)揮出重要的作用［18］，但高脂血癥或糖尿病狀態(tài)下oxLDL 增加將損傷EPCs 的數(shù)量與功能，加速AS 的發(fā)病過程［19，20］。本研究通過體外模擬高oxLDL 環(huán)境所造成的EPCs損傷模型，證實了EA 對EPCs 的保護作用起碼是其抗AS 能力的機制之一。另外，本研究還證明PI3K/Akt/eNOS 信號通路在此過程中發(fā)揮重要作用，其中Akt 和eNOS 更是調(diào)節(jié)EPCs 存活與功能的關(guān)鍵分子［20-23］。因此，本研究特地考察了細胞中Akt 與eNOS 在oxLDL 環(huán)境中和加入EA 后的狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)oxLDL 抑制了這兩種蛋白的磷酸化激活，從而促進了EPCs 的凋亡和功能紊亂，而EA 雖然對Akt 與eNOS 的表達量沒有影響，但卻增加了磷酸化。藥理抑制組的結(jié)果也從側(cè)面印證了PI3K/Akt/eNOS 通路對于EA 發(fā)揮作用的重要性?？傊?，這些機制研究結(jié)果與細胞數(shù)量及功能的指標結(jié)果一致，表明了對于Akt 和eNOS 磷酸化的調(diào)節(jié)可能是EA 的主要作用機制。

本研究的結(jié)果還表明EA 的作用具有劑量依賴性，然而，預實驗卻表明劑量在20 μM 以上時這種依賴性變得并不明顯，而且更高劑量的EA (＞80 μM)甚至會誘導EPCs 的凋亡。因此，根據(jù)預實驗的結(jié)果，實驗設(shè)置了20 μM 和5 μM 的高、低劑量組。雖然包括EA 及齊墩果酸在內(nèi)的三萜酸具有細胞毒活性［24，25］，但在體內(nèi)試驗中，起碼在藥效劑量水平上卻未見明顯毒性反應，而且血清轉(zhuǎn)氨酶水平也遠低于阿托伐他汀對照組?？傊ㄟ^更為深入的藥效及毒理研究，刺囊酸有望成為新的抗缺血藥物或先導化合物。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，oxLDL 在體外誘導EPC 的凋亡，并且顯著降低細胞粘附、遷移和合成NO 的能力，考慮到EPC 在體內(nèi)發(fā)揮內(nèi)皮修復、血管發(fā)生等重要作用，oxLDL 對細胞數(shù)量及功能的損傷是其引起并加速動脈粥樣硬化形成的重要機制之一。刺囊酸能夠減輕oxLDL 對EPC 的損傷，包括抑制細胞凋亡，部分恢復細胞粘附、遷移、NO 合成等功能。本研究還探索了刺囊酸的作用機制，結(jié)果表明oxLDL抑制Akt 及eNOS 的磷酸化，而刺囊酸有效對抗了oxLDL 的作用，藥理對照組的結(jié)果證實了激活Akt/eNOS 通路的確是刺囊酸的主要作用機制。結(jié)合之前的體內(nèi)研究中，刺囊酸可能通過降血脂和維持EPC 數(shù)量及功能的方式發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。由于在較高劑量表現(xiàn)出的細胞毒的作用，刺囊酸作為藥物應用還需要更加深入的研究工作。

1 Asahara T，Masuda H，Takahashi T，et al.Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization.Cir Res，1999，85:221-228.

2 Zampetaki A，Kirton JP，Xu Q.Vascular repair by endothelial progenitor cells.Cardiovasc Res，2008，78:413-421.

3 Georgescu A.Vascular dysfunction in diabetes:The endothelial progenitor cells as new therapeutic strategy.World J Diabetes，2011，2:92-97.

4 Weis SM，Cheresh DA.Tumor angiogenesis:molecular pathways and therapeutic targets.Nat Med，2011，17:1359-1370.

5 Yang Y (楊彥)，Chen Q (陳慶偉).Endothelial progenitor cells:progress in cardiovascular disease.Adv Cardiovasc Dis(心血管病學進展)，2010，31:893-896.

6 Vasa M，F(xiàn)ichtlscherer S，Aicher A，et al.Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease.Circ Res，2001，89:e1-e7.

7 Tepper OM，Galiano RD，Capla JM，et al.Human endothelial progenitor cells from type II diabetics exhibit impaired proliferation，adhesion，and incorporation into vascular structures.Circulation，2002，106:2781-2786.

8 Tie G，Yan J，Yang Y，et al.Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis in endothelial progenitor cells by inactivating the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway.J Vasc Res，2010，47:519-530.

9 Hamed S，Brenner B，Roguin A.Nitric oxide:a key factor behind the dysfunctionality of endothelial progenitor cells in diabetes mellitus type-2.Cardiovasc Res，2011，91:9-15.

10 Stancu CS，Toma L，Sima AV.Dual role of lipoproteins in endothelial cell dysfunction in atherosclerosis.Cell Tissue Res，2012，349:433-446.

11 Wang JH (王薊花)，Tang J (唐靜)，Li D (李端)，et al.Chemical constituents and bioactivity of Gleditsia plants.Chin Wild Plant Res (中國野生植物資源)，2008，37:1-3.

12 Wu J，Li J，Zhu Z，et al.Protective effects of echinocystic acid isolated from Gleditsia sinensis Lam.against acute myocardial ischemia.Fitoterapia，2010，81:8-10.

13 Lai P，Du J，Zhang M，et al.Aqueous extract of Gleditsia sinensis Lam.fruits improves serum and liver lipid profiles and attenuates atherosclerosis in rabbits fed a high-fat diet.J Ethnopharmacol，2011，137:1061-1066.

14 Han L，Lai P，Du JR.Deciphering molecular mechanism underlying hypolipidemic activity of echinocystic Acid.Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014:1-8.

15 Kobayashi K，Imanishi T，Akasaka T.Endothelial progenitor cell differentiation and senescence in an angiotensin II-infusion rat model.Hypertension Res，2006，29:449-455.

16 Lefèvre J，Michaud Sé，Haddad P，et al.Moderate consumption of red wine (cabernet sauvignon)improves ischemia-induced neovascularization in ApoE-deficient mice:effect on endothelial progenitor cells and nitric oxide.FASEB J，2007，21:3845-3852.

17 Gao F，Gao E，Yue TL，et al.Nitric oxide mediates the antiapoptotic effect of insulin in myocardial ischemia-reperfusion the roles of PI3-kinase，Akt，and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation.Circulation，2002，105:1497-1502.

18 Zhou X (周曉峰)，Wang Z (王佐).The effects of endothelial progenitor cell in process of arteriosclerosis.Chin J Arterioscler (中國動脈硬化雜志)，2008，15:940-942.

19 Ma FX，Zhou B，Chen Z，et al.Oxidized low density lipoprotein impairs endothelial progenitor cells by regulation of endothelial nitric oxide synthase.J Lipid Res，2006，47:1227-1237.

20 Everaert BR，Van Craenenbroeck EM，Hoymans VY，et al.Current perspective of pathophysiological and interventional effects on endothelial progenitor cell biology:focus on PI3K/AKT/eNOS pathway.Int J Cardiol，2010，144:350-366.

21 Llevadot J，Murasawa S，Kureishi Y，et al.HMG-CoA reductase inhibitor mobilizes bone marrow--derived endothelial progenitor cells.J Clin Invest，2001，108:399-405.

22 Dimmeler S，Aicher A，Vasa M，et al.HMG-CoA reductase inhibitors (statins)increase endothelial progenitor cells via the PI 3-kinase/Akt pathway.J Clin Invest，2001，108:391-397.

23 Katusic ZS，Austin SA.Endothelial nitric oxide:protector of a healthy mind.Eur Heart J，2013，eht544.

24 Zhang PX(張鵬霞)，Li HM(李鴻梅)，Chen D (陳東)，et al.Effects of oleanolic acid on apoptosis and cell cycle of HL-60 cells in vitro.Chin J Pathophysiol (中國病理生理雜志)，2008，24:1908-1911.

25 Li HY(李宏楊)，Liu GM(劉國民)，Liu F (劉飛)，et al.Research of ursolic acid and similar pentacylic triterpenoid.J Hunan Univ Tech (湖南工業(yè)大學學報)，2009，23:18-22.