曾祖平，郭 智，彭 冰，沈勝楠，夏方博，劉亞旻，潘瑞樂(lè)*

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，北京100010;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193

山豆根為豆科槐屬植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep．的干燥根及根莖，主產(chǎn)于廣西、貴州、云南、廣東、江西等地，其味苦、性寒、有毒，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，主治火毒蘊(yùn)結(jié)、咽喉腫痛、齒齦腫痛等癥［1］。苦參為槐屬植物苦參Sophora flavescens Ait．的干燥根，全國(guó)各地均產(chǎn)，其味苦、性寒，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)利尿的功效，主治熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢、濕疹、濕瘡、皮膚瘙癢和疥癬麻風(fēng)等癥，外治滴蟲(chóng)性陰道炎［2］。兩者均為《中國(guó)藥典》收載的常用中藥?，F(xiàn)代研究表明山豆根和苦參都含有生物堿、黃酮和三萜類成分，生物堿是山豆根和苦參的主要成分，也是主要的活性成分，且二者所含的生物堿均屬于喹諾里西啶類生物堿(quinolizidine)。2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定山豆根和苦參質(zhì)量控制的定量指標(biāo)均為氧化苦參堿和苦參堿［1，2］。說(shuō)明生物堿在山豆根和苦參藥材中重要性。

本研究采用高靈敏度的UPLC/Q-TOF MSE技術(shù)建立山豆根和苦參中生物堿類成分的定性鑒別、相對(duì)定量和聚類分析方法。根據(jù)離子流色譜圖色譜峰的分子量及其二級(jí)質(zhì)譜碎片離子的裂解規(guī)律，結(jié)合參考文獻(xiàn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)推定，應(yīng)用主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法(OPLS-DA)進(jìn)行聚類分析，同時(shí)采用面積歸一法計(jì)算各色譜法的相對(duì)含量，以期尋找區(qū)分山豆根和苦參中生物堿的特征性成分，為兩者臨床療效差異的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

儀器:Acquity UPLC I-class超高效液相系統(tǒng)，Xervo G2 Q TOF質(zhì)譜系統(tǒng)，Acquity工作站，Masslynx 4．1工作站(沃特世，美國(guó))。Integral 3 Milli-Q超純水系統(tǒng)(默克密理博，美國(guó))，MS105 DU電子分析天平(梅特勒)，N1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化，日本)，KQ-250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，中國(guó))。

試劑:Optima LC/MS乙腈(賽默飛，美國(guó))，HPLC甲醇(賽默飛，美國(guó))。甲酸，甲酸銨(Sigma，美國(guó));氨水，氯仿(北京化工廠，中國(guó))。其他試劑均為分析純。

樣品:山豆根樣品分別采自其主產(chǎn)地廣西和云南，苦參樣品采自河南省、河北省。以上樣品各收集三批，并經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張本剛教授鑒定拉丁學(xué)名。

1．2 供試液的制備

取山豆根/苦參粉末(過(guò)40目篩)1．0 g精密稱定，置于50 mL具塞茄型瓶中，精密量取含1%氨水氯仿25 mL，密塞，搖勻，放置過(guò)夜。超聲提取30 min，過(guò)濾。殘?jiān)逑?次，合并濾液，回收溶劑，濃縮至干。殘?jiān)状既芙猓ㄈ萦?0 mL容量瓶，搖勻。溶液使用0．22μm微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液［3］。每個(gè)藥材平行制備3份供試品，保存于4℃冰箱備用。

1．3 儀器分析條件

1．3．1 UPLC 分析條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(2．1 mm ×150 mm，1．7 μm);保護(hù)柱:VanGuand BEH C18(2．1 mm×5 mm，1．7 μm)，流動(dòng)相:乙腈(A)，5 mmol/L 甲酸銨水溶液(B)［4］，梯度洗脫(0 ～ 10 min，3% ～20%A;10～12 min，20% ～100%A;12～13 min，100%A;13 ～13．01 min，100% ～3%A;13．01 ～15 min，3%A);流速:0．5 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;柱溫45℃。

1．3．2 Q-TOFMS 分析條件

正離子，MSE模式;檢測(cè)范圍100～1500 Da;毛細(xì)管電壓:3 kV，錐孔電壓:45 V，裂解電壓:40～50 V;錐孔氣流量:50 L/h;脫溶劑氣流量:800 L/h;源溫:100℃;脫溶劑氣溫度300℃;準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用 亮 氨 酸-腦 啡 肽 (Leucine-Enkephalin，m/z=556.2771)溶液作為質(zhì)量鎖定溶液。

1．4 數(shù)據(jù)分析

將供試品溶液1μL注入U(xiǎn)PLC/Q-TOF MSE分析，運(yùn)行時(shí)間為10 min。每個(gè)樣品平行進(jìn)樣3次。色譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用沃特世工作站MassLynx4．1軟件進(jìn)行處理。主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析采用沃特世工作站MarkerLynx XS軟件。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 山豆根和苦參生物堿總離子流色譜圖的指紋比較及主要成分的結(jié)構(gòu)鑒定

在上述色譜-質(zhì)譜條件下，山豆根和苦參供試液能得到較好分離，質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)良好。如圖1所示，從山豆根和苦參總生物堿離子流色譜圖可以直觀地看出，兩者生物堿成分指紋圖譜很相似，色譜圖中以最小峰面積為10進(jìn)行篩選，在山豆根色譜圖中可以看到19個(gè)色譜峰，在苦參色譜圖可以看到26個(gè)色譜圖，其中有11個(gè)主要的色譜峰相同。

根據(jù)山豆根和苦參總生物堿提取物總離子流色譜圖色譜峰的分子量及其二級(jí)質(zhì)譜碎片離子特征和裂解規(guī)律，結(jié)合參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，對(duì)總離子流色譜圖各個(gè)主要峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)推定，從山豆根中推定11個(gè)化合物，從苦參中推定12個(gè)化合物，其中有10個(gè)為二者共有結(jié)構(gòu)?；衔锉Ａ魰r(shí)間、名稱、分子式、分子量，在苦參和山豆根中相對(duì)峰面積及峰面積比值等信息見(jiàn)表1。在藥材質(zhì)量、色譜條件相同時(shí)，同一化合物峰面積的大小可以反映其含量的高低，從表1可以看出:山豆根和苦參的10個(gè)共有峰的峰面積比值有8個(gè)小于1，說(shuō)明苦參中生物堿的含量多數(shù)大于山豆根中的含量。

表1 山豆根和苦參總生物堿UPLC/Q-TOFMSE結(jié)構(gòu)鑒定表Table 1 Structural identification of alkaloids in Radix Sophorae Tonkinensis and Radix Sophorae Flavescens using UPLC/Q-TOFMSE

圖1 山豆根(右)和苦參(左)總生物堿離子流色譜指紋圖及主要化合物的指認(rèn)Fig.1 Total ion chromatograms of Radix Sophorae Tonkinensis(right)and Radix Sophorae Flavescens(left)

2．2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定的質(zhì)譜解析依據(jù)

化合物 B1、B2、B11分子離子峰(［M+H］+)m/z=281，參考文獻(xiàn)推定它們可能為二羥基苦參堿或者羥基苦參堿的氮氧化物，其一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜圖譜見(jiàn)表2。由三個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜可見(jiàn)均含有較高豐度的m/z=148、m/z=150的苦參堿型特征離子峰［5-7］，認(rèn)為均為苦參堿型生物堿。一級(jí)質(zhì)譜中，B2化合物的二倍峰離子(［2M+H］+)m/z=561豐度較高，這是氮氧化物的特征性離子峰［8］(氮氧化物生物堿一級(jí)質(zhì)譜中［2M+H］+峰豐度較高，羥基生物堿中［2M+H］+峰豐度很低，可以用來(lái)區(qū)別兩種生物堿類型)。結(jié)合文獻(xiàn)推定B2為氧化槐醇。B1一級(jí)質(zhì)譜中二倍峰離子豐度很低，推定為羥基生物堿，二級(jí)質(zhì)譜圖譜中有［M+H-H2O］+m/z=263，［M+H-2H2O］+m/z=245離子峰的存在，結(jié)合文獻(xiàn)推定B1為5α，9α-二羥基苦參堿。B11中一級(jí)質(zhì)譜中二倍峰離子豐度很低，推定為羥基生物堿，二級(jí)質(zhì)譜中［M+H-2H2O］+峰豐度很低，故推斷其容易失去一個(gè)羥基，另一個(gè)不易失去，可能為鄰羥基取代。

化合物B4、B7、B13的分子離子峰(［M+H］+)m/z=265，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推定它們可能為羥基化苦參堿或者苦參堿的氮氧化物。根據(jù)較高豐度的m/z=148、m/z=150的苦參堿型特征離子峰，認(rèn)為均為苦參堿型生物堿。一級(jí)質(zhì)譜中B7二倍峰離子(［2M+H］+)m/z=561豐度較高，結(jié)合文獻(xiàn)推定其為氧化苦參堿。B4，B13一級(jí)質(zhì)譜中二倍峰離子豐度很低，推定為羥基生物堿。結(jié)合文獻(xiàn)及保留時(shí)間規(guī)律，推定B13為槐醇，B4為14或13或9位羥基化苦參堿。

化合物 B5、B9的分子離子峰為(［M+H］+)m/z=249。根據(jù)較高豐度的 m/z=148、m/z=150的苦參堿型特征離子峰，認(rèn)為均為苦參堿型生物堿。兩圖譜中除了豐度差別外其他離子碎片相似，根據(jù)文獻(xiàn)和含量情況推斷B5為槐定堿，B9為苦參堿。根據(jù)文獻(xiàn)和結(jié)合保留時(shí)間，含量，分子量，推斷B6為N-甲基金雀花堿，B8為氧化槐果堿，B10為槐果堿。

表2 化合物一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 MS and MSE data of the detected alkaloids

2．3 MarkerLynx統(tǒng)計(jì)結(jié)果

采用沃特世組學(xué)工作站MarkerLynx XS軟件對(duì)山豆根和苦參提取物中的分子離子峰進(jìn)行PCA分析。然后通過(guò)OPLS-DA計(jì)算分析，經(jīng)S-Plot散點(diǎn)圖找出引起山豆根和苦參中顯著差異的化合物，并通過(guò)比較文獻(xiàn)推定其結(jié)構(gòu)。

2．3．1 主成分分析結(jié)果

山豆根和苦參生物堿部分質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)MarkerL-ynx分析得主成分分析圖(圖2)。由主成分分析圖可見(jiàn)，山豆根和苦參兩組樣品組內(nèi)聚集、組間分離良好。

圖2 山豆根與苦參生物堿部分正離子模式下主成分分析圖Fig.2 PCA plot of alkaloids in Radix Sophorae Tonkinensis and Radix Sophorae Flavescens

2．3．2 正交偏最小二乘法分析結(jié)果

主成分分析結(jié)果經(jīng)OPLS-DA計(jì)算分析，繪制化合物的S-plot圖(圖3)。圖中散點(diǎn)縱坐標(biāo)絕對(duì)值越大可信度越大，橫坐標(biāo)絕對(duì)值越大特征性越強(qiáng)。其中一象限代表苦參，三象限代表山豆根。各化合物散點(diǎn)按照S型排列，位于S兩端的點(diǎn)代表引起山豆根和苦參化學(xué)成分差異貢獻(xiàn)大且可信度高的成分。經(jīng)鑒定在山豆根中貢獻(xiàn)大的化合物有:苦參堿、氧化槐醇、槐醇羥基取代物、氧化苦參堿;苦參中貢獻(xiàn)大的化合物有:氧化槐果堿、槐定堿、N-甲基金雀花堿、槐果堿。

圖3 山豆根與苦參生物堿正離子模式下正交偏最小二乘法S-plot圖Fig.3 OPLSS-plot diagram of alkaloids in Radix Sophorae Tonkinensis and Radix Sophorae Flavescens

3 討論

為了能準(zhǔn)確地反映山豆根和苦參化學(xué)成分的差異，我們從山豆根主產(chǎn)地廣西和云南，苦參的主產(chǎn)地河北省、河南省等各收集三批樣品，通過(guò)比較其生藥的形態(tài)特征，并結(jié)合UPLC-PDA色譜指紋圖譜(數(shù)據(jù)未給出)，選擇山豆根和苦參的代表性樣品進(jìn)行UPLC/Q-TOFMSE研究。

本文的質(zhì)譜條件參考文獻(xiàn)［8］方法，但色譜條件進(jìn)行了大量的摸索，選擇了不同的色譜柱(T3柱，BEH柱)，不同的流動(dòng)相(甲醇，乙腈)，不同的緩沖鹽(乙二胺，乙酸銨，甲酸銨)和不同的梯度條件等，最終確定了本文的分析方法，幾種主要的生物堿類化合物得到較好的分離。

通過(guò)山豆根和苦參生物堿總離子流色譜圖比較，可以看出山豆根和苦參生物堿類成分的指紋很相似，但苦參中生物堿種類較多，相對(duì)含量較高。根據(jù)兩者生物堿成分結(jié)構(gòu)的推定和相對(duì)含量的比較，發(fā)現(xiàn)兩者主成分均為B1-5α，9α-二羥基苦參堿、B7-氧化苦參堿、B8-氧化槐果堿、B9-苦參堿等。

主成分分析結(jié)果表明山豆根和苦參兩組樣品組內(nèi)聚集、組間分離良好;經(jīng)OPLS-DA計(jì)算分析，繪制的S-plot圖可以看出，苦參堿、氧化槐醇、槐醇的羥基取代物和氧化苦參堿是山豆根區(qū)別于苦參的置信度高的主要生物堿成分;而氧化槐果堿、槐定堿、N-甲基金雀花堿和槐果堿是苦參區(qū)別于山豆根置信度高的主要的生物堿成分。

通過(guò)離子流指紋圖譜、化合物相對(duì)含量及化合物分布分析，苦參和山豆根的主要差異性成分在兩者均有檢出，可見(jiàn)造成兩者差異的主要原因不是生物堿的類別，而主要是生物堿的含量。本研究結(jié)果表明引起山豆根和苦參的臨床療效的差異，可能是生物堿含量的差異，也可能是生物堿以外的其它成分。因此，對(duì)山豆根和苦參非生物堿部分的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究是非常有必要的。

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