蔡龔莉，方 帥，張起輝

重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系，重慶 400044

蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb.ex Murray)Trev，又名千層塔、蛇足草、寶塔草、千金蟲，民間主要用于治療跌打損傷、瘀血腫痛、內(nèi)傷出血、腫癰疔毒、毒蟲叮咬、燒傷燙傷等癥［1］，其在世界范圍內(nèi)均有散在分布，資源有限，且近年來，隨著研究的不斷深入，人們加強(qiáng)了對其的開發(fā)和利用，因此其種群遭到了嚴(yán)重的破壞，野生資源將無法滿足醫(yī)療需求［2］。吳葒［3］等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國的蛇足石杉資源系散在分布，且多位于自然保護(hù)區(qū)和風(fēng)景區(qū)范圍內(nèi)，不宜規(guī)?；烧?。因此，欲解決藥源的問題，唯有尋求更加科學(xué)的，更加合理的方法。蛇足石杉因具有顯著的藥用價值而備受關(guān)注，各國研發(fā)人員對其進(jìn)行了深入而廣泛的研究。其主要成分石杉堿甲是強(qiáng)效的膽堿酯酶抑制劑，臨床試驗(yàn)已證實(shí)石杉堿甲對治療重癥肌無力和阿爾茨海默病具有很好的療效，且其制劑——哈伯因已在國內(nèi)上市，主要用于治療老年人記憶減退和早年癡呆等。

本文將對蛇足石杉的相關(guān)研究內(nèi)容進(jìn)行綜述，邏輯順序?yàn)?有效成分——藥理活性——分析和分離方法——組培方法，希望借此為其可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 蛇足石杉中的有效成分

19 世紀(jì)中期，人們開始對蛇足石杉中的化學(xué)成分進(jìn)行研究，其主要化學(xué)成分為生物堿類、三萜類和黃酮類等。其中生物堿類成分又以石松生物堿為主，且骨架均是由C16N 或C16N2組成的三環(huán)或四環(huán)結(jié)構(gòu)，按照Ayer［4］的研究結(jié)果又可將其劃分成lycopodine、lycodine、fawcettimine 和miscellaneous 等四種類型。

馬小軍［5］老師課題組已對2007 年以前報道的蛇足石杉化學(xué)成分研究進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，因此，本文將在此基礎(chǔ)上，對2007～2014 年間蛇足石杉的國內(nèi)外研究成果進(jìn)行概述。

1.1 石松生物堿類

1.1.1 Lycopodine 型石松生物堿

2007～2014 年間，新發(fā)現(xiàn)10 個Lycopodine 型石松生物堿［6-9］，按結(jié)構(gòu)特征又可劃分為五種母核，詳見圖1 和表1。

圖1 蛇足石杉中的Lycopodine 型石松生物堿母核Fig.1 Skeleton of Lycopodine-type lycopodium alkaloids from H.serrata

表1 蛇足石杉中的Lycopodine 型石松生物堿Table 1 Lycopodine-type lycopodium alkaloids from H.serrata

1.1.2 Fawcettimine 型石松生物堿

2007～2014 年間，新發(fā)現(xiàn)Fawcettimine 型石松生物堿18 個［10-12］，按其結(jié)構(gòu)特征分為以下6 種母核，有關(guān)物質(zhì)見圖2 和表2。

圖2 蛇足石杉中的Fawcettimine 型石松生物堿的母核Fig.2 Skeleton of Fawcettimine-type lycopodium alkaloids from H.serrata

表2 蛇足石杉中的Fawcettimine 型石松生物堿Table 2 Fawcettimine-type lycopodium alkaloids from H.serrata

1.1.3 Miscellaneous 型石松生物堿

Gao 等2008 年在蛇足石杉中發(fā)現(xiàn)兩個生物堿Huperzine M 和Huperzine N［13］;Kubota 等2009 年在長柄蛇足石杉中發(fā)現(xiàn)兩種石松生物堿Serratezomines D 和Serratezomines E［14］;此外Katakawa 等2009年在長柄蛇足石杉中發(fā)現(xiàn)一種具有新的骨架的生物堿Lycoposerramine R［11］，結(jié)構(gòu)分別如圖3。

圖3 蛇足石杉中的miscellaneous 型石松生物堿Fig.3 Miscellaneous-type lycopodium alkaloids from H.serrata

1.1.4 其它成分

楊亞濱等從蛇足石杉中分離到2 個二萜類成分和一個黃酮糖苷類成分，分別是3β-Hydroxysandaracopimaric acid (I)，(15R)-12，16-epoxy-11，14-dihydroxy-8，11，13-abietatrien-7-one (II)，5，5＇-dihydroxy-2＇，4＇-dimethoxy-flavone-7-O-β-D-(6＇＇-O-Z-p coumaroyl)-glucopyranoside (III)［15，16］，結(jié)構(gòu)如圖4。

圖4 蛇足石杉中的黃酮類和二萜類Fig.4 Diterpenoid and flavone glycoside from H.serrata

2 生物堿類成分的藥理學(xué)研究

迄今為止已從蛇足石杉中分離并鑒定了超過90 種生物堿類成分，和超過30 種的三萜類成分［5］，本文著重對其活性成分——生物堿的藥理作用進(jìn)行了綜述。

石杉堿甲(Hup A)作為代表性成分，主要有抑制腦內(nèi)AchE 的活性、加快氧自由基的清除、減少自由基損傷、加強(qiáng)肌肉收縮、保護(hù)神經(jīng)、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶、改善記憶功能障礙和鎮(zhèn)痛等作用［17］。成敬［18］等對分別用生理鹽水和石杉堿甲灌胃的老鼠進(jìn)行電擊實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)石杉堿甲可減輕電休克模型中老鼠的記憶損害。以小鼠、大鼠、兔子和狗進(jìn)行石杉堿甲的毒理學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Hup A 由于選擇性較高，因此，相對于加蘭他敏和他克林等同類藥物，其不良反應(yīng)較少，且癥狀較輕［19］。

隨著近年研究的不斷深入，Hup A 作為一種高效高選擇性的中樞乙酰膽堿酯酶抑制劑，不僅有調(diào)控神經(jīng)生長因子的表達(dá)與分泌、抗谷氨酸受體的作用，還可以通過對抗谷氨酸引發(fā)的興奮毒性、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化等多條途徑保護(hù)細(xì)胞，對多種神經(jīng)退行性疾病有潛在的治療作用［20］。

Hup A 在軍事方面也有一定的應(yīng)用，張瑞華［21］等發(fā)現(xiàn)Hup A 聯(lián)合苯二氮卓類藥物可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成很強(qiáng)的保護(hù)體系，在預(yù)防NA 中毒時有較高的應(yīng)用價值。

蛇足石杉中的其它生物堿類成分也體現(xiàn)了較強(qiáng)的活性，如lycojapodine A、lycoperine A、cryptadines A、cryptadines B、carinatumins A、carinatumins B 和sauroine 等都具有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性;Lycojapodine A 具有較好的抗艾滋病毒活性;Lycovatine A、complanadines C 和D 等體現(xiàn)了一定的抗菌活性;lyconadins A 和B、annotinidines B-F、complanadine D 等具有促進(jìn)mRNA 過表達(dá)的作用;Nankakurine A 可促進(jìn)PC-12 細(xì)胞的分化;Huprie X、Huprie Y 和6-β-羥基Hup A 的乙酰膽堿酯酶抑制活性優(yōu)于Hup A［19，22-25］。

3 有效成分的分析和分離方法

3.1 石杉堿甲的分析方法

3.1.1 紫外分光光度及薄層檢測法

Hup A 具有特殊的空間環(huán)和酰氨基，與一般生物堿不同，用酸性乙醇-FeCl3染色呈黃綠色，利用此性質(zhì)可以進(jìn)行紫外掃描測定其含量。一般選擇311 nm 左右的波長進(jìn)行紫外分析檢測［26］。紫外分光光度法測定蛇足石杉中總生物堿含量方法簡便、穩(wěn)定性好。

周漢華［27］等采用硅膠G 薄層板薄層掃描法分析了貴州產(chǎn)皺邊石杉中Hup A 的含量，以氯仿—甲醇—氨水為展開劑，高錳酸鉀水溶液為顯色劑，測得Hup A 含量為0.1324 mg/g，該方法可以用于Hup A的含量測定。

3.1.2 高效液相色譜(HPLC)

蛇足石杉中石杉堿甲含量測定一般采取HPLC，該方法簡單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。王峻［28］等利用HPLC 測定了石杉屬和馬尾杉屬總共23 種擬蕨類原植物中的Hup A 含量，發(fā)現(xiàn)伏帖石杉中Hup A的含量最高，為0.2004%。杜次［29］等利用HPLC 測定湘西蛇足石杉植株中不同部位的石杉堿甲含量，發(fā)現(xiàn)有顯著差異，并且通過對蛇足石杉根、莖、葉中的賴氨酸脫羧酶基因(LDC)進(jìn)行半定量RT-PCT 分析推測出賴氨酸脫羧酶在石杉堿甲的生物合成中不起關(guān)鍵作用。張敬彩［30］等用X-Charge C18柱，采用0.1%三氟乙酸和含0.09%三氟乙酸的乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫，在短時間內(nèi)完成了Hup A 的快速分析。

3.1.3 毛細(xì)管電泳色譜(CE)

CE 技術(shù)，因其超微量進(jìn)樣、分離效率高、廢液少、分析快，特別是無需考慮復(fù)雜組分對價格昂貴的色譜柱引起污染的特點(diǎn)，越來越受到藥物研究工作者的重視。余宇燕［31］等用毛細(xì)管電泳法測定了石杉堿甲片樣品中Hup A 的濃度，電解質(zhì)溶液為pH為4.6 的乙酸鹽溶液，在波長310 nm 處進(jìn)行紫外檢測，得出樣品中Hup A 的質(zhì)量濃度與峰面積的線性范圍為5.0～60.0 mg/L。

3.1.4 酶聯(lián)免疫法檢測(ELISA)

鄒艷輝［32］等取自制純化后人工抗原Hup ABSA 免疫Balb/c 純種雌性小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選后得到雜交瘤細(xì)胞，取腹水進(jìn)行間接競爭ELISA 檢測效價后選擇OD450值接近1.0 的抗體稀釋倍數(shù)作為ELISA 工作條件，IC10最低的單克隆抗體作為最佳抗體，建立ELISA 檢測方法，該測定方法快速而且靈敏。

3.2 蛇足石杉中有效成分的提取方法

3.2.1 常規(guī)提取法

許慧［26］等用酒石酸、鹽酸、磷酸、檸檬酸、醋酸5 種酸水溶液冷浸樣品20 h 之后分析發(fā)現(xiàn)5 種方法的回收率無明顯差異。通過比較甲醇熱回流、1.0%鹽酸冷浸、超聲、滲漏4 種制備Hup A 的方法，發(fā)現(xiàn)甲醇熱回流和超聲的回收率較冷浸和滲漏高，但純度較低。同時，發(fā)現(xiàn)1∶30 為提取石杉堿甲的最佳料液比。

3.2.2 超聲波輔助提取法

Hup A 的含量通常含量低于0.01%，因此對該有效成分的提取分離方法的探尋從未停止。黎萬奎［33］等以1∶20 料液比酸水提取并超聲40 min 的提取工藝，改善了蛇足石杉內(nèi)生真菌2F09P03B 發(fā)酵培養(yǎng)物中Hup A 的提取率。該條件下內(nèi)生真菌石杉堿甲提取率約為其他傳統(tǒng)提取方法的1.5～2 倍。黃暉［34］等對傳統(tǒng)的提取工藝進(jìn)行了綜合的分析和優(yōu)化，經(jīng)比較確定最佳提取方法是超聲輔助的酸液浸提工藝，該工藝操作簡捷，安全性高。

3.2.3 索氏提取法

黃暉［34］等將長柄石杉粉末(40 目，約3 g)置于索氏提取器中，加乙醇回流提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得浸膏，過濾，調(diào)節(jié)pH 后萃取至Dragendorffor’s 反應(yīng)呈陰性，濃縮萃取液得產(chǎn)品。結(jié)果顯示乙醇濃度較回流時間、回流次數(shù)的影響更為顯著。

3.2.4 酶提法

易學(xué)文［35］等開發(fā)了酶提法工藝，用纖維素酶酶解細(xì)胞壁，用正交試驗(yàn)確定提取工藝。蛇足石杉中Hup A 的提取率為0.589‰，該方法的提取率比普通酸提法提高了40.3%。但提取液中含有較多淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，為分離造成了一定的困難。

3.2.5 殼聚糖絮凝澄清法

李俊［36］等開發(fā)了殼聚糖澄清石杉堿甲的提取工藝，用正交試驗(yàn)法優(yōu)選出最佳工藝條件，該條件下蛇足石杉提取液的透光率達(dá)81.6%。此法可減少上柱前雜質(zhì)，提高產(chǎn)品純度。

3.2.6 萃取和反萃取相結(jié)合法

曾漢元［37］等使用萃取和反萃取相結(jié)合的方法，通過利用變換pH 的辦法獲得很好的除雜效果，從而達(dá)到去雜濃縮富集石杉堿甲的目的。

3.2.7 石杉堿甲印跡聚合物吸附法

李志平［38］等首次將硅膠作為載體，甲基丙烯酸作為功能載體，偶氮二異丁腈作為引發(fā)劑，二乙烯基苯作為交聯(lián)劑制備了石杉堿甲分子印跡聚合物，研究該聚合物的結(jié)構(gòu)特征和識別能效。當(dāng)用該聚合物微固相萃取蛇足石杉提取液時，Hup A 的回收率為93.5%，富集效果較好。

3.2.8 超臨界流體萃取(SFE)

李俊［39］等通過對夾帶劑種類及用量等方面的研究，使用95%的乙醇為夾帶劑，并把原料用氨水堿化預(yù)處理，得到最佳萃取條件，用超臨界萃取法提取Hup A，發(fā)現(xiàn)其提取率可達(dá)11.44%。

3.3 石杉堿甲的分離制備方法

3.3.1 活性炭脫色

沈生榮［40］等利用Hup A 存在形態(tài)受pH 影響的性質(zhì)，同時使用活性炭脫色的方法，然后在適當(dāng)?shù)蜏叵?約5 ℃)進(jìn)行氯仿的重結(jié)晶，可得到純度大于99%的高純度石杉堿甲。

3.3.2 制備型高效液相色譜

目前在實(shí)驗(yàn)室中一般是選擇溶劑萃取、硅膠柱層析等分離方法從蛇足石杉提取液中分離出較高純度的Hup A，但制備量小、耗時多、溶劑耗費(fèi)量大、污染大且難以規(guī)?；a(chǎn)。而工業(yè)生產(chǎn)需要更合適的工藝使其在純度和產(chǎn)量上達(dá)到最佳平衡。為了解決這個問題，趙新燕［41］采用制備型高效液相色譜分離了Hup A，此法分離工藝簡單，所得Hup A 質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高(95%以上)，該方法為利用制備型HPLC 工業(yè)化生產(chǎn)石杉堿甲提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.3.3 常壓正相柱色譜

徐朝暉［42］等采用堿性氧化鋁柱和硅膠柱組合的方法對Hup A 進(jìn)行分離純化，此工藝下總回收率達(dá)76.1%。李玉山［43］則改進(jìn)了柱色譜法，以中性氧化鋁為填料，在優(yōu)選的最佳條件下Hup A 回收率達(dá)97.6%。該工藝條件簡單，且產(chǎn)品有很高純度，在工業(yè)上具有很大的應(yīng)用價值。

3.3.4 陽離子交換樹脂

李?。?4］等分別用5 種離子交換樹脂研究其對Hup A 的吸附量和解吸率。通過條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)用C004 陽離子交換樹脂制備的Hup A 含量可達(dá)5%，效果最好。

3.3.5 高速逆流色譜(HSCCC)

樊希望［45］將高速逆流色譜中的流動相和固定相的組成進(jìn)行優(yōu)化，采取的溶劑體系為正己烷-正丁醇-甲醇-水，體積比為1∶3∶2∶6，對蛇足石杉粗提物進(jìn)行分離，建立了新的純化工藝。

4 與蛇足石杉相關(guān)的微生物學(xué)研究

蛇足石杉植株生長緩慢，且配子體和孢子體階段均需要與土壤中的特定真菌共生，形成菌根才能生長，同時內(nèi)生真菌的存在使得蛇足石杉的組織培養(yǎng)較為困難，滅菌相對容易的孢子又難以萌發(fā)［46］。為了應(yīng)對藥源緊缺的問題，相關(guān)學(xué)者對蛇足石杉的內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究性探索。由于真菌長期與植物共生，基于生物模擬等效應(yīng)，真菌中的酶系開始發(fā)生轉(zhuǎn)變，因此在內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物中也會發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)的許多有效成分，內(nèi)生真菌的研究將有利于解決珍稀藥用植物的資源問題。

此前已有眾多研究者已分離到可以產(chǎn)生石杉堿甲的真菌，如汪涯［47，48］運(yùn)用平板分離法分離出127株內(nèi)生真菌，有39 株內(nèi)生真菌顯示出了乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中11 株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，又從葉中分離到1 株內(nèi)生真菌LF40，在PDB 培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，提取液中石杉堿甲的含量達(dá)80.1 μg/gdcw;蘇經(jīng)遷［49］等篩選出8 株產(chǎn)生物堿的真菌，其中有1 株炭角菌SY-02 能夠產(chǎn)生石杉堿甲;閔長莉［50］等從蛇足石杉的莖葉中分離純化得到15 株內(nèi)生真菌，其中鐮刀菌屬菌株WX13 產(chǎn)石杉堿甲;鞠鏨［51］研究了4 種石杉科植物——蛇足石杉、長柄石杉、伏貼石杉、柳杉葉馬尾杉，總共得到的32 株內(nèi)生真菌中，從柳杉葉馬尾杉中得到的2 株內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生石杉堿甲;延安大學(xué)生科院楊曉軍［52］等自蛇足石杉的莖部分離到1 種交鏈孢霉屬真菌YD-01，對該菌株進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)，并從中分離得到石杉堿甲。

此外，還有許多內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生石杉堿甲，能夠可逆性抑制抗膽堿酯酶，如膠胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioide、Colletotrichum gloeosporioides ES026、Shiraia sp.Slf14［53-55］，這些研究可能會為尋找治療阿爾茲海默病的藥源提供新的方向。

隨著研究的不斷深入，從產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌出發(fā)，研究者正在嘗試采用基因工程學(xué)方法，對這些真菌進(jìn)行生物學(xué)改造，如:胥錦樺［56］也對內(nèi)生真菌做了大量的研究:首先用TLC、HPLC 等方法對皺邊石杉體內(nèi)99 株真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，用多種方法提取了真菌菌絲體DNA，最終篩選出19 株可產(chǎn)Hup A 潛力內(nèi)生菌并加以分類鑒定，這為后續(xù)的研究提供了大量寶貴的資料;周樹良［57］用多種方法對能合成石杉堿甲的內(nèi)生真菌SHB 進(jìn)行誘變，最終成功地得到穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)菌株wB3，其石杉堿甲產(chǎn)量為原菌株的3.04 倍，并探究得到了其發(fā)酵的最佳條件，此時再提取突變菌株的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分析發(fā)現(xiàn)了其與原始菌株之間的明顯差異特征帶，為利用相關(guān)功能基因生產(chǎn)石杉堿甲找到了一個切入點(diǎn);而羅紅梅［58］等探究了蛇足石杉HsDXR1 基因在體內(nèi)不同部位的表達(dá)情況及其編碼區(qū)序列，是研究石杉堿甲生物合成的理論奠基。

5 蛇足石杉的組織培養(yǎng)研究

由于石杉堿甲在蛇足石杉中含量極低且資源日益減少，人工栽培難以成活且生長速度極其緩慢，人們便轉(zhuǎn)向探索組織培養(yǎng)，以獲取石杉堿甲。然而蛇足石杉體內(nèi)存在著內(nèi)生真菌，故在組織培養(yǎng)中，需3～4 次滅菌才能將真菌除凈。對外植體進(jìn)行滅菌主要用次氯酸鈉或升汞溶液，而所用的培養(yǎng)基多為MS培養(yǎng)基;在培養(yǎng)過程中，除了真菌反復(fù)污染外，外植體褐化、白化、水漬化等現(xiàn)象較為多見。

5.1 培養(yǎng)基及外源物質(zhì)的選擇

在蛇足石杉的組織培養(yǎng)中，研究者探究了各種不同培養(yǎng)基對其愈傷組織形成的影響，以找出最適方法擴(kuò)大蛇足石杉的生產(chǎn)，如孫玉強(qiáng)［59］等經(jīng)初培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，在SN6(2，4-D 2.0 mg/mL)上培養(yǎng)70～80 d 后誘導(dǎo)出愈傷組織塊;包日雙［60］等用蛇足石杉孢子囊培養(yǎng)出原葉體，進(jìn)而在最佳增殖培養(yǎng)基(無激素的MS 培養(yǎng)基)上誘導(dǎo)出孢子體;Freiburg 大學(xué)的學(xué)者［61］對粗糙馬尾杉進(jìn)行了成功的試管繁殖，使石杉科植物的組培看到了希望;最近，吉枝單［62，63］等探究培養(yǎng)基種類、植物激素配比及蔗糖含量等條件，發(fā)現(xiàn)最佳葉狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為6，7-V +IAA0.5 mg/L，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)外源激素不利于蛇足石杉離體葉狀體的增殖，蔗糖最佳用量為20 g/L，在此條件下于MS 培養(yǎng)基中培育出了生長狀況良好的葉狀體，且增殖率達(dá)到了1362.6%，該方法首次獲得了蛇足石杉再生葉狀體，使工業(yè)批量生產(chǎn)蛇足石杉向前邁進(jìn)了一步。

5.2 外植體取材部位及滅菌方法

外植體滅菌的成功率與取材部位有必然的聯(lián)系，較幼嫩的部位含菌較少成活率高，如沈曉霞［64］等分別用1/5 倍飽和次氯酸鈉滅菌15 min，0.1%升汞滅菌3 min，收到了很好的結(jié)果;馬華升［65］等用0.1%(w/v)升汞，處理莖尖外植體5～6 min 進(jìn)行消毒滅菌。

也有實(shí)驗(yàn)對植物不同部位(莖尖、莖部、葉片、側(cè)葉、腋芽、孢子囊等)取材，發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉并不適合千層塔外植體滅菌處理。利用升汞進(jìn)行莖尖消毒滅菌時，要求莖尖是新生的0.5～1 mm 左右、維管組織還沒有到達(dá)的部位。孢子囊可以用次氯酸鈉滅菌5 min 或升汞滅菌2～3 min，以解決染菌問題。

楊雪飛［66］等發(fā)現(xiàn)外植體的最佳滅菌方法為70%乙醇滅菌40 s，0.1%升汞溶液滅菌8 min，70%雙氧水溶液滅菌10 min。另外，李貴［67］等發(fā)現(xiàn)，消毒劑結(jié)合溫度處理是消除內(nèi)生茵的良好方法，用于組培的理想外植體是含內(nèi)生菌極少的孢子囊和莖尖。

6 石杉堿甲的臨床應(yīng)用研究

石杉堿甲是一種強(qiáng)效的可逆性膽堿酯酶抑制藥，具有脂溶性高，易通過血-腦屏障等特點(diǎn)，對真性膽堿酯酶有選擇性抑制作用。最早于1994 年被應(yīng)用于臨床，臨床可用于治療阿爾茨海默病、血管性癡呆、重癥肌無力、小兒智力發(fā)育遲緩、早老性癡呆、記憶障礙、慢性失眠癥等，具有改善記憶的功能。另外還可預(yù)防和治療多梗死性癡呆、輔助治療精神分裂癥的陰性癥狀以及治療腦卒中后的尿失禁等［68，69］。

近年來，為了避免石杉堿甲的毒副作用，聯(lián)合用藥已成為臨床用藥的一種新趨勢，例如:石杉堿甲聯(lián)合天智顆粒治療血管性癡呆時，體現(xiàn)了療效顯著，安全無毒的特點(diǎn)［70］;石杉堿甲片和尼莫地平聯(lián)合治療腦血管性癡呆，可顯著改善患者的認(rèn)知能力，臨床效果確切安全，副作用少［71］。

7 結(jié)語

隨著社會老齡化程度的加劇，AD 癥已成為危害老年人健康的主要疾病之一，同時社會壓力的擴(kuò)散使中、青年群體對益智產(chǎn)品的需求不斷增大，因此對石杉堿甲的需求也隨之增大，這加劇了自然資源的耗竭，會造成資源破壞和種群退化等問題。據(jù)報道，全國蛇足石杉資源量為1 ×106kg，主產(chǎn)地廣西在1990 年時蘊(yùn)藏量為1.77 ×105kg，目前已下降至2 ×104kg。千層塔植株矮小，生長緩慢，野生資源有限，人工繁殖困難，組培未獲成功，扦插成活率很低，資源恢復(fù)期長達(dá)15 年。而國內(nèi)制藥企業(yè)生產(chǎn)石杉堿甲制劑存在較大缺口，難以滿足國內(nèi)外市場需求(目前僅美國年需求就達(dá)100 kg)，因此，開發(fā)新技術(shù)解決千層塔可持續(xù)利用問題迫在眉睫。本文較為系統(tǒng)的總結(jié)了蛇足石杉的活性成分、藥理活性、分析方法和組培等研究內(nèi)容，希望為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，提供素材。

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