王曉博 ，杜 陽，謝耀光，高明川，李海蘭，王 波，姜 濤*

1大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系;2 大連醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，大連 116044

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是綠茶中的主要成分，是茶多酚中含量最多的單體物質(zhì)。EGCG 是特定的黃烷醇類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。細(xì)胞內(nèi)超氧化物(，H2O2等)在代謝過程中堆積過多，不能及時清除是細(xì)胞衰老機(jī)制之一［1-3］。EGCG 是否可以通過它的抗氧化活性來抑制機(jī)體衰老過程，這是本研究需要探討的問題。另外，細(xì)胞衰老與體內(nèi)衰老相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)，其中包括炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB (nuclear factor kappaB，NF-κB)［4，5］。NF-κB 是一種具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì)，其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切［6，7］，但最近研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 的激活與細(xì)胞衰老也密切相關(guān)。2013 年，發(fā)表在Nature 上的一篇文章表明:隨著小鼠的衰老，下丘腦區(qū)域的NF-κB 逐漸被激活，證實了衰老與NF-κB 信號途徑的相關(guān)性［8］。本研究擬通過分析EGCG 的抗衰老作用以及對衰老小鼠腦組織NF-κB 及相關(guān)分子的表達(dá)的影響，確定EGCG 與炎癥相關(guān)信號通路之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究EGCG 復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

3～4 月齡清潔級雄性昆明小鼠20 只，體重50±10 g，由大連醫(yī)科大學(xué)SPF 實驗動物中心提供。隨機(jī)分為2 組，模型組和對照組。其中模型組15只，按照50 mg/(kg·d)頸背部皮下注射5%D-半乳糖生理鹽水溶液，對照組5 只小鼠，按照1 mL/(kg·d)頸背部皮下注射生理鹽水溶液，連續(xù)注射9 w。建模成功后，將模型組小鼠隨機(jī)分為二組，衰老組和EGCG 處理組。衰老組5 只，按照1 mL/(kg·d)頸背部皮下注射生理鹽水;EGCG 處理組10 只，以1 mg/(kg·d)皮下注射EGCG 生理鹽水溶液，連續(xù)注射5 w;另領(lǐng)取3～4 月齡清潔級雄性昆明小鼠5 只設(shè)為年輕組。因此，最后利用年輕組小鼠5 只、衰老組小鼠5 只以及EGCG 處理組小鼠10 只進(jìn)行研究。

1.2 主要試劑

EGCG(純度99.5%)購自浙江乾盛康藥業(yè)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(批號:20101109)系南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒為碧云天生物試劑公司產(chǎn)品，抗鼠β-actin 抗體，抗鼠NF-κB-P65，抗鼠IκBα(Y42)抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG 購自巴傲德生物科技公司。

1.3 行為學(xué)實驗

模型組小鼠和對照組小鼠每10 d 進(jìn)行體重監(jiān)測;并在第9 w 對小鼠進(jìn)行記憶能力訓(xùn)練和檢測。在設(shè)定的迷宮中對兩組小鼠進(jìn)行為期5 d，每天10次的訓(xùn)練，記錄50 次中的正確次數(shù)。記憶能力測試主要根據(jù)逃避到安全區(qū)的時間賦分，直接逃避到安全區(qū)給予2 分，受擊后再進(jìn)行逃避給予1 分，否則為0 分，以總分作為記憶成績［9］。

1.4 小鼠外周血SOD 活性檢測

采用斷尾取血的方法收集各組小鼠外周血，3500 rpm 離心10 min，收集血清。利用SOD 活性檢測試劑盒，在酶標(biāo)儀的589 nm 波長下檢測后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.5 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的SA-β-Gal 活性分析

當(dāng)EGCG 處理模型組小鼠4 w 時，利用10%水合氯醛腹腔注射分別麻醉年輕組、衰老組以及EGCG 處理組小鼠各1 只，斷頭取出腦組織后立即投入4%多聚甲醛固定液中固定24 h，進(jìn)行冰凍切片，利用SA-β-Gal 染色試劑盒對病理切片進(jìn)行洗脫、固定、染色、脫色、封片處理，最后在高倍顯微鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元染色比率。

1.6 小鼠腦組織NF-κB 和IκBα 蛋白表達(dá)變化分析

EGCG 處理模型組小鼠5 w 后，分別取年輕組(n=4)、衰老組(n=4)以及EGCG 處理組(n=8)小鼠腦組織50 mg 于液氮研磨后置于EP 管中，加入蛋白裂解液200 μL 于4 ℃裂解30 min，同時每10 min 震蕩一次，每次30 s，4 ℃，12000 rpm 離心10 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)G250 對蛋白進(jìn)行定量后進(jìn)行Western blotting 分析，以β-actin 為內(nèi)參照檢測NF-κB-P65 和IκBα(Y42)蛋白表達(dá)變化情況。

2 實驗結(jié)果

2.1 模型組小鼠的行為學(xué)變化及外周血SOD 活性測定

研究結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠30 d后體重增長緩慢(表1，圖1)，且毛發(fā)較年輕組黃，進(jìn)食量減少。與對照組相比，模型組小鼠正確逃避反應(yīng)能力遲緩，正確次數(shù)明顯減少，記憶評分較低，均具有顯著性差異;模型組小鼠外周血中，SOD 活性也顯著性降低(表2)。

表1 D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老過程中的體重變化Table 1 The changes of weight for the mice treated by d-gal compared to control mice

圖1 D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老過程中的體重變化趨勢圖Fig.1 The tendency of weight changes of mice during d-gal treatment

2.2 EGCG 的抗衰老作用研究

當(dāng)EGCG 處理衰老模型小鼠4 w 時，進(jìn)行小鼠外周血SOD 活性檢測和小鼠大腦病理切片SA-β-Gal 染色分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與衰老組相比，EGCG 處理組SOD 活性明顯升高，達(dá)到115.24 ±11.06(圖2)。小鼠大腦病理切片進(jìn)行SA-β-Gal 染色分析檢測發(fā)現(xiàn):衰老組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞在一個視野下有20%～30%細(xì)胞膜被藍(lán)染，而年輕組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞只有5%左右被藍(lán)染，EGCG 處理組，在多個視野下，只能觀察有5%細(xì)胞膜周圍被藍(lán)染現(xiàn)象，與年輕組小鼠海馬區(qū)染色結(jié)果相似(圖3)。因此，EGCG處理后海馬區(qū)衰老細(xì)胞明顯減少。

表2 模型組與對照組小鼠的記憶力及外周血SOD 活性比較Table 2 Comparison of memory capability and SOD activity in mice serum between model group and control group

2.3 EGCG 對小鼠腦組織中NF-κB 信號途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 年輕組、衰老組及EGCG 組小鼠外周血SOD 活性分析Fig.2 The changes of SOD activity for young group，aging group and EGCG treatment group

圖3 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元病理切片的SA-β-Gal 染色分析(×400)Fig.3 SA-β-Gal staining of mice hippocampal neurons for young group，aging group and EGCG treatment group

小鼠腦組織NF-κB-P65 和IκBα(Y42)蛋白表達(dá)情況如圖4 所示。年輕組小鼠腦組織IκBα 蛋白表達(dá)較高，而NF-κB 蛋白表達(dá)較低，當(dāng)利用D-半乳糖誘導(dǎo)衰老后，IκBα 蛋白表達(dá)受到明顯抑制(P＜0.05);而NF-κB 蛋白表達(dá)被激活，與年輕組相比，NF-κB 表達(dá)升高了2.03 倍(P＜0.05)。1 mg/(kg·d)的EGCG 處理衰老模型組小鼠5 w 后，與衰老組相比，IκBα 蛋白表達(dá)呈上調(diào)趨勢，NF-κB 蛋白表達(dá)被抑制。所以，EGCG 能阻滯衰老所引起的NFκB 蛋白的激活。

圖5 小鼠腦組織NF-κB 和IκBα 蛋白表達(dá)分析Fig.5 Protein expression changes of IκB-α and NF-κB of mice brain tissue for young group，aging group and EGCG treatment group

3 討論

細(xì)胞衰老(cellular aging)是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，主要指正常細(xì)胞在不能分裂后所進(jìn)入的狀態(tài)。此時細(xì)胞仍然是存活的，但細(xì)胞的基因和蛋白的表達(dá)譜發(fā)生了很大改變，從而出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)酶活性改變等一系列現(xiàn)象。目前，關(guān)于人體衰老機(jī)制研究主要包括兩大學(xué)說，即氧化損傷學(xué)說和端粒學(xué)說。其中氧化損傷學(xué)說及作用機(jī)制已經(jīng)在不同研究中得到證明。過量氧自由基可以導(dǎo)致各種大分子如DNA，蛋白質(zhì)的氧化損傷，從而造成基因表達(dá)紊亂和蛋白質(zhì)的損傷，引起機(jī)體衰老［10］。D-半乳糖已被證明，在不同動物中均可以通過增加氧化強(qiáng)度，降低抗氧化酶的活性和線粒體的作用來加速衰老。所以，D-半乳糖被廣泛用于衰老模型的構(gòu)建。本實驗中，連續(xù)9 w 每天于小鼠頸部皮下注射約250 μg 的D-半乳糖，經(jīng)小鼠行為學(xué)檢測，外周血SOD 活性及腦組織海馬區(qū)SA-β-Gal 染色檢測發(fā)現(xiàn)D-半乳糖能顯著引起小鼠氧化損傷，從而成功建立小鼠衰老模型。

有研究表明，EGCG 處理人源性肝癌細(xì)胞系HCCLM6 后，能引起廣泛細(xì)胞凋亡的發(fā)生［11］。所以，EGCG 與炎癥發(fā)生和細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系。研究人員一直認(rèn)為，炎癥不只是衰老發(fā)生的一個旁觀者，其很可能加快了衰老的進(jìn)程，但具體分子機(jī)制報道較少。2013 年，美國一研究小組揭示:年輕小鼠下丘腦中NF-κB 幾乎不具有活性，隨著衰老的進(jìn)程，下丘腦中的NF-κB 被逐漸激活［8］。所以，下丘腦中的炎癥有可能是整個身體衰老的根源，其與NF-κB 激活程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 處理后，抑制了小鼠腦組織NF-κB 的表達(dá)，而IκBα 蛋白表達(dá)有上調(diào)趨勢。所以，EGCG 很可能通過阻礙NF-κB 的表達(dá)而延遲衰老進(jìn)程。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在細(xì)胞活動過程中是一個重要的調(diào)節(jié)因子，參與免疫反應(yīng)，細(xì)胞增殖，分化和凋亡等相關(guān)400 多個基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控［4，12］。NF-κB 的激活涉及IκB 的磷酸化，而后者有賴于IKK(IκB 激酶)的調(diào)控。在哺乳動物中，IκB 蛋白是NF-κB 主要抑制劑，主要包括IκBα、IκBβ 和IκBγ 三種因子［13］。所以，EGCG 可能通過刺激IκBα 的表達(dá)而抑制NF-κB 的活化，進(jìn)而延緩了衰老進(jìn)程。但此推論還需要通過磷酸化IκBα 蛋白表達(dá)以及細(xì)胞核內(nèi)磷酸化NF-κB-P65 的表達(dá)變化進(jìn)一步得到驗證。因此，本研究發(fā)現(xiàn)EGCG 具有明顯抗衰老作用，其機(jī)制可能通過抑制NF-κB 的表達(dá)而阻礙了細(xì)胞衰老的進(jìn)程。該研究結(jié)果為EGCG 相關(guān)的抗衰老保健品開發(fā)提供了一個新的方向。

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