丁平平，廖學(xué)品，張文華，石 碧*

1四川大學(xué)化工學(xué)院化工系;2 四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室;3 四川大學(xué)生物質(zhì)化學(xué)與工程系，成都 610065

黃酮苷是由糖或糖的衍生物(如氨基酸、糖醛糖等)與黃酮通過脫水縮合而成的化合物，是自然界中分布最廣泛的一類黃酮化合物，在眾多植物提取物中大量共存［1］。黃酮苷類化合物的分子結(jié)構(gòu)相似，具有基本相同的母體結(jié)構(gòu)，僅母體各位點(diǎn)取代基有所不同，這使其分離困難。目前大多采用柱層析法對(duì)黃酮苷類化合物進(jìn)行分離純化，但傳統(tǒng)的柱層析填料如聚酰胺、硅膠和葡聚糖等存在洗脫難和不易再生等缺陷。近年來，廣泛使用大孔吸附樹脂進(jìn)行這類天然產(chǎn)物的分離純化。

膠原纖維是一種天然高分子，來自家畜動(dòng)物的皮，原料易得，使用安全，生物相容性好，可生物降解性。它含有大量的活性基團(tuán)如肽鍵、-OH、-COOH、-NH2等［2］，能與多酚、黃酮類化合物上的酚羥基形成氫鍵。本課題組的前期研究表明，用膠原纖維制備的分離材料能選擇性除去植物提取物中的單寧，這是因?yàn)閱螌幐缓恿u基，能與膠原纖維以多點(diǎn)氫鍵結(jié)合，而其他化合物與膠原纖維形成的氫鍵作用力較弱［3］。膠原纖維分離材料也能有效分離黃酮苷和含吡啶環(huán)的生物堿混合物［4］，這也是因?yàn)榕c生物堿相比，黃酮苷與膠原纖維的氫鍵作用更強(qiáng)。研究還表明，膠原纖維能分離黃酮和黃酮苷的混合物，這是由于兩者的結(jié)構(gòu)差異較大，與膠原的氫鍵結(jié)合能力不同［5］。這些研究表明，膠原纖維分離材料主要基于對(duì)被分離物的氫鍵作用力差異而將其分離。被分離化合物所含可形成氫鍵的活性基團(tuán)的數(shù)目和位置，能極大的影響氫鍵作用力。黃酮苷類化合物中的糖基能與膠原纖維的活性基團(tuán)形成氫鍵，通過調(diào)控膠原纖維與黃酮苷類化合物之間的氫鍵作用強(qiáng)度，有可能將不同的黃酮苷類化合物分離開。

為了使研究結(jié)果具有代表性，本文選用分別含1 個(gè)、2 個(gè)和3 個(gè)糖基的黃酮苷(槲皮苷、蘆丁和刺槐素)作為黃酮苷類化合物的代表，研究了膠原纖維分離材料(GCF)對(duì)黃酮苷類混合物體系的分離特性。從衛(wèi)生和環(huán)保角度考慮，采用蒸餾水和乙醇作為洗脫劑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑:無水乙醇等試劑均為分析純。HPLC 分析用甲醇和甲酸為色譜純(Fisher Chemicals)，實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Millipore 超純水制備系統(tǒng)凈化。槲皮苷和蘆丁，購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司，含量均為98%以上;刺槐素，購自湖州恩貝希生物原料有限公司，含量95%以上。三種黃酮苷的分子結(jié)構(gòu)式見圖1。儀器:Alliance2996 高效液相色譜儀，美國Waters公司;Aichrom bond-AQ C18 反相色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);UV751GD 紫外可見分光光度計(jì)，美國PerkinElmer 公司;BSZ-100 型自動(dòng)收集器、HL-2型恒流泵，上海滬西分析儀器廠;層析柱(16 mm ×50 cm)，成都凌云玻璃廠。

1.2 膠原纖維分離材料的制備

圖1 槲皮苷(1)、蘆丁(2)和刺槐素(3)的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of quercitrin(1)，rutin (2)and robinin (3)

膠原纖維分離材料的制備按課題組建立的方法進(jìn)行［6］。其簡要步驟為:以牛皮為原料，按常規(guī)方法經(jīng)清洗、堿處理、片皮、脫堿、干燥、研磨等操作制得膠原纖維;取膠原纖維15 g，用300 mL 蒸餾水浸泡12 h，加入10 mL 50%的戊二醛，先于25 ℃下反應(yīng)1 h，然后于30 ℃下反應(yīng)4 h。過濾后用蒸餾水洗滌3 次，再用無水乙醇洗滌，過濾，于45 ℃下干燥12 h 得到膠原纖維分離材料(GCF)。

1.3 乙醇濃度對(duì)GCF 吸附刺槐素、槲皮苷和蘆丁的影響

由于三種黃酮苷化合物難溶于水，易溶于乙醇，因此采用乙醇濃度高于30%溶液進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。分別采用乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%(v/v)的乙醇-水溶液配制100.0 mL 刺槐素、槲皮苷和蘆丁混合溶液(溶液中各成分濃度均為30 mg/L)。取上述各溶液15.0 mL，加入0.15 g GCF，在298 K 下振蕩吸附12 h。用HPLC 檢測吸附前后溶液中各成分的濃度，用公式(1)計(jì)算吸附率E。

式中，E 為吸附率，C0為吸附前HPLC 峰面積，Ce為吸附后HPLC 峰面積。

1.4 柱分離

用無水乙醇配制刺槐素-蘆丁、槲皮苷-蘆丁、刺槐素-蘆丁-槲皮苷的混合溶液，混合溶液中各成分的濃度均為5 mg/mL。這些混合溶液為柱分離上樣液。

稱取10.0 g GCF，用無水乙醇浸泡12 h，以濕法裝柱的方式裝入直徑為16 mm 的層析柱內(nèi)，柱高為30 cm，柱體積為60 mL，空隙體積為14.7 mL。先用洗脫液預(yù)平衡色譜柱2 BV，然后分別取上述上樣液1 mL 進(jìn)行上樣(無需過濾)。上樣結(jié)束后在0.5 BV/h 的恒定流速下對(duì)色譜柱進(jìn)行分步洗脫。用自動(dòng)收集器定時(shí)收集流出液，并HPLC 檢測流出液中各成分的濃度。

1.5 GCF 的重復(fù)使用性

選用對(duì)刺槐素-蘆丁-槲皮苷的分離考察GCF 的重復(fù)使用性。上樣液的配制和柱分離方法同1.5，用自動(dòng)收集器定時(shí)收集流出液，用HPLC 測定合并洗脫段中槲皮苷、蘆丁和刺槐素的濃度，根據(jù)公式(2)和(3)計(jì)算純度P 和回收率R。

其中，mi 為單獨(dú)組分質(zhì)量(μg);m 為分離得到的組分總質(zhì)量(μg);

其中M 為槲皮苷(蘆丁或者刺槐素)上樣質(zhì)量(mg);m 為分離得到的槲皮苷(蘆丁或者刺槐素)的質(zhì)量(mg)。

每次分離結(jié)束后，分別用180 mL 90%(v/v)乙醇水溶液以0.25 BV/h 的恒定流速洗滌和平衡色譜柱，然后再重復(fù)進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇濃度對(duì)吸附的影響

圖2 為刺槐素、蘆丁和槲皮苷在不同濃度的乙醇水溶液中的靜態(tài)吸附率。當(dāng)乙醇濃度低于70%時(shí)，GCF 對(duì)三種黃酮苷的吸附率均低于30%;當(dāng)乙醇濃度高于80%時(shí)，吸附率均明顯增加。這表明，GCF 在高乙醇溶液中對(duì)三種黃酮苷具有較高的吸附選擇性。對(duì)圖2 綜合分析可以發(fā)現(xiàn)，蘆丁在50%～70%乙醇水溶液中吸附率都較低，因此可以該濃度范圍的乙醇水溶液作為蘆丁的洗脫液;而刺槐素在50%乙醇水溶液中吸附率最低，因此50%乙醇水溶液可作為其洗脫液。根據(jù)上述結(jié)果推測通過分步洗脫的方式(改變洗脫液中乙醇濃度)能夠在GCF上將三種物質(zhì)分離開。

圖2 三種黃酮苷化合物在不同濃度乙醇-水溶液中的吸附率Fig.2 Adsorption extents of three flavone glycosides on GCF in different aqueous ethanol solutions

2.2 吸附機(jī)理

已有的研究表明，膠原纖維和植物多酚主要通過分子間多點(diǎn)氫鍵和疏水鍵的協(xié)同作用而結(jié)合［6］。因此，氫鍵和疏水作用可能是GCF 吸附黃酮苷類化合物的主要機(jī)理。在水含量較高的溶液中，水分子作為良好的氫鍵受體和供體，能夠分別與GCF、黃酮苷類化合物形成氫鍵，這種競爭反應(yīng)導(dǎo)致GCF 與黃酮苷類化合物之間的氫鍵作用力減弱。因此，在乙醇濃度小于50%的溶液中，GCF 的脂肪側(cè)鏈與吸附質(zhì)疏水區(qū)之間的疏水作用是吸附質(zhì)在GCF 上吸附的主要驅(qū)動(dòng)力。由于黃酮苷類化合物的疏水性差別不大，因此在低濃度的乙醇水溶液中，GCF 對(duì)黃酮苷類化合物的吸附率均較低。

乙醇濃度大于70%時(shí)，GCF 與吸附質(zhì)之間的疏水作用受到抑制，而它們之間的氫鍵卻更容易形成。這是因?yàn)橐掖嫉臉O性小于水的極性，乙醇參與氫鍵競爭反應(yīng)的能力小于水。在純乙醇中，氫鍵是GCF與吸附質(zhì)之間的主要作用力，這時(shí)三種黃酮苷的吸附率都達(dá)到最大。如圖2 所示，GCF 對(duì)三種黃酮苷的吸附率大小順序?yàn)?刺槐素＞蘆?。鹃纹ぼ?。三種化合物的氫鍵活性位點(diǎn)主要是羥基，含3 個(gè)糖基的刺槐素有更多的氫鍵活性位點(diǎn)，因此GCF 對(duì)刺槐素的吸附率最大。蘆丁C-3 位上連接二糖(β-D-葡萄糖基-7-L-鼠李糖)，形成氫鍵的活性基團(tuán)多于槲皮苷，因而蘆丁的吸附率次之;槲皮苷C-3 位上連接的單糖，故而吸附率最低。以上結(jié)果表明，在高乙醇濃度溶液中，GCF 與吸附質(zhì)之間的主要作用力是氫鍵，GCF 對(duì)黃酮苷化合物具有較高的吸附選擇性。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析表明，在低濃度乙醇溶液中，疏水作用是GCF 與吸附質(zhì)(黃酮苷類化合物)之間的主要作用力;而在高濃度乙醇溶液和純乙醇中，氫鍵是其主要作用力。這與一些學(xué)者在研究蠶絲蛋白吸附黃酮類化合物、交聯(lián)瓊脂糖凝膠分離EGCG 及大孔樹脂吸附胺類化合物時(shí)的吸附機(jī)理一致［7，8］。

2.3 兩組分體系柱分離

根據(jù)三種黃酮苷化合物的結(jié)構(gòu)，把它們分成兩組合(槲皮苷-蘆丁和刺槐素-蘆丁)，每組中的兩個(gè)黃酮苷相差一個(gè)糖環(huán)，考察分離效果。根據(jù)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用90%～70%乙醇水溶液以梯度洗脫的方式對(duì)蘆丁-槲皮苷混合物進(jìn)行分離，用70%～50%乙醇水溶液以梯度洗脫方式對(duì)刺槐素-蘆丁混合物進(jìn)行分離。分離色譜曲線如圖3 和4 所示。

圖3 蘆丁-槲皮苷化合物在GCF 柱上的分離色譜圖Fig.3 Separation chromatograms of rutin-quercitrin mixture on GCF column

由圖3 可見，在蘆丁-槲皮苷分離中，槲皮苷在90%乙醇洗脫段被全部洗脫，而蘆丁在70%乙醇水溶液段被洗脫。這是由于采用90%乙醇作洗脫液時(shí)，GCF 與含羥基較少的槲皮苷之間的氫鍵作用較弱，而與含羥基較多的蘆丁之間的氫鍵作用強(qiáng)，因此蘆丁保留在GCF 柱上。隨著洗脫液中水的比例的增加，GCF 與蘆丁之間的氫鍵被破壞，使之被洗脫下來。

圖4 刺槐素-蘆丁化合物在GCF 柱上的分離色譜圖Fig.4 Separation chromatogram of robinin-rutin mixture on GCF column

在刺槐素-蘆丁混合物分離中，蘆丁在70%乙醇水洗脫段被全部洗脫，而刺槐素被保留在柱上。這表明刺槐素與GCF 的吸附作用更強(qiáng)，這與刺槐素含更多可形成氫鍵的-OH 是一致的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過改變洗脫液的組成，可以調(diào)節(jié)三種黃酮苷化合物在GCF 柱上的保留時(shí)間，通過分步洗脫的方式使它們在GCF 柱上得到分離。

為了進(jìn)一步研究三種黃酮苷化合物在GCF 柱上的分離特性，計(jì)算了色譜峰分離度這一重要參數(shù)。采用Gaussian 方程［9］對(duì)色譜曲線進(jìn)行擬合，從而獲得分離度。Gaussian 方程是較常用的擬合模型，該模型假設(shè)色譜流出曲線符合高斯分布函數(shù)，即是左右對(duì)稱的峰。

其中A 為峰面積;w 為半峰寬;xc 為峰中心值。

擬合參數(shù)如表1 所示。Gaussian 方程對(duì)兩組分體系色譜曲線的擬合相關(guān)系數(shù)都大于0.97，槲皮苷-蘆丁和刺槐素-蘆丁體系在GCF 柱上的色譜曲線符合Gaussian 分布，表明在GCF 柱上的色譜峰較對(duì)稱，沒有明顯的區(qū)帶擴(kuò)散現(xiàn)象，柱效較高。根據(jù)Gaussian 方程擬合得到的數(shù)據(jù)，按分離度公式(5)計(jì)算兩組分體系在GCF 柱上的分離度。

其中V1 和V2 分別為相鄰兩物質(zhì)各自的洗脫體積;W1 和W2 分別為兩個(gè)化合物對(duì)應(yīng)的色譜峰的半峰寬度。

槲皮苷-蘆丁和刺槐素-蘆丁體系在GCF 柱上的分離度如表1 所示。分離度是色譜柱總分離效能的衡量指標(biāo)，分離度越大，表明相鄰組分分離越好。當(dāng)分離度小于1 時(shí)，兩組分有部分重疊;當(dāng)分離度等于1 時(shí)，兩組分有較好的分離;當(dāng)分離度等于1.5 時(shí)，兩組分完全分開，也稱為基線分離［10］。槲皮苷和蘆丁在GCF 柱上的分離度為3.60，而蘆丁和刺槐素的分離度為2.47，表明GCF 柱能實(shí)現(xiàn)刺槐素-蘆丁和蘆丁-槲皮苷兩組份的完全分離，且具有較高的分離效能。

表1 兩組分黃酮苷混合物分離曲線的Gaussian 方程擬合參數(shù)Table 1 Gaussian fitting parameters for separation curve of two-component mixture of flavone glycosides

2.4 三組分柱分離

根據(jù)兩組分黃酮苷混合物的分離結(jié)果，考察了GCF 柱對(duì)刺槐素-蘆丁-槲皮苷構(gòu)成的三組分的分離效果，采用90%-70%-50%乙醇水溶液分步洗脫分離。由圖5(a)可見，在90%乙醇水溶液洗脫段，實(shí)現(xiàn)槲皮苷與蘆丁、刺槐素分離;采用70%乙醇水溶液可以將蘆丁洗脫，而刺槐素被保留在GCF 柱上;50%乙醇水可將刺槐素的洗脫。這表明三種黃酮苷類化合物能夠在不同的溶劑中被洗脫從而實(shí)現(xiàn)分離，這是因?yàn)樗鼈兣cGCF 之間形成氫鍵的能力存在差異。

當(dāng)用30%乙醇水溶液洗脫時(shí)，三種化合物幾乎同時(shí)從色譜柱上流出，沒有達(dá)到分離效果，如圖5(b)所示。該對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):在無水乙醇及高濃度乙醇溶液中，GCF 與吸附質(zhì)之間以氫鍵作用為主，在水中則以疏水作用為主。且基于氫鍵作用，GCF 能夠有效地分離含不同糖基數(shù)量黃酮苷類化合物，基于疏水作用則沒有分離效果。

圖5 刺槐素-蘆丁-槲皮苷混合物在GCF 柱上的分離色譜圖Fig.5 Separation chromatograms of robinin-rutin-quercetin mixture on GCF column

2.5 GCF 柱的重復(fù)使用性

分離材料的重復(fù)使用性對(duì)其實(shí)際應(yīng)用具有非常重要的意義，故對(duì)GCF 柱的重復(fù)使用性能進(jìn)行了研究。圖6 是GCF 柱第1 次和第5 次重復(fù)使用分離刺槐素-蘆丁-槲皮苷混合物的色譜圖?？梢钥闯?，第1 次和第5 次分離中，三組分體系的保留時(shí)間基本一致。在5 次重復(fù)分離中，三種黃酮苷化合物的回收率均大于75%，如表3 所示。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GCF 柱在黃酮苷類化合物分離中具有良好的重復(fù)使用性和穩(wěn)定性。

圖6 刺槐素-蘆丁-槲皮苷混合物在重復(fù)使用GCF 柱上的色譜圖Fig.6 Separation chromatograms of robinin-rutin-quercitrin mixture on regenerated GCF column

表3 重復(fù)使用GCF 分離三種黃酮苷化合物時(shí)產(chǎn)物的純度和回收率Table 3 Purity and recovery of flavone glycosides separated by regenerated GCF column

3 結(jié)論

戊二醛交聯(lián)膠原纖維分離材料對(duì)黃酮苷類化合物的吸附分離主要是基于氫鍵作用。含不同糖基數(shù)量的黃酮苷類化合物與膠原纖維之間的氫鍵作用力不同，因此可以用膠原纖維分離材料對(duì)它們的類混合物進(jìn)行分離純化。同時(shí)，膠原纖維分離材料用于黃酮苷類化合物分離時(shí)，表現(xiàn)出良好的可重復(fù)使用性，因此具有良好的實(shí)用價(jià)值。

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